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1、课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因CO(NHCO(NH2 2)脲酶脲酶+CO+CO2 2NHNH3 3+H+H2 2O O课题目的课题目的从土壤中分离出能够从土壤中分离出能够分解尿素的细菌分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样统计每克土壤样品中究竟含有多少这样 的细菌的细菌 1 1、实例：、实例：原因：因为热泉温度原因：因为热泉温度707
2、080800 0C C，淘汰了绝大多，淘汰了绝大多 数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。PCR,PCR,此项技术要求使用此项技术要求使用耐高温（耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件，筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长。同时抑制或阻止其他微生物生长。不加有机碳源不加有机碳源 不加氮源不加氮源2.2.选择培养基的制作方法选择培养基的制作方法自养微生物自养微生物酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌固氮微生物固氮微生物加入青霉素加入青霉素加高浓度食盐加高浓度
3、食盐金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只
4、有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理如如当当石石油油是是唯唯一一碳碳源源时时，可可抑抑制制不不能能利利用用石石油油的的微微生生物物的的生生长长，使使能能够够利利用用石石油油的的微微生生物物生生存存，从而分离出能消除石油从而
5、分离出能消除石油污污染的微生物。染的微生物。筛选能够分解石油的微生物？筛选能够分解石油的微生物？1 1.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2 2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是分别是()()A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实
6、践训练实践训练C CD D5 5、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是微生物的培养与观察微生物的培养与观察鉴定：鉴定：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细
7、菌能够升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素分解尿素。测定饮水中大测定饮水中大测定饮水中大测定饮水中大肠杆菌肠杆菌肠杆菌肠杆菌数量的方法是将一定体积的水数量的方法是将一定体积的水数量的方法是将一定体积的水数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝 培养培养培养培养基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出水样中大肠杆菌的数
8、量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 1 1、显微镜直接计数、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：缺点：缺点：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；2 2、稀释涂布平板法：活菌、稀释涂布平板法：活菌2.2.稀释涂布平板法稀释涂布平板法原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释
9、度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单细胞细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表原先的一个单细胞。一个单细胞。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M缺点：统计的菌落往往比活菌的实际数目低。缺点：统计的菌落往往比活菌的实际数目低。二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取
10、土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行火焰旁进行 三三 样品的稀释样品的稀释.取样涂布取样涂布实验时要对实验时要对培养皿作好标记培养皿作好标记。注明培。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。等。.取样涂布取样涂布分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度稀释倍数稀释倍数目的目的细菌细菌101
11、04 4、10105 5、10106 6保证获得菌落保证获得菌落数在数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板放线菌放线菌10103 3、10104 4、10105 5真菌真菌10102 2、10103 3、10104 4原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。目。培养不同微生物往往
12、需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上个以上菌落数目在菌落数目在3030300300的平板，则说明稀释操作比较成功，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确精确，需要重新实验。，需要重新实验。注意事项注意事项为了保证结
13、果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加为使结果接近真实值可将同一稀释度加到到三个或三个以上三个或三个以上的平皿中，经涂布，培的平皿中，经涂布，培养计算出菌落养计算出菌落平均数平均数。统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的实际数目低实际数目低。设置对照的主要目的是排除实验组中设置对照的主要目的是排除实验组中非测试非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。信度。.设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌实例：在做分解尿素
14、的细菌的筛选与统计菌 落数目的实验时，落数目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6 倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌个菌 落，但是其他同学在同样的稀释度下落，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同，土样不同，培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误 (或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质)小结：小结：通过这个事例可以看出，实验结果通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一
15、：由其他同学用与由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 4.4.下列说法不正确的是（下
16、列说法不正确的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C练一练练一练用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（）A.比实际值高B.比实际值低C.和实际值一致D.比实际值可能高也可能低本课题知识小结本课题知识小结: