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1、荧光分光光度法与检测技术1现在学习的是第1页，共43页学习目的学习目的u通过学习荧光分析法的基本原理，产生荧光的条件以及荧光光谱特征和用途，加深对荧光分析的依据、条件和应用的理解，并能选择荧光物质的激发波长和荧光波长进行分析。为学习药物分析、天然药物化学等专业课程奠定基础。2现在学习的是第2页，共43页知识要求知识要求u熟悉掌握荧光和磷光产生的原理和特点及区别；激发光谱与荧光光谱的概念及用途；溶液荧光光谱的特征；产生荧光的条件；荧光定量分析的依据、条件和方法。了解。u了解影响荧光强度的因素，荧光分析仪器及其与紫外-可见分光光度计的区别，荧光分析新技术在分析中的应用。3现在学习的是第3页，共43
2、页能力要求能力要求u掌掌握握荧荧光光分分光光光光度度计计的的基基本本结结构构及及仪仪器器的的基基本本操操作作方方法法，学学会会使使用用荧荧光光分分光光光光度度计计对对药药物物进进行行分分析析的的操操作作技术。技术。4现在学习的是第4页，共43页第一节 荧光分光光度法的基本原理 u某某些些物物质质吸吸收收紫紫外外-可可见见光光后后，可可以以发发射射其其波波长长比比吸吸收收光光更更长长的的光光，并并且且随随照照射射光光的的消消失失而而消消失失，这这种种发发射射光称为荧光（光称为荧光（fluorescence）。）。u荧荧光光分分析析法法（fluorometry）是是利利用用某某些些物物质质发发射射
3、荧荧光光的的特特性性进进行行定定性性、定定量量分分析析的的光光学学分分析析方方法法，又又称称荧荧光光谱法光光谱法5现在学习的是第5页，共43页第一节 基本原理一、荧光的产生过程一、荧光的产生过程（一）单重态与三重态（一）单重态与三重态A 单重基态单重基态 B 激发单重态激发单重态 C 激发三重态激发三重态6现在学习的是第6页，共43页第一节 基本原理（二）荧光的产生（二）荧光的产生 电电子子由由激激发发单单重重态态基基态态单单重重态态的的跃跃迁迁7现在学习的是第7页，共43页第一节 基本原理（二）磷光的产生（二）磷光的产生 电子由激发三重态电子由激发三重态基态单重态的跃迁基态单重态的跃迁课堂互
4、动课堂互动您能比较荧光和磷光的主要区别吗？您能比较荧光和磷光的主要区别吗？8现在学习的是第8页，共43页第一节 基本原理二、二、激发光谱和荧光光谱（发射光谱）激发光谱和荧光光谱（发射光谱）9现在学习的是第9页，共43页第一节 基本原理 任何荧光物质都具有两个特征光谱：任何荧光物质都具有两个特征光谱：激发光谱和荧光光谱（发射光谱）激发光谱和荧光光谱（发射光谱）激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光波长而激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光波长而变化的关系曲线（以激发光波长变化的关系曲线（以激发光波长ex为横坐标，荧光的发为横坐标，荧光的发光强度光强度F为纵坐标的光谱）。为纵坐标的光
5、谱）。10现在学习的是第10页，共43页第一节 基本原理荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让物质物质所产生的所产生的荧光通过发射分光系统荧光通过发射分光系统(II)分光，测定每一发射波长荧分光，测定每一发射波长荧光强度光强度F，以发射光波长，以发射光波长em为横坐标，荧光的发光强度为横坐标，荧光的发光强度F为纵坐标作图所得的关系曲线。为纵坐标作图所得的关系曲线。11现在学习的是第11页，共43页第一节 基本原理 溶液荧光光谱具有如下溶液荧光光谱具有如下特征：特征：斯托克斯位移斯托克斯位移荧光光谱的形状与激荧光光谱的形状与激发波长无关发波长无关荧光光谱
