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1、第1页，讲稿共100张，创作于星期日黃金米富含富含铁质铁质含胡萝卜素含胡萝卜素一般白米一般白米第2页，讲稿共100张，创作于星期日转基因植物与农作物的转基因植物与农作物的转基因植物与农作物的转基因植物与农作物的抗性抗性抗性抗性中国抗病毒白菜抗虫玉米抗除草剂第3页，讲稿共100张，创作于星期日耐耐耐耐储储储储转转转转基基基基因因因因农农农农作作作作物物物物耐储第4页，讲稿共100张，创作于星期日转基因植物转基因植物转基因植物转基因植物瑞士金大米烟草双抗石竹棉花荧光蘑菇第5页，讲稿共100张，创作于星期日第6页，讲稿共100张，创作于星期日第7页，讲稿共100张，创作于星期日转转 基基 因因 动动
2、 物物荧光斑马鱼荧光猪硕鼠绿荧光猴鲑鱼第8页，讲稿共100张，创作于星期日基因工程疫苗转基因烟草能够产生狂犬病抗体 美国含乙肝疫苗马铃薯墨防腹泻蔬菜第9页，讲稿共100张，创作于星期日第10页，讲稿共100张，创作于星期日第11页，讲稿共100张，创作于星期日第12页，讲稿共100张，创作于星期日第13页，讲稿共100张，创作于星期日Geneengineering从狭义上讲：从狭义上讲：基基 因因 工工 程程(又又 称称 DNA重重 组组 技技 术术，DNARecombination)是是指指将将一一种种或或多多种种生生物物体体（供供体体）的的基基因因与与载载体体在在体体外外进进行行拼拼接接重
3、重组组，然然后后转转入入到到另另一一种种生生物物体体（受受体体）内内，使使之之按按照照人人们们的的意意愿愿遗传并表达出新的性状。遗传并表达出新的性状。第14页，讲稿共100张，创作于星期日通过基因工程获得新性状的生物体通过基因工程获得新性状的生物体微生物微生物称为称为工程菌工程菌新类型的新类型的动物动物称为称为工程动物、转基工程动物、转基因动物。因动物。新类型的新类型的植物植物称为称为工程植物、转基工程植物、转基因植物。因植物。第15页，讲稿共100张，创作于星期日从广义上讲：从广义上讲：基基因因工工程程定定义义为为DNA重重组组技技术术的的产产业业化化设设计计与与应应用用，包括包括上游技术上
4、游技术和和下游技术下游技术两大部分。两大部分。上上游游技技术术指指外外源源基基因因重重组组、克克隆隆和和表表达达的的设设计计和和构构建（即狭义的基因工程）；建（即狭义的基因工程）；下下游游技技术术指指含含有有外外源源基基因因的的生生物物细细胞胞的的大大规规模模培培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。第16页，讲稿共100张，创作于星期日基因工程操作的基本过程基因工程操作的基本过程大致可以分为以下几个步骤：大致可以分为以下几个步骤：1、从从供供体体细细胞胞中中分分离离出出基基因因组组DNA（或或合合成成基基因因），用用限限制制性性内内切切酶酶分分别别将将外
5、外源源DNA（包包括括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称切切）2、用用DNA连连接接酶酶将将含含有有外外源源基基因因的的DNA片片段段接接到到载体分子上，形成载体分子上，形成DNA重组分子（简称重组分子（简称接接）第17页，讲稿共100张，创作于星期日3、借助于细胞转化手段等手段将、借助于细胞转化手段等手段将DNA重组分子倒入重组分子倒入受体细胞（简称受体细胞（简称转转）4、短时间培养转化细胞，以扩增、短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称整合到受体细胞的基因组中（简称增增）5、筛选和鉴定转化细胞
6、，获得使外源基因高效稳定表达、筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称的基因工程菌或细胞（简称检检）第18页，讲稿共100张，创作于星期日第19页，讲稿共100张，创作于星期日基因工程的工具酶基因工程的工具酶目的基因目的基因基因工程的载体基因工程的载体基因重组基因重组转化、增殖和表达转化、增殖和表达基因工程在食品工业中的应用基因工程在食品工业中的应用基因工程食品卫生安全管理条理基因工程食品卫生安全管理条理第20页，讲稿共100张，创作于星期日基因工程工具酶基因工程工具酶工具酶（工具酶（Enzymeoftools）：在基因工程中应在基因工程中应用的酶统称为用的酶统称
