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1、课题课题1 1 菊花的组织培养菊花的组织培养大多绿色开花植物都是靠种子来繁殖的。那么，有没有不用种子来培育植物的方法呢？组织培养组织培养营养繁殖营养繁殖扦插扦插嫁接嫁接压条压条扦插扦插嫁接嫁接压条压条1.指在指在无菌条件无菌条件下，将植物的茎尖下，将植物的茎尖、茎段、茎段、或叶片等切成小块，培养在特制的培养基上，通或叶片等切成小块，培养在特制的培养基上，通过细胞的增殖与分化，使它逐渐发育成过细胞的增殖与分化，使它逐渐发育成完整的植完整的植物物的技术的技术又称：又称：植物离体培养植物离体培养一、一、植物组织培养植物组织培养离体的植物离体的植物器官、组织、器官、组织、细胞细胞脱分化脱分化愈愈伤伤组
2、组织织再分化再分化根根芽芽植植物物体体2.植物组织培养的基本过程植物组织培养的基本过程处于离体状态处于离体状态3.3.必要条件：必要条件：一定的营养物质、激素和其他一定的营养物质、激素和其他外界条件外界条件4.4.原理原理:细胞的全能性细胞的全能性A.A.外植体：外植体：从从活植物体活植物体上切下进行培养的那上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官部分细胞、组织或器官.5.5.相关概念相关概念:（原因）（原因）生物体的每一个细生物体的每一个细生物体的每一个细生物体的每一个细胞都包含有该物种胞都包含有该物种胞都包含有该物种胞都包含有该物种所特有的全套遗传所特有的全套遗传所特有的全套遗传所特有的全套
3、遗传物质，都有发育成物质，都有发育成物质，都有发育成物质，都有发育成为完整个体所必需为完整个体所必需为完整个体所必需为完整个体所必需的全部基因的全部基因的全部基因的全部基因B.B.脱分化：脱分化：由由高度分化高度分化的植物器官、组织或细的植物器官、组织或细胞产生胞产生愈伤组织愈伤组织的过程，又称去分化。的过程，又称去分化。C.C.再分化：再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化重新分化根或芽根或芽等器官的过程等器官的过程D.D.愈伤组织愈伤组织:细胞排列疏松而无规则细胞排列疏松而无规则,是是高度液高度液泡化泡化的、成无定形状态的的、成无定形状态的薄壁细胞
4、薄壁细胞.E细胞的分化细胞的分化（特征）（特征）指在生物个体发育过程中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。人参的愈伤组织人参的愈伤组织人参的愈伤组织人参的愈伤组织菠萝的愈伤组织菠萝的愈伤组织菠萝的愈伤组织菠萝的愈伤组织1.细胞分化是生物界普遍存在的一种生命细胞分化是生物界普遍存在的一种生命现象，下列叙述正确的是现象，下列叙述正确的是()细胞分化就是细胞在形态和结构上发生细胞分化就是细胞在形态和结构上发生稳定性差异的过程稳定性差异的过程分化是基因在特定的时间和空间条件下分化是基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果选择性表达的结果未离体的体细胞一般不
5、会表现出全能性未离体的体细胞一般不会表现出全能性分化过程中遗传物质会改变分化过程中遗传物质会改变abcdb2下列关于全能性的叙诉正确的是（）A酵母菌出芽生殖是全能性B花药离体培养的结果没有体现全能性。C植物细胞均具有全能型D多细胞动物细胞核具有全能性D二、影响植物组织培养的因素二、影响植物组织培养的因素：同一种植物的不同组织同一种植物的不同组织、年龄年龄、保存时间的长短保存时间的长短也会影响实验结果。也会影响实验结果。不同植物的组织培养难易程度不同不同植物的组织培养难易程度不同1、外植体的选取、外植体的选取例如，烟草和胡萝卜的组织培养较为容易，而枸杞愈伤组织例如，烟草和胡萝卜的组织培养较为容易
6、，而枸杞愈伤组织的芽诱导就比较难。因此，的芽诱导就比较难。因此，植物材料的选择直接关系到实验植物材料的选择直接关系到实验的成败。的成败。菊花的组织培养，一般选择未开花植株的茎上部新菊花的组织培养，一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。萌生的侧枝。2、培养基的配制、培养基的配制(MS培养基培养基)大量元素：大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S微量元素：微量元素：B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等3、不同植物激素使用顺序、不同植物
7、激素使用顺序使用顺序使用顺序 实验结果实验结果 先生长素，先生长素，后细胞分裂素后细胞分裂素 有利于细胞分裂但不分化有利于细胞分裂但不分化 先细胞分裂素，先细胞分裂素，后生长素后生长素 细胞既分裂也分化细胞既分裂也分化 同时使用同时使用 分化频率提高分化频率提高 口诀口诀：生前分裂不分化，生后分裂有分化，同时提：生前分裂不分化，生后分裂有分化，同时提高分化率高分化率4、不同植物激素使用量、不同植物激素使用量生长素生长素/细胞分裂素比值细胞分裂素比值结果结果 比值高时比值高时 促根分化，抑芽形成促根分化，抑芽形成 比值低时比值低时 促芽分化，抑根形成促芽分化，抑根形成 比值适中比值适中 促进愈伤
8、组织生长促进愈伤组织生长 口诀：生大根，分大芽，等愈伤口诀：生大根，分大芽，等愈伤（生大表示生长素生大表示生长素多，分大表示细胞分裂素多）多，分大表示细胞分裂素多）5、其他因素：、其他因素：pH、温度、光照等、温度、光照等不同植物对各种条件的要求不同。进行菊花组织培养不同植物对各种条件的要求不同。进行菊花组织培养一般将一般将PH控制在控制在5.8左右，温度控制在左右，温度控制在18-22并且并且每日光照每日光照12h（注：愈伤组织的形成需要避光培养，原（注：愈伤组织的形成需要避光培养，原因，有光时，愈伤组织的形成变慢）因，有光时，愈伤组织的形成变慢）6、消毒、消毒在培养的整个过程中，都需要是一