6、与激发光谱的荧光光谱与激发光谱的镜像关系镜像关系蒽的激发光谱（虚）和荧光光谱（实）蒽的激发光谱（虚）和荧光光谱（实）12现在学习的是第12页，共43页第一节 基本原理三、荧光与分子结构三、荧光与分子结构 （一）荧光物质的特征（一）荧光物质的特征具有强的可见具有强的可见-紫外吸收，即具有紫外吸收，即具有K带强吸收带强吸收具有高的荧光效率具有高的荧光效率荧光效率荧光效率13现在学习的是第13页，共43页第一节 基本原理（二）分子结构与荧光的关系二）分子结构与荧光的关系大的共轭大的共轭键结构键结构ex（激发）em（激发）F苯2052780.11萘2863210.29蒽3654000.46四苯3904
7、800.6014现在学习的是第14页，共43页第一节 基本原理分子的刚性和共平面性分子的刚性和共平面性取代基的影响取代基的影响联苯联苯F=0.18芴芴F=1.0 15现在学习的是第15页，共43页第一节 基本原理（三）影响荧光强度的外界因素（三）影响荧光强度的外界因素温度温度溶剂溶剂溶液酸碱性溶液酸碱性荧光熄灭剂荧光熄灭剂散射光散射光激发光源激发光源16现在学习的是第16页，共43页第一节 基本原理 （四）荧光分光光度计（四）荧光分光光度计荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光谱
8、的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。从各个角度反映了分子的成键和结构情况。17现在学习的是第17页，共43页第一节 基本原理（一）仪器类型（一）仪器类型滤光片荧光计滤光片荧光计滤光片滤光片-单色器荧光计单色器荧光计荧光分光光度计荧光分光光度计18现在学习的是第18页，共43页第一节 基本原理（二）荧光分光光度计的基本结构（二）荧光分光光度计的基本结构1.光源光源 2.4.7.9.狭缝狭缝3.激发单色器激发单色器 5.样品池样品池6.表面吸光物质
9、表面吸光物质8.发射单色器发射单色器10.检测器检测器 11.放大器放大器 12.指示器指示器 13.记录器记录器19现在学习的是第19页，共43页第一节 基本原理光源光源 目前最常用的是氙灯目前最常用的是氙灯单色器（分光系统）单色器（分光系统）激发单色器激发单色器 发射单色器发射单色器样品池样品池 测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英检测器检测器 光电倍增管光电倍增管20现在学习的是第20页，共43页第一节 基本原理（三）仪器校准（三）仪器校准灵敏度校准灵敏度校准波长校准波长校准激发光谱和发射光谱校准激发光谱和发射光谱校准21现在学习的是第21页，
10、共43页课堂互动课堂互动请请您您比比较较荧荧光光分分光光光光度度计计与与紫紫外外-可可见见分分光光光光度度计的主要区别计的主要区别 第一节 基本原理22现在学习的是第22页，共43页点滴积累点滴积累荧荧光光和和磷磷光光在在实实验验现现象象上上的的区区别别：激激发发光光停停止止照照射射时时，荧荧光光随之消失而磷光则将延续一段时间。随之消失而磷光则将延续一段时间。最最强强荧荧光光波波长长em和和最最强强激激发发波波长长ex是是物物质质的的定定性性依依据据，也是定量测定时的最适宜波长。也是定量测定时的最适宜波长。强强荧荧光光物物质质的的分分子子结结构构体体征征：一一、具具有有长长共共轭轭结结构构，如
11、芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。第一节 基本原理23现在学习的是第23页，共43页第二节 荧光定量分析第二节第二节 荧光定量分析荧光定量分析由由于于荧荧光光物物质质的的结结构构不不同同，其其吸吸收收光光的的波波长长不不同同，发发射射出出荧荧光光的的波波长长也也不不同同，这这就就是是荧荧光光分分光光光光度度法法对对能能产产生生荧荧光光的的物物质质进进行行定定性性分分析析的的依依据据。实实验验证证明明，在在稀稀溶溶液液中中，荧荧光光强强度度与与荧荧光光物物质质的的
12、浓浓度度成成正正比比，这这是是荧荧光光分分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。24现在学习的是第24页，共43页第二节 荧光定量分析一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系 当当溶溶液液中中荧荧光光物物质质的的浓浓度度为为c，液液层层厚厚度度为为（吸吸收收池池内内径径）L时时，由由于于荧荧光光强强度度F正正比比于于被被荧荧光光物物质质吸吸收收光光的的强度：强度：F（I0 I），用线性方程表示为），用线性方程表示为：F=K（I0 I）25现在学习的是第25页，共43页第二节 荧光定量分析 K为常数，称荧光比率，其大小取决于一定条件下的荧为常