7、为。包括体外进行包括体外进行DNA合成、切割、修饰和连接合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶，如等系列过程中所需要的酶，如DNA聚合酶、聚合酶、限制性内切酶、修饰酶和连接酶等等。限制性内切酶、修饰酶和连接酶等等。目前，常用的工具酶已有目前，常用的工具酶已有300多种。多种。第21页，讲稿共100张，创作于星期日一一限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶（限制性内切酶（restrictionendonuclease）:是是一一类类以以环环状状或或线线形形双双链链DNA为为底底物物，能能识识别别DNA中中特特定定核核苷苷酸酸序序列列，并并在在合合适适反反应应条条件件下下使使每每条条链的一个磷
8、酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。1、限制性内切酶的类型及特性、限制性内切酶的类型及特性分为三种类型：分为三种类型：型、型、型和型和型。型。第22页，讲稿共100张，创作于星期日第23页，讲稿共100张，创作于星期日第24页，讲稿共100张，创作于星期日是根据分离出此酶的微生物的学名而定的。是根据分离出此酶的微生物的学名而定的。命命名名原原则则：取取微微生生物物属属名名的的第第一一个个字字母母和和种种名名的的前前两两个个字字母母组组成成三三个个斜斜体体字字母母加加以以表表示示，菌菌株株名名以以非非斜斜体体字字母母再再加加在在后后面面。如如果果同同一一菌菌
9、株株中中先先后后发发现现几几种种不不同同的限制性内切酶，则用罗马数字加以表示。的限制性内切酶，则用罗马数字加以表示。例：例：EcoRE:来源于来源于Escherichiacoli的属名的第一个字母的属名的第一个字母Co:来源于来源于Escherichiacoli的种名的头两个字母的种名的头两个字母R:表示株名表示株名：表示该菌中第一个被分离出来的酶：表示该菌中第一个被分离出来的酶2、限制性内切酶的命名、限制性内切酶的命名第25页，讲稿共100张，创作于星期日3、限制性内切酶的作用机制、限制性内切酶的作用机制限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶以以环环状状和和线线形形的的双双链链DNA为为底底物物，
10、在在合合适适的的反反应应条条件件下下，识识别别一一定定的的核核苷苷酸酸序序列列，使使两两条条核核糖糖链链上上特特定定位位置置的的磷磷酸酸二二酯酯键键断断开开，产产生生具具有有了了3OH基基团团和和5P基基团的片段。团的片段。第26页，讲稿共100张，创作于星期日限限制制性性内内切切酶酶在在双双链链DNA上上能能够够识识别别的的特特殊殊核核苷苷酸酸序序列列被被称称为为识识别别序序列列。不不同同的的限制性内切酶各有相应的识别序列。限制性内切酶各有相应的识别序列。现现在在发发现现的的限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别序序列列多多数数由由4、5、6个核苷酸组成。个核苷酸组成。4、限制性内切酶的识别序
11、列、限制性内切酶的识别序列第27页，讲稿共100张，创作于星期日EcoR的识别序列是：的识别序列是：GAATTCCTTAAGHind的识别序列是：的识别序列是：AAGCTTTTCGAASau3A的识别序列是：的识别序列是：GATCCTAG它们具有它们具有共同的特点共同的特点，即呈现，即呈现碱基互补对称碱基互补对称。识别序列可以按从识别序列可以按从5-3走向的单链走向的单链DNA表示。表示。如如5AAGCTT33TTCGAA5可以写成可以写成5AAGCTT3。第28页，讲稿共100张，创作于星期日5、限制性内切酶切割、限制性内切酶切割DNA的位点的位点和切割片段的末端和切割片段的末端DNA在限制
12、性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点切割位点。表示方法：表示方法：或或/限制性核酸内切酶在限制性核酸内切酶在DNA上切割的位点一般在识别上切割的位点一般在识别序列内部，如序列内部，如GGATCC等。等。少数限制性内切酶在少数限制性内切酶在DNA上的切割位点在识上的切割位点在识别序列的两侧别序列的两侧，如，如GATC等。等。第29页，讲稿共100张，创作于星期日经限制性核酸内切酶切割产生的经限制性核酸内切酶切割产生的DNA片段末端：片段末端：两种形式：两种形式：1、粘性末端：、粘性末端：一类
