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1、蛋白质分子基础蛋白质制备现在学习的是第1页，共52页蛋白质的电泳现在学习的是第2页，共52页蛋白质的电泳分离蛋白质的电泳分离电泳分离的原理电泳分离的原理:蛋白质是蛋白质是两性电解质两性电解质,在一定的在一定的pH下下,可以解离为带电荷可以解离为带电荷的离子。在电场中可以电泳移动。的离子。在电场中可以电泳移动。电泳迁移率：带电颗粒在溶液中迁移速度的电泳迁移率：带电颗粒在溶液中迁移速度的快慢，用电泳迁移率快慢，用电泳迁移率(M)表示：表示：M为迁移率；为迁移率；dL为颗粒移动的距离；为颗粒移动的距离；L为通电的时间。为通电的时间。E为两个电极之间的电势差。为两个电极之间的电势差。M=EtdL现在学
2、习的是第3页，共52页现在学习的是第4页，共52页影响蛋白质电泳迁移率的因素影响蛋白质电泳迁移率的因素蛋白质分子的性质。蛋白质分子的性质。分子的电荷、大小和形状分子的电荷、大小和形状。电场电场 与电流和电压成正比。与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度缓冲液和离子强度 缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。的泳动速度会减缓。支持介质支持介质 纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。现在学习的是第5页，共52页现在学习的是第6页，共52页影响蛋白质电泳迁移率的因素影响蛋白质电泳迁移率的因素蛋
3、白质分子的性质。蛋白质分子的性质。分子的电荷、大小和形状。分子的电荷、大小和形状。电场电场 与电流和电压成正比。与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度缓冲液和离子强度 缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。泳动速度会减缓。支持介质支持介质 纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。现在学习的是第7页，共52页现在学习的是第8页，共52页影响蛋白质电泳迁移率的因素影响蛋白质电泳迁移率的因素蛋白质分子的性质。蛋白质分子的性质。分子的电荷、大小和形状。分子的电荷、大小和形状。电场电场 与电流和电
4、压成正比。与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度缓冲液和离子强度 缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。的泳动速度会减缓。支持介质支持介质 纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。现在学习的是第9页，共52页缓冲液和离子强度缓冲液和离子强度 缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。样品的泳动速度会减缓。离子强度增强，缓冲液所载的分电流随之增加，样品所载分电流降低，样品电泳速度变慢离子强度太低，电导率太小，样品移动缓慢现在学习的是第1
5、0页，共52页影响蛋白质电泳迁移率的因素影响蛋白质电泳迁移率的因素蛋白质分子的性质。蛋白质分子的性质。分子的电荷、大小和形状。分子的电荷、大小和形状。电场电场 与电流和电压成正比。与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度缓冲液和离子强度 缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。品的泳动速度会减缓。支持介质支持介质 纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。现在学习的是第11页，共52页电泳的类型自由界面电泳自由界面电泳使用支持物的区带电泳。使用支持物的区带电泳。区区带带电电泳泳是是在在半半固固相相
6、或或胶胶状状介介质质上上加加一一个个点点或或一一薄薄层层样样品品溶溶液液，然然后后加加电电场场，分分子子在在支支持持介介质质上上或或支支持持介介质质中中迁迁移移。支支持持介介质质的的作作用用主主要要是是为为了了防防止止机机械械干干扰扰和和由由于于温温度度变变化化以以及及大大分分子子溶溶液液的的高密度而产生的对流。高密度而产生的对流。区区带带电电泳泳使使用用不不同同的的支支持持介介质质，早早期期有有滤滤纸纸、玻玻璃璃珠珠、淀淀粉粉粒粒、纤纤维维素素粉粉、海海砂砂、海海绵绵、聚聚氯氯乙乙烯烯树树脂脂；以以后后有有淀淀粉粉凝凝胶胶、琼琼脂脂凝凝胶胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（醋酸纤维素膜，