13、数，称荧光比率，其大小取决于一定条件下的荧光效率，结合比尔定律可得到下式：光效率，结合比尔定律可得到下式：F=2.303FI0cL 入入射射光光强强度度I0在在波波长长一一定定，光光源源稳稳定定时时为为固固定定值值，因因此可以将此可以将2.303FI0L视为常数视为常数K，故：，故：F=Kc26现在学习的是第26页，共43页第二节 荧光定量分析 当其他条件也一定时，荧光物质在稀溶液中的荧光强当其他条件也一定时，荧光物质在稀溶液中的荧光强度与浓度呈线性关系，这是荧光定量分析的依据。度与浓度呈线性关系，这是荧光定量分析的依据。但只有当荧光物质的浓度很小时，但只有当荧光物质的浓度很小时，即即cL 0
14、.05，这种关系才成立。，这种关系才成立。27现在学习的是第27页，共43页课堂互动课堂互动请请您您分分析析为为什什么么荧荧光光分分光光光光度度法法的的灵灵敏敏度度比紫外比紫外-可见分光光度法要高？可见分光光度法要高？第二节 荧光定量分析28现在学习的是第28页，共43页第二节 荧光定量分析二、定量分析方法二、定量分析方法标准曲线法标准曲线法 配制一系列浓度为配制一系列浓度为c1、c2、c3对照品溶液，分别对照品溶液，分别测其测其F1、F2、F3值，用值，用Fc作图绘制标准曲线。作图绘制标准曲线。然后在同样条件下测定试样溶液的然后在同样条件下测定试样溶液的Fx，在标准曲线上，在标准曲线上查找对
15、应的浓度查找对应的浓度cx。29现在学习的是第29页，共43页第二节 荧光定量分析比例法比例法 若荧光分析标准曲线过原点，则可选择其线性范围用比若荧光分析标准曲线过原点，则可选择其线性范围用比例法测定。即配制一对照品溶液（例法测定。即配制一对照品溶液（cs）测其荧光强度（）测其荧光强度（Fs），），再测定试样溶液（再测定试样溶液（cx）的荧光强度（）的荧光强度（Fx），然后进行比较。），然后进行比较。测定时同样要以空白（测定时同样要以空白（F0）校正：）校正：30现在学习的是第30页，共43页第二节 荧光定量分析多组分混合物测定多组分混合物测定 与吸光度一样，荧光强度也有加和性，因此混合物不需
16、经过与吸光度一样，荧光强度也有加和性，因此混合物不需经过分离，可用解联立方程的方法测定。可选择两物质不同的分离，可用解联立方程的方法测定。可选择两物质不同的激发波长处的荧光强度测定，也可选择不同荧光波长处的激发波长处的荧光强度测定，也可选择不同荧光波长处的荧光强度测定，这样选择范围比紫外荧光强度测定，这样选择范围比紫外-可见分光光度法广可见分光光度法广泛。泛。31现在学习的是第31页，共43页点滴积累点滴积累当当其其他他条条件件（即即F、I0、L）一一定定时时，荧荧光光物物质质在在稀稀溶溶液液中中的荧光强度的荧光强度F与浓度与浓度c成正比。成正比。荧光分析的定量方法与紫外荧光分析的定量方法与紫
17、外-可见分光光度法基本相同可见分光光度法基本相同。第二节 荧光定量分析32现在学习的是第32页，共43页第三节应用与发展一、荧光分析的应用一、荧光分析的应用 （一）有机化合物的荧光分析（一）有机化合物的荧光分析芳芳香香族族及及具具有有芳芳香香结结构构的的化化合合物物，因因存存在在共共轭轭体体系系在在紫紫外外光光照照射射下下很很多多能能发发射射荧荧光光。为为提提高高测测定定灵灵敏敏度度和和选选择择性性，可可使使弱弱荧荧光光物物质质与与某某些些荧荧光光试试剂剂作作用用，以以得得到到强强荧荧光光性性产产物物。因因此此，荧荧光光分分析析法法在在有有机机物物测测定定方方面面的的应应用用很广。很广。第三节