13、是两条一类是两条DNA链断开的位置是交错链断开的位置是交错对称的，产生的对称的，产生的DNA片段末端的一条链多出片段末端的一条链多出1至几个核至几个核苷酸，同具有互补核苷酸的另一苷酸，同具有互补核苷酸的另一DNA片段末端可以粘片段末端可以粘结，这样的结，这样的DNA片段末端称为粘性末端片段末端称为粘性末端。2、平末端：、平末端：两条链上断裂的位置处在识别序列的对两条链上断裂的位置处在识别序列的对称结构中心，产生的称结构中心，产生的DNA末端是平齐的，称为平末末端是平齐的，称为平末端。端。第30页，讲稿共100张，创作于星期日第31页，讲稿共100张，创作于星期日二、二、DNA连接酶连接酶DNA
14、连接酶（连接酶（DNAligase）：）：能能催催化化两两个个DNA片片段段末末端端之之间间的的3-OH和和5-P基基团团形成磷酸二酯键，使两末端连接的酶称为形成磷酸二酯键，使两末端连接的酶称为。种类：种类：大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶（连接酶（E.coliDNA连接酶）连接酶）T4-DNA连接酶连接酶第32页，讲稿共100张，创作于星期日大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶只能连接具有互补粘性末端的连接酶只能连接具有互补粘性末端的DNA片段，反应系统中必须含有片段，反应系统中必须含有NAD作为辅助因子。作为辅助因子。第33页，讲稿共100张，创作于星期日T4-DNA连连接接酶酶即即可可以以用用于于双
15、双链链DNA片片段段互互补补粘粘性性末末端端之之间间的的连连接接，也也能能催催化化双双链链DNA片片段段平平末末端端之之间间的的连连接接，但但平平末末端端之之间间连连接接的的效效率率比比较较低低。反反应应系系统统中中必必须须加加有有ATP作为辅助因子。作为辅助因子。第34页，讲稿共100张，创作于星期日三、三、DNA聚合酶聚合酶常使用的常使用的DNA聚合酶有：聚合酶有：大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶和和T4DNA聚合酶等。聚合酶等。DNA聚合酶的共同特点：聚合酶的共同特点：能能把把脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸连连续续加加到到双双链链DNA分分子子引物链的引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚
16、合。末端，催化核苷酸的聚合。第35页，讲稿共100张，创作于星期日大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶的的53的的DNA聚合活性：催聚合活性：催化单核苷酸结合到化单核苷酸结合到DNA模板的模板的3-OH末端，以单链末端，以单链DNA为模板，从引物的为模板，从引物的3末端按模板顺序从末端按模板顺序从53延伸。延伸。CCGE.coliDNApolCCGATAGCCTGGCTATCGGAMg2+4dNTPGGCTATCGGA第36页，讲稿共100张，创作于星期日目前采用的碱性磷酸酯酶有两种目前采用的碱性磷酸酯酶有两种:1、细菌碱性磷酸酯酶、细菌碱性磷酸酯酶(BAP)2、小牛肠碱性磷酸酯酶、小牛肠碱性磷
17、酸酯酶(CIP)碱碱性性磷磷酸酸酯酯酶酶能能催催化化从从单单链链或或双双链链DNA或或RNA分分子子中中除除去去5-磷磷酸酸残残基基，即即脱脱磷磷酸酸作作用用，使使DNA或或RNA末末端端的的5-P成成为为5-OH。四、碱性磷酸酯酶四、碱性磷酸酯酶第37页，讲稿共100张，创作于星期日在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：1、在、在DNA重组技术中除去重组技术中除去DNA片段的片段的5磷酸，防止自身环化。磷酸，防止自身环化。2、在用、在用32P标记标记DNA的的5磷酸末端之前，磷酸末端之前，除去磷酸。除去磷酸。第38页，讲稿共100张，创作于星期日T4多多聚聚核核苷苷酸酸激激酶酶：能能催催化
18、化ATP上上的的-磷磷酸酸转转移移到到DNA或或RNA的的5-OH末末端端上上，使使其磷酸化。其磷酸化。主主要要作作用用是是为为DNA的的5末末端端标标记记，标标记记待待测测的的DNA片片段段（ATP上上的的-磷磷酸酸是是放放射射性性的）。的）。五、五、T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶第39页，讲稿共100张，创作于星期日S1核核酸酸酶酶：其其主主要要特特征征是是降降解解单单链链DNA或或RNA，包包括括不不能能形形成成双双链链的的区区域域（如如发发夹夹结结构构中中的的环环状状部部分分），但但降降解解DNA的的速速度度大大于于降降解解RNA的的速速度度，降降解解反反应应的的方方式式为为内内切切