7、现在则多用聚丙烯酰胺（PAGEPAGE）和琼脂糖凝胶。）和琼脂糖凝胶。现在学习的是第12页，共52页聚丙烯凝胶电泳聚丙烯凝胶电泳SDS-PAGE凝胶等电聚焦凝胶等电聚焦现在学习的是第13页，共52页SDS-PAGE电泳电泳在蛋白质中加入摩尔比为在蛋白质中加入摩尔比为1.4：1(SDS:蛋白质蛋白质)的的SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)。使所有蛋白质都。使所有蛋白质都带上负电。带上负电。SDS是阴离子去污剂，能与蛋白质的疏水部分结合，是阴离子去污剂，能与蛋白质的疏水部分结合，并且把大部分蛋白质拆成组成他的并且把大部分蛋白质拆成组成他的亚基形式。亚基形式。在上样缓冲液中加入巯基乙醇，可以使二
8、硫键还原为在上样缓冲液中加入巯基乙醇，可以使二硫键还原为巯基。使不同的蛋白质分子的短轴一致，长轴与蛋白巯基。使不同的蛋白质分子的短轴一致，长轴与蛋白质的分子量成正比。质的分子量成正比。SDS-PAG中，蛋白质电泳的速度不再取决于蛋白中，蛋白质电泳的速度不再取决于蛋白质的电荷与形状，质的电荷与形状，只与蛋白质的分子量有关只与蛋白质的分子量有关。现在学习的是第14页，共52页现在学习的是第15页，共52页现在学习的是第16页，共52页SDS-PAGE电泳电泳当当分分子子量量在在15KD15KD到到200KD200KD之之间间时时，蛋蛋白白质质的的迁迁移移率率和和分分子子量量的的对对数数呈呈线线性性
9、关关系系，符合下式：符合下式：logM=K-bXlogM=K-bX MM为为分分子子量量，X X为为迁迁移移率率，k k、b b均均为为常常数数，若若将将已已知知分分子子量量的的标标准准蛋蛋白白质质的的迁迁移移率率对对分分子子量量对对数数作作图图，可可获获得得一一条条标标准准曲曲线线，未未知知蛋蛋白白质质在在相相同同条条件件下下进进行行电电泳泳，根根据据它它的的电电泳泳迁迁移移率率即即可可在在标标准曲线上求得分子量。准曲线上求得分子量。现在学习的是第17页，共52页SDS-PAGE电泳电泳绘制标准曲线：绘制标准曲线：按下式计算相对迁移率：按下式计算相对迁移率：以每个蛋白标准的分子量对数对它的相
10、对迁移率作图得标准曲线，量以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。现在学习的是第18页，共52页SDS-PAGE电泳电泳PAGEPAGE根根据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应，分分为为连连续续系系统统和和不不连连续系统续系统两大类两大类连连续续系系统统中中,缓缓冲冲液液pHpH值值及及凝凝胶胶浓浓度度相相同同，带带电电颗颗粒粒在在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。电场作用下，主要靠
11、电荷和分子筛效应。不不连连续续系系统统中中,由由于于缓缓冲冲液液离离子子成成分分，pHpH，凝凝胶胶浓浓度度及及电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性，带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中泳泳动动不不仅仅有有电电荷荷效效应应，分分子子筛筛效效应应，还还具具有有浓浓缩缩效效应应，因因而而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。现在学习的是第19页，共52页不连续不连续SDS-PAGE各部分凝胶配制各部分凝胶配制电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在在10mA，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为20m
12、A，溴酚蓝距凝胶边缘约，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。时，停止电泳。现在学习的是第20页，共52页现在学习的是第21页，共52页现在学习的是第22页，共52页现在学习的是第23页，共52页Figure 6.2.4 SDS-PAGE results of fraction S1(SRA)兔磷酸化酶兔磷酸化酶兔磷酸化酶兔磷酸化酶B B MW=97,400 MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200MW=66,200兔肌动蛋白兔肌动蛋白兔肌动蛋白兔肌动蛋白 MW=43,000MW=43,000牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,