18、应用与发展第三节应用与发展33现在学习的是第33页，共43页第三节应用与发展（二）无机化合物的荧光分析（二）无机化合物的荧光分析直接荧光法直接荧光法荧光猝灭法荧光猝灭法催化荧光法催化荧光法34现在学习的是第34页，共43页第三节应用与发展二、荧光分析新技术二、荧光分析新技术激光荧光分析激光荧光分析时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析同步荧光分析同步荧光分析胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光分析三维荧光光谱分析三维荧光光谱分析原油试样在环乙烷中的等角原油试样在环乙烷中的等角三维投影光谱图三维投影光谱图35现在学习的是第35页，共43页第八章 荧光分析法检测技术与应用一、选择题(一)单项选择题1.荧光光谱属
19、于（）。A、吸收光谱 B、发射光谱 C、红外光谱 D、质谱2.分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是（）。A、能发射荧光的物质比较少 B、分子荧光光谱为线状光谱，而分子吸收光谱为带状光谱C、荧光波长比相应的吸收波长稍长D、荧光光度计有两个单色器，可以更好地消除组分间的相互干扰目标检测36现在学习的是第36页，共43页37第八章 荧光分析法检测技术与应用3.荧光量子效率是指（）。A、荧光强度与吸收光强度之比 B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比 D、激发态的分子数与基态的分子数之比4.一种物质能否发出荧光主要取决于（）。A、分子结构 B
20、、激发光的波长 C、温度 D、溶剂的极性现在学习的是第37页，共43页第八章 荧光分析法检测技术与应用5.下列叙述中，错误的是（）。A、荧光分析的待测物应含有大键 B、紫外分光光度法待测物应含有键C、质谱法待测物应含离子 D、气象色谱分析物的沸点应较低6.下列因素会导致荧光效率下降的有（）。A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子38现在学习的是第38页，共43页39第八章 荧光分析法检测技术与应用7.荧光波长与相应激发光波长相比（）。A、前者较长 B、后者较长 C、两者相等 D、关系不确定8.荧光光谱分析的主要优点是（）。A、准确度高 B、操作简便 C、仪器
21、简单 D、灵敏度高9.荧光分光光度计与分光光度计的主要区别在于（）。A、光源 B、单色器 C、光路 D、检测器现在学习的是第39页，共43页第八章 荧光分析法检测技术与应用（二）多项选择题1.下列关于分子荧光分析特点的叙述正确的是（）。A、检测灵敏度高 B、用量大，分析时间长 C、用量少，操作简便 D、选择性强 E、应用广泛2.分子中有利于提高荧光效率的结构特征是（）。A、双键数目较多 B、共轭双键数目较多 C、含重金属原子 D、分子为平面刚性 E、苯环上有给电子基团40现在学习的是第40页，共43页41第八章 荧光分析法检测技术与应用3.下列跃迁方式属于无辐射跃迁的有（）。A、振动弛豫 B、
22、内转换 C、体系间跨越 D、荧光发射 E、磷光发射4.分子荧光法与紫外-可见分光光法的主要区别为（）。A、分析方法不同 B、仪器结构不同 C、灵敏度不同 D、光谱带个数不同 E、光源不同现在学习的是第41页，共43页第八章 荧光分析法检测技术与应用二、填空题1.激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为 ；荧光波长固定后，荧光强度与激发光波长的关系曲线称为 。2.荧光分光光度计的主要部件有 、四大部件组成。3.荧光分析法进行定量分析的依据是 。三、简答题1何谓荧光效率？具有哪些分子结构的物质有较高的荧光效率？2哪些因素会影响荧光波长和强度？3请设计两种方法测定溶液Al3+的含量。（一种化学分析方法，一种仪器分析方法）42现在学习的是第42页，共43页43第八章 荧光分析法检测技术与应用二、填空题1.激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为 ；荧光波长固定后，荧光强度与激发光波长的关系曲线称为 。2.荧光分光光度计的主要部件有 、等四大部件组成。3.荧光分析法进行定量分析的依据是 。现在学习的是第43页，共43页