19、和和外外切切，当当酶酶量量过过大大时时会会伴伴有有双双链链DNA的降解。的降解。在基因工程中应用：在基因工程中应用：常常用用它它切切平平DNA双双链链中中突突出出的的单单链链末末端端，使使产产生生平平末端，在质粒组建和末端，在质粒组建和DNA重组中被广泛使用。重组中被广泛使用。六、六、S1核酸酶（核酸酶（S1Nuclesse）第40页，讲稿共100张，创作于星期日反向转录酶（反向转录酶（Reversetranscriptase）：）：能能以以RNA为为模模板板，反反向向转转录录合合成成出出对对应应的的DNA（单单链链或或双双链链），因因此此，通通过过反反向向转转录录酶酶的的作作用用，可可以以从
20、从某某一一基基因因的的mRNA来来合合成成出出该该基基因因，以以获获得得目目的的基基因因。反反向向转转录录酶酶也也能以能以DNA为模板合成为模板合成DNA。七、反向转录酶七、反向转录酶第41页，讲稿共100张，创作于星期日目目的的基基因因：按按照照人人们们预预先先设设计计的的蓝蓝图图，获获得得所需要的特异基因，即所需要的特异基因，即。目目的的基基因因主主要要是是编编码码蛋蛋白白质质（酶酶）的的结结构构基基因因，如如抗抗逆逆性性相相关关基基因因、工工业业用用酶酶相相关关基基因因、生生物物药药和和保保健健品品相相关关基基因因、毒毒物物降降解解相相关关基基因等。因等。目的基因目的基因第42页，讲稿共
21、100张，创作于星期日分离目的基因的方法分离目的基因的方法1、鸟枪法（、鸟枪法（Shotgun）2、酶促合成法酶促合成法3、化学合成法、化学合成法第43页，讲稿共100张，创作于星期日第44页，讲稿共100张，创作于星期日以以目目的的基基因因的的mRNA为为模模板板，在在反反向向转转录录酶酶的的 作作 用用 下下 合合 成成 互互 补补 的的DNA，即即cDNA(complementaryDNA)，然然后后在在DNA聚聚合合酶酶的的催催化化下下合合成成双双链链cDNA片片段段，与与适适当当的的载载体体重重组组后后转转入入受受体体菌菌中中扩扩增增，获获得得目目的的基基因因的的cDNA克隆。克隆。
22、mRNAcDNAdscDNA。2、酶促合成法、酶促合成法第45页，讲稿共100张，创作于星期日DNA或或RNA序列的合成：序列的合成：按按照照已已知知基基因因的的碱碱基基顺顺序序，将将单单核核苷苷酸酸或或核核苷苷酸酸片片段段一一个个一一个个或或一一个个片片段段一一个个片片段段地地聚聚合合起起来来。一一般般先先合合成成DNA短短片片段段，再再依依次次连连接接成成完完整整的的目目的的基因链。基因链。目目前前，化化学学合合成成寡寡核核苷苷酸酸片片段段的的能能力力一一般般局局限限在在150200bp以以内内，这这种种方方法法适适合合分分子子较较小小的的基基因因的合成。的合成。3、化学合成法、化学合成法
23、第46页，讲稿共100张，创作于星期日基因克隆载体（基因克隆载体（genecloningvector）：）：把能承载外源把能承载外源DNA片段（基因）并将其带入受体片段（基因）并将其带入受体细胞的传递者称为细胞的传递者称为。基因载体必须具备的几个条件：（基因载体必须具备的几个条件：（书上书上P19）本身是一个复制子，能自我复制。本身是一个复制子，能自我复制。相相对对分分子子量量要要小小，小小分分子子易易处处理理，限限制制性性内内切切酶酶切切点点少少，适适于于接接受受目目的的基基因因。酶酶切切位位点点应应位位于于载载体体复制的非必需区。复制的非必需区。基因载体基因载体第47页，讲稿共100张，创
24、作于星期日能能给给寄寄主主细细胞胞（受受体体细细胞胞）提提供供可可选选择择性性标标记、可供辨认的表型特征，以便人们进行筛选。记、可供辨认的表型特征，以便人们进行筛选。克隆载体必须是安全的。克隆载体必须是安全的。目目前前应应用用的的基基因因载载体体：质质粒粒载载体体、噬噬菌菌体体载载体体和和病病毒毒载载体体，以以及及由由它它们们互互相相组组合合或或与与其其他他基基因因组组DNA组合而成的载体。组合而成的载体。第48页，讲稿共100张，创作于星期日质粒载体：质粒载体：以以质质粒粒DNA为为基基础础构构建建而而成成的载体。的载体。质粒：质粒：是是一一种种存存在在于于宿宿主主细细胞胞中中染染色色体体以