13、000MW=31,000胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100MW=20,100鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400MW=14,400现在学习的是第24页，共52页SDS-PAGE应注意的几个问题应注意的几个问题制备凝胶时，制备凝胶时，TEMED要加胶之前再加。要加胶之前再加。电泳之前蛋白质要溶解在含电泳之前蛋白质要溶解在含1%的的SDS和和1%的巯基乙的巯基乙醇的磷酸缓冲液醇的磷酸缓冲液(0.01 mol/L,pH 7.2),1000C加热加热25分钟。分钟。如凝胶中含有杂质，可以在加入样品前先预电泳如凝胶中含有杂质，可以
14、在加入样品前先预电泳0.51小时。小时。SDS与蛋白质分子结合后，蛋白质分子的构象发生变化，与蛋白质分子结合后，蛋白质分子的构象发生变化，解离为亚单位，解离为亚单位，电泳结果显示的只是亚单位的大小，同电泳结果显示的只是亚单位的大小，同时蛋白质也会失去原来的活性。时蛋白质也会失去原来的活性。已发现有些蛋白质不能用已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGESDS-PAGE测定分子量。如电测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些（某些糖蛋白糖蛋白）以及一些）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等结构蛋白，如胶原蛋白等。现在学习的是第25页
15、，共52页等电聚焦电泳等电聚焦电泳 蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。在电场。在电场存在下的一定存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，时，蛋白分子在电场中不再移动，此时的蛋白分子在电场中不再移动，此时的pH值即为该蛋白值即为该蛋白质的等电点。质的等电点。等电聚焦等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从）电泳就是在凝胶中加入两性电解
16、质从而构成而构成从正极到负极从正极到负极pH逐渐增加的逐渐增加的pH梯度梯度，处在其中，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以值，便可以得到它的等电点。得到它的等电点。现在学习的是第26页，共52页等电聚焦电泳等电聚焦电泳根据要分离的蛋白质的根据要分离的蛋白质的pI的不同，订购不同的不同，订购不同pH梯度梯度的凝胶，可以对蛋白质样品进行分离。的凝胶，可以对蛋白质样品进行分离。如如3.59.5、2.56.0、5.08.5、7.510等。等。凝胶的
17、凝胶的pH值范围越窄，分辨力越高。可分离等电点值范围越窄，分辨力越高。可分离等电点相差相差0.01个个pH单位的蛋白质，最高可以分辨单位的蛋白质，最高可以分辨0.0025个个pH单位的蛋白质。单位的蛋白质。等电凝胶可以抵消扩散作用，蛋白质可以富集在很等电凝胶可以抵消扩散作用，蛋白质可以富集在很窄的区带上。窄的区带上。适用于少量蛋白质样品的分析鉴定，不适用于大量制适用于少量蛋白质样品的分析鉴定，不适用于大量制备。备。要求用无盐的溶液，而蛋白质在无盐溶液中容易沉淀；要求用无盐的溶液，而蛋白质在无盐溶液中容易沉淀；在等电点发生沉淀和变性的蛋白质也不适合用次方法在等电点发生沉淀和变性的蛋白质也不适合用
18、次方法分离。分离。现在学习的是第27页，共52页现在学习的是第28页，共52页现在学习的是第29页，共52页pI的测定的测定可以用染色法观察蛋白质，然后用表面电可以用染色法观察蛋白质，然后用表面电极直接测量极直接测量pH值。值。或将凝胶切成小块，加蒸馏水，再捣碎凝或将凝胶切成小块，加蒸馏水，再捣碎凝胶块并且测量胶块并且测量pH。现在学习的是第30页，共52页双向电泳双双向向电电泳泳:由由第第一一向向等等电电聚聚焦焦(IEF)电电泳泳和和第第二二向向SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳(SDS-PAGE)组组成成，第第一一向向使使等等电电点点不不同同的的蛋蛋白白得得到到分分离离，第第二二
19、向向使使分分子子量量不不同同的的蛋蛋白白得得到到分分离离，两两向向结结合合便便得得到到高高分分辨辨率率的的蛋白图谱。蛋白图谱。19751975年年，O OFarrellFarrell首首先先运运用用双双向向电电泳泳技技术术将将大大肠肠杆杆菌菌总总蛋蛋白白分分离离出出11001100多多个个蛋蛋白白点点。后后来来此此技技术术一一直直用用于于原原核核生生物物和和真真核核生生物物总总蛋蛋白白的的分分离离。目目前前，随随着着蛋蛋白白质质组组学学的的发发展展，双双向向电电泳泳技技术术越越来来越越广广泛泛的的用用于发现未知蛋白。于发现未知蛋白。现在学习的是第31页，共52页现在学习的是第32页，共52页现
