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1、关于人类细胞质的提取等第1页，讲稿共20张，创作于星期一Contents1.1.人类细胞质人类细胞质人类细胞质人类细胞质RNARNA的提取的提取的提取的提取2.RT-PCR的原理、方法的原理、方法3.3.琼脂凝胶电泳结果分析及应用琼脂凝胶电泳结果分析及应用琼脂凝胶电泳结果分析及应用琼脂凝胶电泳结果分析及应用第2页，讲稿共20张，创作于星期一 人类细胞质人类细胞质RNA的提取的提取v 真核细胞质总真核细胞质总RNA主要由主要由rRNA（80-85%）、）、tRNA和核内小分子和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其）组成，其rRNA、tRNA和和mRNA位于细胞质中。位于
2、细胞质中。第3页，讲稿共20张，创作于星期一 人类细胞质人类细胞质RNA的提取的提取分析不同发育时分析不同发育时期基因的表达状况期基因的表达状况获得新基因获得新基因AIMS研究基因的拼研究基因的拼接接分析相应的蛋分析相应的蛋白产物白产物第4页，讲稿共20张，创作于星期一 人类细胞质人类细胞质RNA的提取的提取原理：原理：RNA的不稳定性的不稳定性 由于核糖残基的由于核糖残基的2和和3位置带有羟基，位置带有羟基，RNA易于被易于被RNA酶切割水解酶切割水解 RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活。活性，不易失活。所以需要所以需要RNA酶抑制剂
3、酶抑制剂来抑制来抑制RNA酶的活性，从而达到成功提取酶的活性，从而达到成功提取RNA。第5页，讲稿共20张，创作于星期一 人类细胞质人类细胞质RNA的提取的提取常用常用RNA酶抑制剂：酶抑制剂：焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPCDEPC）：）：是一种强烈但不彻底的是一种强烈但不彻底的RNARNA酶抑酶抑制剂。它通过和制剂。它通过和RNARNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。白质变性，从而抑制酶的活性。异硫氰酸胍：异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的目前被认为是最有效的RNARNA酶抑制剂，它在酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使裂解组织
4、的同时也使RNARNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对从核蛋白中解离出来，又对RNARNA酶有强烈的变性作用。酶有强烈的变性作用。氧钒核糖核苷复合物：氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和物，它和RNARNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNARNA酶的活性。酶的活性。RNARNA酶的蛋白抑制剂（酶的蛋白抑制剂（RNasinRNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。取得来的酸性糖蛋白。RNasinRNasin是是R
5、NARNA酶的一种非竞争性抑制酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种剂，可以和多种RNARNA酶结合，使其失活。酶结合，使其失活。第6页，讲稿共20张，创作于星期一 人类细胞质人类细胞质RNA的提取的提取 RNARNA提取的一般步骤：提取的一般步骤：破碎组织破碎组织分离分离RNARNA沉淀沉淀RNARNA洗涤洗涤RNARNA融解融解RNARNA保存保存RNARNA 破碎组织和灭活破碎组织和灭活RNARNA酶可以同步进行酶可以同步进行可以用盐酸胍、硫氰酸胍、蛋白酶可以用盐酸胍、硫氰酸胍、蛋白酶K K等破碎组织等破碎组织 加入加入-巯基乙醇可以抑制巯基乙醇可以抑制RNARNA酶活性酶活性 分离分离RN
6、ARNA一般一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNARNA一般分布于上层，与蛋白层分开一般分布于上层，与蛋白层分开 沉淀沉淀RNARNA一般用乙醇、一般用乙醇、3M NaAc3M NaAc（pHpH=5.25.2）或异丙醇）或异丙醇。第7页，讲稿共20张，创作于星期一 人类细胞质人类细胞质RNA的提取的提取 洗涤洗涤RNARNA使用使用7070乙醇洗涤，有时，为避免乙醇洗涤，有时，为避免RNARNA被洗掉，此步可以省掉，被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否洗涤之后可以晾干或者烤干乙
7、醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解则不易溶解 融解融解RNARNA一般使用一般使用TETE（三羟甲基氨基甲烷和三羟甲基氨基甲烷和EDTAEDTA配置而成）配置而成）保存保存RNARNA应该尽量低温。为了防止痕量应该尽量低温。为了防止痕量RNaseRNase（核糖核酸酶）的污染，（核糖核酸酶）的污染，从富含从富含RNaseRNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNARNA需要贮存需要贮存在甲醛中以保存高质量的在甲醛中以保存高质量的RNARNA，对于长期贮存也应该如此，对于长期贮存也应该如此第8页，讲稿共20张，创作于星期一 RT-PCR 的原理及方法的原理及方