25、以外外的的裸裸露露的的双双链链DNA分分子子，一个质粒就是一个一个质粒就是一个DNA分子。分子。一、质粒载体一、质粒载体第49页，讲稿共100张，创作于星期日根根据据质质粒粒在在寄寄主主细细胞胞中中拷拷贝贝数数的的多多少少，将将质质粒粒分分为两种类型：为两种类型：即严紧型质粒和松弛型质粒。即严紧型质粒和松弛型质粒。严严紧紧型型质质粒粒：拷拷贝贝数数少少的的，只只有有至至几几个个拷拷贝贝，称之严紧型质粒。称之严紧型质粒。松松弛弛型型质质粒粒：拷拷贝贝数数多多的的，10个个拷拷贝贝以以上上，一一般般10-200，有有的的能能复复制制几几百百个个或或上上千千个个拷拷贝贝，称称之之松弛型质粒。松弛型质
26、粒。构建质粒载体一般选用分子小和松弛型的质粒。构建质粒载体一般选用分子小和松弛型的质粒。第50页，讲稿共100张，创作于星期日构建的质粒载体应具有复制起始点，能在受体构建的质粒载体应具有复制起始点，能在受体细胞内复制。细胞内复制。质粒载体还应有质粒载体还应有12种选择标记基因（如抗生种选择标记基因（如抗生素的抗性基因素的抗性基因Amr青霉素抗性青霉素抗性Tcr四环素抗四环素抗性性等）。等）。另外质粒上有允许外源另外质粒上有允许外源DNA组人的克隆位点。组人的克隆位点。第51页，讲稿共100张，创作于星期日通常可采用这两种方法：通常可采用这两种方法：选择性抽提法选择性抽提法用用溶溶菌菌酶酶溶溶菌
27、菌，形形成成的的细细胞胞碎碎片片因因染染色色体体DNA与与质质粒粒DNA有有相相对对分分子子质质量量上上的的差差异异，用用高高速速离离心心方方法法而而分分离离。上上清清液液经经乙乙醇醇沉沉淀淀后后可可得到质粒得到质粒DNA的粗制品。的粗制品。质粒质粒DNA的分离提取方法：的分离提取方法：第52页，讲稿共100张，创作于星期日碱碱性性SDS法法（sodiumdodecylsulfate,十十二烷基硫酸钠）：二烷基硫酸钠）：先先用用碱碱性性SDS（pH12.012.6）处处理理含含有有质质粒粒的的宿宿主主细细胞胞，然然后后用用NaAc（pH=4.8）处处理理，使使混混合合液液的的pH降降低低到到7
28、.0左左右右，使使质质粒粒选选择择性性地地复复性性，而而染染色色体体DNA随随同同SDS和和蛋蛋白白质质一一起起沉沉淀淀下下去去。再再经经高高速速离心将质粒离心将质粒DNA留在上清液而达到分离的目的。留在上清液而达到分离的目的。第53页，讲稿共100张，创作于星期日纯化方法：纯化方法：碱性蔗糖密度梯度离心法碱性蔗糖密度梯度离心法氯化铯氯化铯溴化乙锭密度梯度离心法溴化乙锭密度梯度离心法硝酸纤维素膜吸附法硝酸纤维素膜吸附法鉴定方法：鉴定方法：凝胶电泳法凝胶电泳法电镜法电镜法质粒质粒DNA纯化和鉴定方法：纯化和鉴定方法：第54页，讲稿共100张，创作于星期日噬菌体（噬菌体（Phage）：）：是病毒的
29、一种，把感染细菌的是病毒的一种，把感染细菌的病毒专门称为噬菌体。病毒专门称为噬菌体。二、二、噬菌体载体噬菌体载体噬噬菌菌体体载载体体：由由噬噬菌菌体体构构建建的基因载体叫的基因载体叫。能能作作为为基基因因载载体体的的噬噬菌菌体体主主要是要是噬菌体。噬菌体。第55页，讲稿共100张，创作于星期日噬菌体是一种温和噬菌体噬菌体是一种温和噬菌体能承载比较大的外源能承载比较大的外源DNA片段片段噬噬 菌菌 体体 头头 部部 容容 许许 包包 装装 入入 DNA分分 子子 大大 小小75%105%的的DNA片段。片段。DNA上上约约有有20kb的的区区域域对对它它生生长长不不是是绝绝对对需需要要的的，可可
30、以以缺缺失失或或被被外外源源DNA片片段段取取代。代。有多种限制性核酸内切酶识别位点有多种限制性核酸内切酶识别位点用用噬菌体构建克隆载体的原因：噬菌体构建克隆载体的原因：第56页，讲稿共100张，创作于星期日删删除除某某种种限限制制性性内内切切酶酶在在DNA分分子子上上的的一一些些识识别序列，只在非必需区保留别序列，只在非必需区保留l2个识别序列。个识别序列。用用合合适适的的限限制制性性内内切切酶酶切切去去部部分分非非必必需需区区，但但是由此构建的是由此构建的DNA载体不应小于载体不应小于38kb。在在DNA分分子子的的合合适适区区域域插插入入可可供供选选择择的的标标记记基因。基因。构建构建噬
31、菌体载体的基本原则：噬菌体载体的基本原则：第57页，讲稿共100张，创作于星期日插入型载体（插入型载体（Insertionvector）：）：此此类类载载体体即即为为DNA基基因因组组中中缺缺失失部部分分非非必必要要基基因因，只只含含有有1个个可可供供外外源源DNA插插入入的的限限制制性性内内切切酶酶位位点点的的DNA载体。载体。替换型载体（替换型载体（Replacementvector）：）：该该载载体体是是在在DNA的的可可替替换换片片段段两两端端具具有有两两个个限限制制性性内内切切酶酶位位点点，酶酶切切后后替替换换片片段段与与带带有有所所有有必必需需基基因因的的左左右双臂分开，由外源右双