20、在学习的是第33页，共52页PAGE电泳分离的大分子的检测电泳分离的大分子的检测考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法 可检出可检出0.31ug的蛋白质的蛋白质。银染色法银染色法 银离子与蛋白质以盐或配价络盐的形式结合，用甲醛将银离子银离子与蛋白质以盐或配价络盐的形式结合，用甲醛将银离子还原为可见的银颗粒。可检测还原为可见的银颗粒。可检测ng水平水平的蛋白质。的蛋白质。荧光染色技术荧光染色技术 荧光合成物质与荧光合成物质与PAGE上的蛋白质发生反应，发出强烈的荧光，上的蛋白质发生反应，发出强烈的荧光，可检测到可检测到PAGE中的蛋白质。中的蛋白质。现在学习的是第34页，共52页免疫印迹法免疫印迹法蛋
21、白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。表达产物，可通过融合部分的抗体检测。采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针探针”是抗体，是抗体，“显色显色”用标记的二抗。用标记的二抗。具体操作为经过具体操作为经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价
22、键形式吸附蛋白质。以固相载体上的蛋白质非共价键形式吸附蛋白质。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。的表达。现在学习的是第35页，共52页免疫印迹法免疫印迹法抗原包被的实验膜条抗原包被的实验膜条 特异性人抗体特异性人抗体标记的二抗标记的二抗标记标记现在学习的
23、是第36页，共52页免疫印迹法免疫印迹法现在学习的是第37页，共52页蛋白质的结晶蛋白质的结晶现在学习的是第38页，共52页蛋白质的结晶蛋白质的结晶可以作为蛋白质提纯的方法之一。蛋白质可以作为蛋白质提纯的方法之一。蛋白质纯度达到一定值时可以结晶。通过反复重纯度达到一定值时可以结晶。通过反复重结晶可以除去其中的杂质，使蛋白质得到结晶可以除去其中的杂质，使蛋白质得到更大程度的纯化。更大程度的纯化。蛋白质结晶体是比较稳定的结构，所以结蛋白质结晶体是比较稳定的结构，所以结晶可以作为一个稳定的储存的方法。晶可以作为一个稳定的储存的方法。在蛋白质结晶之后，可以提供作在蛋白质结晶之后，可以提供作X射线衍射线
24、衍射分析用的材料，来分析蛋白质的结构等射分析用的材料，来分析蛋白质的结构等数据。数据。现在学习的是第39页，共52页蛋白质结晶的原理蛋白质结晶的原理蛋白质溶液在合适的过饱和状态，溶质分子通过扩散、旋转、碰撞等运动形式，可以形成晶核。溶质分子以相互碰撞的作用方式有序而反复地堆砌在晶核上，直到晶核成长到晶体，最后从溶液中析出。现在学习的是第40页，共52页晶体结晶的条件晶体结晶的条件蛋白质纯度蛋白质纯度越高，结晶越容易，至少要在越高，结晶越容易，至少要在50%以上。以上。蛋白质浓度蛋白质浓度。浓度越高，结晶机会越大。但过大会。浓度越高，结晶机会越大。但过大会因杂质存在而导致晶形不好。一般结晶的蛋白
25、质浓因杂质存在而导致晶形不好。一般结晶的蛋白质浓度在度在1050 mg/mL。温度温度。蛋白质结晶温度在。蛋白质结晶温度在0400C。一般在。一般在40C冷室冷室或或250C温箱中进行。温箱中进行。pH。一般在蛋白质的等电点的。一般在蛋白质的等电点的pH附近结晶。附近结晶。金属离子和离子强度金属离子和离子强度。一些二价离子可以引起或有。一些二价离子可以引起或有利于蛋白质的结晶过程。利于蛋白质的结晶过程。沉淀剂沉淀剂。沉淀剂。沉淀剂(如盐类和各种有机溶剂如盐类和各种有机溶剂)可改变蛋白质可改变蛋白质的溶解度。理想的沉淀剂有：聚乙二醇的溶解度。理想的沉淀剂有：聚乙二醇(PEG)和和2-甲基甲基-2
26、，4-戊二醇戊二醇(MPD)。现在学习的是第41页，共52页蛋白质结晶方法蛋白质结晶方法盐析法盐析法 在蛋白质溶液中加入盐，使蛋白质溶解度降低，之后以结晶形式从溶在蛋白质溶液中加入盐，使蛋白质溶解度降低，之后以结晶形式从溶液中析出。液中析出。有机溶剂法有机溶剂法 有机溶剂可以使蛋白质介电常数降低，导致蛋白质结晶析出。有机溶剂可以使蛋白质介电常数降低，导致蛋白质结晶析出。等电点结晶等电点结晶。蛋白质在等电点时溶解度最小，可以形成结晶。蛋白质在等电点时溶解度最小，可以形成结晶。脱盐结晶脱盐结晶。一些球蛋白溶于盐而几乎不溶于水，可将溶于盐溶液的蛋白质结一些球蛋白溶于盐而几乎不溶于水，可将溶于盐溶液的
