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1、第十四章第十四章 免疫免疫(miny(miny)细胞的分离及其表面标志检测技术细胞的分离及其表面标志检测技术第一页，共三十二页。第二页，共三十二页。免疫细胞免疫细胞(xbo)(xbo)的分离的分离 外周血单个核细胞外周血单个核细胞(xbo)(xbo)分离分离 淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离 T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离 第三页，共三十二页。外周血单个核细胞外周血单个核细胞(xbo)(xbo)分离分离 外周血单个核细胞（外周血单个核细胞（peripheral mononuclear peripheral mononuclear cells,PMN
2、Ccells,PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞包括淋巴细胞和单核细胞（monocytemonocyte）。）。FicollFicoll分离液法主要分离液法主要(zhyo)(zhyo)用于分离外周血中的单个核用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。第四页，共三十二页。细胞细胞(xbo)分选和基本原理分选和基本原理不同细胞密度不同不同细胞密度不同不同细胞表面不同细胞表面(biomin)(biomin)生物学特性不同生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞表面分化抗原不同第五页，共三十二页。不同不同(b tn)细胞密度不同细胞
3、密度不同(b tn)人的红细胞密度人的红细胞密度(md)(md)为为1.093 粒细胞密度为粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为度为1.076-1.090 第六页，共三十二页。不同不同(b tn)(b tn)细胞密度不同细胞密度不同(b tn)(b tn)第七页，共三十二页。用用1.0770.0011.0770.001的分层液可将细胞的分层液可将细胞(xbo)(xbo)分离分离 第八页，共三十二页。密度梯度离心密度梯度离心(lxn)(lxn)(Ficoll)(Ficoll)离心离心(lxn)(lxn)第九页，共三十二页。淋巴细胞分
4、离淋巴细胞分离(fnl)（去单核细胞）（去单核细胞）贴壁粘附贴壁粘附(zhn f)(zhn f)法法 吸附柱过滤法吸附柱过滤法 磁铁吸引法磁铁吸引法 Percoll Percoll 分离液法分离液法 （连续密度梯度离心）（连续密度梯度离心）第十页，共三十二页。E E花环沉降花环沉降(chnjing)(chnjing)法法 尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法 T T细胞细胞(x(x bo)bo)和和B B细胞细胞(x(x bo)bo)的分离的分离T T细胞细胞(xbo)(xbo)亚群的分离亚群的分离 亲和板结合分离法亲和板结合分离法 磁性微球分离法磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分
5、离仪分离法 第十一页，共三十二页。细胞表面细胞表面(biomin)分化抗原（分化抗原（CD抗原）抗原）适用于适用于T T、B B细胞的分离细胞的分离(fnl)(fnl)已知已知CDCD抗原细胞亚群的分离抗原细胞亚群的分离未知未知CDCD抗原细胞亚群的分离抗原细胞亚群的分离（阴性分选）（阴性分选）第十二页，共三十二页。第十三页，共三十二页。磁珠大小可以磁珠大小可以(ky)选择选择第十四页，共三十二页。大小免疫磁珠分离大小免疫磁珠分离(fnl)细胞的特点比较细胞的特点比较 比较项目比较项目大磁珠大磁珠小磁珠小磁珠对细胞的影响对细胞的影响对对细细胞胞造造成成机机械械压压力力，影影响响其其生生物物学学
6、活活性性，不不利利于于分分离离后培养。后培养。对对细细胞胞温温和和，不不影影响响分分离离细细胞的后续培养。胞的后续培养。对流式细胞仪的影响对流式细胞仪的影响阻阻塞塞流流式式细细胞胞仪仪的的喷喷嘴嘴，影影响散射光。响散射光。可可直直接接上上流流式式细细胞胞仪仪检检测测，不影响散射光。不影响散射光。分离条件要求分离条件要求技技术术简简单单，分分离离可可在在试试管管中中完成。完成。需要很强的磁场来分离细胞。需要很强的磁场来分离细胞。收率收率得率高。得率高。得率不高。得率不高。纯度纯度纯度低。纯度低。纯度高。纯度高。分离时间分离时间分离速度快。分离速度快。分离速度慢。分离速度慢。分离成本分离成本成本低