8、法 RT-PCR：逆转录逆转录PCR，或者称反转录，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应，是聚合酶链式反应(PCR)的一的一种广泛应用的变形。在种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条中，一条RNA链被逆转录链被逆转录成为互补成为互补DNA，再以此为模板通过，再以此为模板通过PCR进行进行DNA扩增。扩增。第9页，讲稿共20张，创作于星期一 RT-PCR 的原理及方法的原理及方法 背景背景 基因的表达基因的表达 不同细胞或组织表达不同的基因不同细胞或组织表达不同的基因基因组DNA(genomic DNA)信使RNA(messe
9、nger RNA,mRNA)蛋白质产物第10页，讲稿共20张，创作于星期一 RT-PCR 的原理及方法的原理及方法 目的目的通过反转录通过反转录通过反转录通过反转录(reverse transcription(reverse transcription(reverse transcription(reverse transcription，RT)RT)和聚和聚和聚和聚合酶链反应合酶链反应合酶链反应合酶链反应(polymerase chain reaction(polymerase chain reaction(polymerase chain reaction(polymerase chain
10、 reaction，PCR)PCR)PCR)PCR)的方法，检测目的基因在特定组织或的方法，检测目的基因在特定组织或细胞中、细胞中、mRNAmRNAmRNAmRNA水平的表达丰度水平的表达丰度水平的表达丰度水平的表达丰度第11页，讲稿共20张，创作于星期一 RT-PCR 的原理及方法的原理及方法原理及方法原理及方法mRNA(messenger RNA)cDNA(complementary DNA)PCR产物RT(反转反转录录)PCR(聚合酶链反聚合酶链反应应)第12页，讲稿共20张，创作于星期一 RT-PCR 的原理及方法的原理及方法第13页，讲稿共20张，创作于星期一Diagram第14页，
11、讲稿共20张，创作于星期一 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核持物的电泳法，借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或者分子形状的不同，电泳速度酸片段因其分子量或者分子形状的不同，电泳速度有差异而分离，这种技术是基因操作中常用的一种有差异而分离，这种技术是基因操作中常用的一种方法。方法。与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分分子筛子筛”和和“电泳电泳”的双重作用。的双重作用。第15页，讲稿共20张，创作于星期一 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖
12、凝胶电泳TEXTTEXTTEXTTEXT原理原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用变性电泳使用1.0%-1.4%的凝胶，不同的的凝胶，不同的RNA条带也条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的样品完整性时，配制普通的1%琼琼脂糖凝胶即可脂
13、糖凝胶即可第16页，讲稿共20张，创作于星期一 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 PCR PCR产物在琼脂糖凝胶上的产物在琼脂糖凝胶上的 电泳检测电泳检测 在基因组在基因组DNADNA的提取中，用蒸馏水溶解提的提取中，用蒸馏水溶解提取出的取出的DNADNA，在，在1.0%1.0%的琼脂糖胶进行电泳，以的琼脂糖胶进行电泳，以Marker(Marker(分子质量标准分子质量标准)作为参照，用作为参照，用5V/cm5V/cm的电泳的电泳 30-6030-60分钟，最后采用分钟，最后采用EBEB溶液进行染色后在凝胶成像系统溶液进行染色后在凝胶成像系统 中进行观察拍照。中进行观察拍照。第17页，讲稿共20张
14、，创作于星期一 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 应用应用（广泛应用与分子生物学、遗传学和生物化学）广泛应用与分子生物学、遗传学和生物化学）v分离提取大分子分离提取大分子DNA 可区分相差可区分相差100bp的的DNA片段片段v测定糖化血红蛋白测定糖化血红蛋白vPCR扩增产物的检测扩增产物的检测v免疫扩散法免疫扩散法 利用琼脂糖凝胶作为扩散介质，使抗原与抗体在利用琼脂糖凝胶作为扩散介质，使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物体复合物第18页，讲稿共20张，创作于星期一 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳结果初步分析结果初步分析v数量分析：条带的宽度数量分析：条带的宽度 荧光的亮度荧光的亮度v质量分析：产物纯度质量分析：产物纯度 分子量分子量第19页，讲稿共20张，创作于星期一感感谢谢大大家家观观看看第20页，讲稿共20张，创作于星期一