32、臂分开，由外源DNA片段取代之。片段取代之。DNA载体分为两类：载体分为两类：第58页，讲稿共100张，创作于星期日M13噬噬菌菌体体：是是感感染染大大肠肠杆杆菌菌的的一一种种丝丝状状噬噬菌菌体体，内有一个环状单链内有一个环状单链DNA分子（分子（+链链DNA）。）。M13噬菌体感染雄性大肠杆菌后，噬菌体感染雄性大肠杆菌后，M13的的“+”链链DNA进入细胞内，以此为模板复制互进入细胞内，以此为模板复制互补的补的“-”链链DNA。由此产生的双链由此产生的双链M13DNA称为复制型称为复制型DNA（RFDNA）。）。用双链用双链RFDNA作为基因载体作为基因载体三、三、M13噬菌体载体噬菌体载体
33、第59页，讲稿共100张，创作于星期日第60页，讲稿共100张，创作于星期日第四节第四节基因重组基因重组基因重组：基因重组：即将目的基因（或外源基因）即将目的基因（或外源基因）和载体在体外连接构建形成重组子。这和载体在体外连接构建形成重组子。这种连接主要靠种连接主要靠DNA连接酶。连接酶。DNA连接酶：连接酶：能催化两个能催化两个DNA片段末端片段末端之间的之间的3-OH和和5-P基团形成磷酸二酯键，基团形成磷酸二酯键，使两末端连接。使两末端连接。第61页，讲稿共100张，创作于星期日第62页，讲稿共100张，创作于星期日DNA体外重组方式：体外重组方式：通过通过DNA连接酶实现连接酶实现DN
34、A体外重组方式：体外重组方式：主要为主要为粘性末端连接法粘性末端连接法（或称粘接法），也可（或称粘接法），也可以用以用平头连接法平头连接法。粘性末端连接法又可分为两种：粘性末端连接法又可分为两种：直接粘接直接粘接和和加加尾粘接尾粘接。第63页，讲稿共100张，创作于星期日直接粘接直接粘接第64页，讲稿共100张，创作于星期日加尾粘接法加尾粘接法第65页，讲稿共100张，创作于星期日重重组组DNA分分子子在在体体外外构构建建完完成成后后，必必须须导导入入到到受受体体细细胞胞中中，使使之之无无性性繁繁殖殖并并高高效效表表达达外源基因或直接改变其遗传性状。外源基因或直接改变其遗传性状。导导入入受受体
35、体细细胞胞的的方方法法：包包括括转转化化、转转导导、杂杂交交等等，这这些些导导入入方方法法在在DNA重重组组技技术术中中统统称称为为转转化化操操作。作。第五节第五节转化、增殖和表达转化、增殖和表达第66页，讲稿共100张，创作于星期日1、受体细胞受体细胞基因工程中的受体细胞是指能接受外源基因工程中的受体细胞是指能接受外源DNA并并使其稳定维持的细胞。使其稳定维持的细胞。常常用用的的受受体体细细胞胞微微生生物物中中以以细细菌菌为为主主，此此外外还还有有放放线线菌菌、酵酵母母菌菌，另另外外有有哺哺乳乳动动物物细细胞胞和和植植物细胞。物细胞。一、转化（一、转化（transformation）第67页
36、，讲稿共100张，创作于星期日重组重组DNA分子导入原核生物细胞常常采用的三种方分子导入原核生物细胞常常采用的三种方法：转化、转导和杂交法：转化、转导和杂交转化：转化：携带基因的外源携带基因的外源DNA分子通过与膜蛋白结分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在其中稳定维持和表达的过程称合进入受体细胞，并在其中稳定维持和表达的过程称为为转化（转化（transformation）。2、转化、转导和杂交、转化、转导和杂交第68页，讲稿共100张，创作于星期日能进行转化的受体细胞必须处于感受态。能进行转化的受体细胞必须处于感受态。感受态：感受态：也就是受体细胞最易接受外源也就是受体细胞最易接受外源DNA
37、片片段并实现其转化的一种生理状态。段并实现其转化的一种生理状态。感受态出现的时期：感受态出现的时期：一般在对数期的后期。一般在对数期的后期。细细胞胞感感受受态态的的出出现现与与以以下下因因素素有有关关：微微生生物物本本身身遗遗传传特特性性、菌菌龄龄、生生理理状状态态、培培养养条条件件等等都都影影响响感感受受态的形成。态的形成。第69页，讲稿共100张，创作于星期日感感受受态态细细胞胞的的制制备备方方法法是是将将细细胞胞培培养养到到对对数数期期，然然后后采采用用Cacl2溶溶液液处处理理可可以以使使感感受受态态细细胞胞在在12天天内内能能有效地吸收外界的有效地吸收外界的DNA分子。分子。将将制制