7、。成本低。需需要要很很强强的的磁磁场场来来分分离离细细胞胞，需需要要一一次次性性的的分分离离柱柱，不不能能在普通试管进行。在普通试管进行。第十五页，共三十二页。第十六页，共三十二页。第十七页，共三十二页。免疫免疫(miny)磁珠法细胞分选过程磁珠法细胞分选过程第十八页，共三十二页。免免疫疫磁磁珠珠细细胞胞分分选选装装置置第十九页，共三十二页。全自动细胞全自动细胞(xbo)分选系统分选系统第二十页，共三十二页。荧光荧光(ynggung)激活细胞分离仪分离法激活细胞分离仪分离法 第二十一页，共三十二页。流式细胞分析仪流式细胞分析仪第二十二页，共三十二页。淋巴细胞标志淋巴细胞标志(biozh)(bi
8、ozh)及亚群分类及亚群分类 常用常用(chn yn)(chn yn)于鉴定和检测淋巴细胞于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇表面标志是簇分化抗原（分化抗原（Cluster Cluster of differentiationof differentiation，CDCD）。第二十三页，共三十二页。T T细胞表面细胞表面(biomin)(biomin)标志及其亚群标志及其亚群 CD3+CD4+CD8-CD3+CD4+CD8-辅助性辅助性T T细胞细胞(xbo)(xbo)（help T cell,Thhelp T cell,Th）CD3+CD4-CD8+CD3+CD4-CD8+细胞毒性细胞毒性T T
9、细胞（细胞（cytotoxic T cytotoxic T cell,Tc or CTLcell,Tc or CTL）CD4+CD25+CD4+CD25+调节性调节性T T细胞细胞 （regulatory T cell,Tr or Tregregulatory T cell,Tr or Treg）第二十四页，共三十二页。B B细胞表面细胞表面(biomin)(biomin)标志标志 SmIgSmIg、FcFc受体、补体受体、受体、补体受体、EBEB病毒受体，部分病毒受体，部分CDCD分分子子(fnz)(fnz)是是B B细胞的重要表面标志，其中以细胞的重要表面标志，其中以SmIgSmIg为为B
10、 B细胞所特有，是鉴定细胞所特有，是鉴定B B细胞可靠的指标。细胞可靠的指标。CD19/CD5CD19/CD5分子：可将分子：可将B B细胞区分为细胞区分为B1B1细胞和细胞和B2B2细细胞，胞，B1B1细胞为细胞为CD19CD19和和CD5CD5双阳性，而双阳性，而B2B2细胞仅为细胞仅为CD19CD19阳性，阳性，B2B2细胞为通常所指的细胞为通常所指的B B细胞。细胞。第二十五页，共三十二页。NKNK细胞细胞(xbo)(xbo)表面标志表面标志 人类人类NKNK细胞表面细胞表面(biomin)(biomin)标志主要以标志主要以CD16CD16、CD56CD56来认定，临床上将来认定，临
11、床上将CD3-CD3-CD56+CD16+CD56+CD16+淋巴细胞认定为淋巴细胞认定为NKNK细胞。细胞。第二十六页，共三十二页。T细胞细胞(xbo)及及NK细胞细胞(xbo)第二十七页，共三十二页。抗原抗原(kngyun)提呈类细胞提呈类细胞第二十八页，共三十二页。免疫细胞免疫细胞(xbo)表面标志的检测表面标志的检测抗体致敏细胞抗体致敏细胞(xbo)(xbo)花环法花环法 免疫细胞化学法免疫细胞化学法 免疫荧光法免疫荧光法 流式细胞分析法流式细胞分析法 第二十九页，共三十二页。淋巴细胞表面标志淋巴细胞表面标志(biozh)(biozh)检测的临床意义检测的临床意义 淋巴细胞表面标志检测
12、是评价免疫功能的重淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要要(zhngyo)(zhngyo)指标。指标。对对CD4+CD4+和和CD8+TCD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。测。第三十页，共三十二页。临床临床(ln chun)常见疾病中的常见疾病中的T 淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化 第三十一页，共三十二页。内容(nirng)总结第十四章。T细胞和B细胞的分离。不同细胞密度不同。不同细胞表面生物学特性不同。不同细胞表面分化抗原不同。密度梯度离心(Ficoll)离心。对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养。常用于鉴定(jindng)和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞。CD4+CD25+调节性T细胞。T细胞及NK细胞。淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标第三十二页，共三十二页。