27、蛋白质结晶而出，然后透析除盐。晶而出，然后透析除盐。温差除盐温差除盐。适用于一些对温度敏感的蛋白质，不同温度溶解度。适用于一些对温度敏感的蛋白质，不同温度溶解度变化大。可运用此法。变化大。可运用此法。金属离子金属离子。在某些蛋白质溶液中加入金属离子，可以促进晶体。在某些蛋白质溶液中加入金属离子，可以促进晶体的形成。的形成。现在学习的是第42页，共52页蛋白质提纯过程中的定量蛋白质提纯过程中的定量现在学习的是第43页，共52页蛋白质的定量蛋白质的定量(1)定氮法定氮法测量蛋白质含量测量蛋白质含量v蛋白质含量（克蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数每克生物样品中含氮的克数 6.256.25
28、现在学习的是第44页，共52页蛋白质的定量蛋白质的定量(2)双缩脲法双缩脲法 第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。双缩脲试剂的成分是质量浓度为双缩脲试剂的成分是质量浓度为0.1 g/mL的氢氧化钠溶液和质的氢氧化钠溶液和质量浓度为量浓度为0.01 g/mL的硫酸铜溶液。在碱性溶液的硫酸铜溶液。在碱性溶液(NaOH)中中,双双缩脲缩脲(H2NOCNHCONH2)能与能与Cu2+作用作用,形成紫色或紫形成紫色或紫红色的络合物红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲
29、结构相似的肽键,因此因此,含两含两个或亮个以上的肽键化合物尤其是蛋白质都可与双缩脲试剂发生个或亮个以上的肽键化合物尤其是蛋白质都可与双缩脲试剂发生颜色反应。颜色反应。现在学习的是第45页，共52页双缩脲反应产物可在双缩脲反应产物可在双缩脲反应产物可在双缩脲反应产物可在540 nm540 nm处进行比色测定可以测定蛋白质处进行比色测定可以测定蛋白质处进行比色测定可以测定蛋白质处进行比色测定可以测定蛋白质的含量，可测定范围为的含量，可测定范围为的含量，可测定范围为的含量，可测定范围为0.11.0 mg/mL0.11.0 mg/mL。！此反应为肽及蛋白质特有的，而为氨基酸所没有的一！此反应为肽及蛋白
30、质特有的，而为氨基酸所没有的一！此反应为肽及蛋白质特有的，而为氨基酸所没有的一！此反应为肽及蛋白质特有的，而为氨基酸所没有的一个颜色反应。个颜色反应。个颜色反应。个颜色反应。现在学习的是第46页，共52页蛋白质的定量蛋白质的定量(3)v福林福林-酚试剂法：酚试剂法：在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，在酚发生反应，生成蓝色化合物，在600 nm 600 nm 下测光下测光吸吸收。收。可根据测得的标准曲线计算出蛋白质的含量。可根据测得的标准曲线计算出蛋白质的含量。灵敏度较高灵敏度较高，可达可达2525 g-250
31、 g-250 g/mlg/ml。灵敏度比。灵敏度比280 280 nm nm 处的紫外吸收法灵敏处的紫外吸收法灵敏1010倍，比双缩脲法灵敏倍，比双缩脲法灵敏100100倍。倍。现在学习的是第47页，共52页蛋白质的定量蛋白质的定量(4)v紫外吸收法紫外吸收法vA.280nmA.280nm光吸收法光吸收法 根据得到的根据得到的280 nm280 nm的光吸收值与蛋白质的浓度正比，可以测的光吸收值与蛋白质的浓度正比，可以测量蛋白质溶液中的浓度。量蛋白质溶液中的浓度。vB.280nmB.280nm和和260nm260nm的吸收差法的吸收差法 用用280nm280nm下的紫外吸收减去下的紫外吸收减去
32、260nm260nm下的紫外吸收，可以排除下的紫外吸收，可以排除260nm260nm下由于核酸吸光带来的干扰。下由于核酸吸光带来的干扰。蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/mL)=1.45*A(mg/mL)=1.45*A280nm280nm-0.74*A-0.74*A260nm260nmvC.215nmC.215nm和和225nm225nm的吸收差法的吸收差法 蛋白质的肽键在蛋白质的肽键在230nm230nm下有强吸收，下有强吸收，215nm215nm可以减少干扰与光散可以减少干扰与光散射，再减去射，再减去225nm225nm的光吸收可以减少非蛋白质成分的误差。的光吸收可以减少非蛋白质成分的误差。蛋白
33、质浓度蛋白质浓度(mg/mL)=0.144*(A(mg/mL)=0.144*(A215nm215nm-A-A225nm225nm)现在学习的是第48页，共52页蛋白质的定量蛋白质的定量(4)v考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-25(G-25(Bradford法)在酸性溶液中,考马斯亮蓝和蛋白质通过疏水作用结合之后,由棕红色变为蓝色。可以在595nm进行比色测定，在0.011.0mg/mL的范围内，蛋白质浓度与光吸收呈直线关系。在直线上可以计算出蛋白质的浓度。现在学习的是第49页，共52页现在学习的是第50页，共52页蛋白质的纯度标准蛋白质的纯度标准现在学习的是第51页，共52页蛋白质的纯度标准的检测蛋白质的纯度标准的检测A.电泳法（SDS-PAGE、等电聚焦等）现在学习的是第52页，共52页