38、备备好好的的感感受受态态细细胞胞和和外外源源DNA在在一一定定条条件件下下混混合合并进行适当的处理，就可以得到一定量的转化子。并进行适当的处理，就可以得到一定量的转化子。转转化化子子：受受体体细细胞胞接接受受了了外外源源基基因因，从从而而得得到到了了新新的的基因型、新的性状，就叫转化子（重组子）。基因型、新的性状，就叫转化子（重组子）。第70页，讲稿共100张，创作于星期日影响转化效率高低的因素影响转化效率高低的因素:受体细胞的感受态；受体细胞的感受态；重重组组DNA分分子子的的构构型型和和分分子子的的大大小小，环环状状DNA分分子子和和相相对对分分子子质质量量大大的的重重组组DNA分分子子，
39、其其转转化化效效率越低；率越低；加加入入CaCI2和和MgCl2处处理理以以及及加加人人六六胺胺氯氯化化钴钴等等都可提高转化率。都可提高转化率。第71页，讲稿共100张，创作于星期日转导（转导（transduction）：）：通通过过噬噬菌菌体体（病病毒毒）感感染染宿宿主主细细胞胞的的途途径径把把外外源源DNA分分子子转转移移到到受受体体细细胞胞内内的的过程。过程。含含有有目目的的基基因因的的DNA与与噬噬菌菌体体载载体体的的重重组组DNA分分子子导导入入受受体体细细胞胞，一一般般先先需需要要进行体外包装。进行体外包装。第72页，讲稿共100张，创作于星期日二、转化细胞的扩增、重组子的筛选和鉴
40、定二、转化细胞的扩增、重组子的筛选和鉴定受受体体细细胞胞经经转转化化（转转染染）或或转转导导处处理理后后，真真正正获获得得目目的的基基因因并并能能有有效效表表达达的的重重组组子子一一般般来来说说只只是是一一小小部部分分，而而绝绝大大部部分分仍仍是是原原来来的的受受体体细细胞胞，或或者者是是不不含含目目的的基基因因的的重组子。重组子。扩扩增增:一一般般是是将将经经转转化化操操作作后后的的受受体体细细胞胞立立即即进进行行短短时间的培养，使其增殖时间的培养，使其增殖。转化细胞扩增的目的是为后续的筛选鉴定创造条件。转化细胞扩增的目的是为后续的筛选鉴定创造条件。第73页，讲稿共100张，创作于星期日重组
41、子的筛选方法重组子的筛选方法1、插入失活法：、插入失活法：具有双抗药性标记的具有双抗药性标记的PBR322质粒质粒:Apr（青霉素抗性基因（青霉素抗性基因）Tcr（四环素抗性基因）（四环素抗性基因）当当它它与与目目的的基基因因重重组组时时，若若用用BamHI限限制制性性内内切切酶酶切切割割，则则外外源源目目的的基基因因插插人人后后，造造成成TCr基基因因的的失失活活，转转化化后后的的受受体体细细胞胞（重重组组菌菌）不不能能在在含含有有Tc的培养基上生长。的培养基上生长。第74页，讲稿共100张，创作于星期日第75页，讲稿共100张，创作于星期日2、同位素探针筛选：、同位素探针筛选：探探针针：含
42、含有有目目的的基基因因内内某某段段序序列列的的DNA片片段段叫叫。3、其其它它方方法法：如如基基因因表表达达产产物物分分析析法法、免免疫疫化学分析法等等。化学分析法等等。重组子的鉴定方法：重组子的鉴定方法：如如采采用用限限制制性性内内切切酶酶分分析析、分分子子杂杂交交、DNA测测序和序和PCR扩增等方法。扩增等方法。第76页，讲稿共100张，创作于星期日PCR扩扩增增技技术术：多多聚聚酶酶链链式式反反应应（Polymerasechainreaction，PCR）是一种在体外快速扩增特定是一种在体外快速扩增特定DNA序列的新技术。序列的新技术。PCR技术的本质：技术的本质：是是根根据据生生物物体
43、体DNA的的复复制制原原理理在在体体外外合合成成DNA，这这个个反反应应需需要要DNA单单链链模模板板、引引物物、DNA聚聚合合酶酶以及缓冲系统。以及缓冲系统。PCR扩增技术：扩增技术：第77页，讲稿共100张，创作于星期日PCR扩扩增增DNA特特定定靶靶序序列列的的一一个个前前提提条条件件：是是必必须须知知道道待待扩扩增增DNA区区域域两两端端1624bp的的序序列列，由由此此合合成成两两种引物。种引物。引物：引物：是是PCR扩增过程中引导互补链扩增过程中引导互补链DNA合成的一种合成的一种脱氧核苷酸寡聚体，其脱氧核苷酸寡聚体，其3端必须具有游离的端必须具有游离的OH基团。基团。引物与所要扩
44、增的靶引物与所要扩增的靶DNA片段的末端互补，与模板片段的末端互补，与模板DNA相结合并沿模板相结合并沿模板DNA延伸，以扩增靶延伸，以扩增靶DNA序列。序列。第78页，讲稿共100张，创作于星期日（1）将待扩增双链将待扩增双链DNA加热变性，形成单链模加热变性，形成单链模板；板；（2）加入两种不同的单链加入两种不同的单链DNA引物，并分别与两引物，并分别与两条单链条单链DNA模板退火；模板退火；（3）DNA聚合酶从两个引物的聚合酶从两个引物的3羟基端按照模板羟基端按照模板要求合成新生要求合成新生DNA链，构成一轮复制反应。重复上链，构成一轮复制反应。重复上述操作述操作n次，理论上即可从次，理
45、论上即可从1分子的双链分子的双链DNA扩增扩增到到2n个分子。个分子。IPCR扩增扩增DNA的反应包括三步程序：的反应包括三步程序：第79页，讲稿共100张，创作于星期日第80页，讲稿共100张，创作于星期日通通过过DNA重重组组技技术术使使特特定定基基因因片片段段在在受受体体细细胞胞内内大大量量增增殖殖，还还必必须须使使特特定定基基因因进进一一步步转转录录、翻翻译译为为相相应应的的蛋蛋白白质质（或或酶酶），甚甚至至进进而而获获得得它它们们的的代谢产物，这一过程称为基因表达。代谢产物，这一过程称为基因表达。基因表达主要涉及的两个反应就是转录和翻译。基因表达主要涉及的两个反应就是转录和翻译。转录
46、转录翻译翻译DNAmRNA蛋白质蛋白质三、基因表达三、基因表达第81页，讲稿共100张，创作于星期日转转录录和和翻翻译译这这两两个个环环节节，它它是是在在一一系系列列酶酶蛋蛋白白和和调调控序列的共同作用下完成的。控序列的共同作用下完成的。转转录录：外外源源基基因因的的起起始始转转录录是是基基因因表表达达的的关关键键步步骤骤，转转录录的的起起始始需需要要RNA聚聚合合酶酶与与启启动动子子的的有有效效结结合合，一一旦旦RNA聚聚合合酶酶定定位位并并结结合合到到启启动动子子序序列列上，就可启动转录。上，就可启动转录。转转录录的的效效率率与与启启动动子子强强弱弱有有关关，一一般般基基因因表表达都有强启
47、动子。达都有强启动子。第82页，讲稿共100张，创作于星期日外外源源基基因因的的高高效效表表达达不不仅仅取取决决于于转转录录启启动动频频率率，而而且且在在很很大大程程度度上上还还与与mRNA的的翻翻译译起起始始效效率率密密切相关。切相关。翻译翻译:是是mRNA指导多肽链合成的过程。指导多肽链合成的过程。影响翻译起始的因素影响翻译起始的因素:如如mRNA上上的的起起始始密密码码子子、结结合合核核糖糖体体所所需需要要的的SD序序列列、起起始始密密码码与与SD序序列列之之间间的的距距离离和和碱碱基基组组成、成、mRNA的二级结构等等。的二级结构等等。第83页，讲稿共100张，创作于星期日SD序列是序
48、列是mRNA上与核糖体上与核糖体16SrRNA互补结合的互补结合的位点，该序列位于翻译密码子上游的位点，该序列位于翻译密码子上游的6至至8个核苷酸个核苷酸序列序列5UAAGGAGG3,即即Shine-Dalgarno,简称简称SD序列。序列。一般来说，一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越大，而这种结合程度主要取翻译的起始效率就越大，而这种结合程度主要取决于决于SD序列与序列与16SrRNA的碱基互补程度。的碱基互补程度。第84页，讲稿共100张，创作于星期日总总之之，要要使使一一个个外外源源基基因因在在原原核核生生物物中中很很好好地地表表达达，需
49、需要要在在插插入入的的DNA顺顺序序中中加加进进一一个个强强启启动子。动子。要要使使一一个个外外源源基基因因在在真真核核生生物物中中很很好好地地表表达达，除除了了加加进进一一个个强强启启动动子子外外，尚尚需需接接上上SD序序列列，以利其表达。以利其表达。第85页，讲稿共100张，创作于星期日第六节第六节基因工程在食品工业中应用基因工程在食品工业中应用一、一、改良食品加工的原料改良食品加工的原料动物性原料：动物性原料：1、应用基因工程提高奶牛的产奶量、应用基因工程提高奶牛的产奶量将采用基因工程技术生产的牛生长激素将采用基因工程技术生产的牛生长激素（bovinesomatotropin，BST）注
50、注射射到到母母牛牛体体内内可提高母牛产奶量。可提高母牛产奶量。2、改善食用肉的质量、改善食用肉的质量第86页，讲稿共100张，创作于星期日植物性食品原料：植物性食品原料：如如基基因因工工程程改改造造过过的的马马铃铃薯薯、大大豆豆、芥芥花花菜菜、番番茄茄等。等。二、改良微生物菌种性能二、改良微生物菌种性能第第一一个个采采用用基基因因工工程程改改造造的的食食品品微微生生物物为为面面包包酵酵母母（saccharomycescerevisiae）。）。由由于于把把具具有有优优良良特特性性的的酶酶基基因因转转移移至至该该菌菌中中，使使该该菌菌含含有有的的麦麦芽芽糖糖透透性性酶酶及及麦麦芽芽糖糖酶酶的的含