9、个无菌环境在培养的整个过程中，都需要是一个无菌环境3某同学在进行组织培养过程中，发现愈伤组织只分裂而不分化出芽和根，可能原因是（）A未见阳光B培养时间不够C培养基中的营养过多D细胞分裂素和生长素配比不对D4.美国科学家将分离得到的成熟胡萝卜根的韧皮部细胞进行培养，由单个细胞发育成完整的新植株(如下图)。请分析：(1)这种生殖方式属于_，所用的技术是_。(2)分离出来的胡萝卜根细胞成为细胞团是通过_分裂来完成的。(3)细胞团中的相同的细胞在发育成胚状体和植株过程中，形态、结构和生理功能上出现了差异，这种现象叫做细胞的_。(4)本实验说明植物细胞具有_。(5)在培养试管植物时，试管内应至少放入_种
10、矿质元素。其中应大量供给的元素是_元素。植物缺少Ca时首先受到损伤的部位是_。(幼叶/老叶)。1)无性生殖植物组织培养(2)有丝(3)分化(4)全能性(5)N、P、K、S、Ca、Mg幼叶（一）制备（一）制备MSMS固体培养基固体培养基（二）外植体消毒（二）外植体消毒（三）接种（三）接种（四）培养（四）培养（五）移栽（五）移栽（六）栽培（六）栽培二、实验操作二、实验操作二、实验操作二、实验操作（一）制备（一）制备MSMS固体培养基固体培养基MSMS培养基包括培养基包括2020多种营养成分，实验室一般多种营养成分，实验室一般使用使用4 4。C C保存配制好的培养基母液来制备保存配制好的培养基母液来
11、制备1 1、配置各种母液、配置各种母液为了避免每次配制培养基都要称量几十种成分，为了避免每次配制培养基都要称量几十种成分，减少工作量，可以将各种成分按比例配置成浓减少工作量，可以将各种成分按比例配置成浓缩液，即培养基母液，一般将常用药品配成比缩液，即培养基母液，一般将常用药品配成比所需浓度高所需浓度高1010100100倍的母液。使用时，根据倍的母液。使用时，根据浓缩比例计算用量，加水稀释浓缩比例计算用量，加水稀释无机物中大量元素浓缩无机物中大量元素浓缩1010倍，微量元素浓倍，微量元素浓缩缩100100倍，常温保存倍，常温保存激素类、维生素类以及用量较小的有机物一激素类、维生素类以及用量较小
12、的有机物一般可按般可按1mg/ml1mg/ml的质量浓度单独配制成母液的质量浓度单独配制成母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量的浓缩倍数，计算用量502 2、配置培养基、配置培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml50ml或或100ml100ml 配制培养液配制培养液配制配制1LMS1LMS培养基，先将称好的琼脂加培养基，先将称好的琼脂加800ml800ml蒸蒸馏水，加热使琼脂溶化，然后加入蔗糖馏水，加热使琼脂溶化，然后加入蔗糖30g30g，取，取配制好的大量元素、微量元素、有机物和植物激配制好的大量元素、微量元
13、素、有机物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容至素的母液，依次加入，加蒸馏水定容至1000ml1000ml 调调PHPH培养基的分装培养基的分装 由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素不必添加植物激素3 3、灭菌、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌汽灭菌1 1、选材：、选材：（二）外植体消毒（二）外植体消毒2 2、消毒、消毒流水冲洗流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20mi
14、n20min左右左右菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝 酒精处理酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为积分数为7070的酒精中摇动的酒精中摇动2 23 3次，持续次，持续6 67s7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗，立即将外植体取出，在无菌水中清洗 消毒液处理消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为放入质量分数为0.10.1的氯化汞溶液中的氯化汞溶液中1 12min2min，取出后在无菌水中至少清洗，取出后在无菌水中至少清洗3 3次，漂净次，漂净消毒液
15、消毒液（三）接种（三）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用室消毒是至关重要的。用7070的酒精或新洁尔的酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射灭搽洗工作台并用紫外线照射2020分钟分钟1 1、接种室消毒、接种室消毒2 2、无菌操作要求、无菌操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3 3、材料的切取和接种、材料的切取和接种将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。将装有培养基的锥形瓶整齐地排
16、列在酒精灯左侧。将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段（长约（长约0.5-1cm0.5-1cm）。左手持锥形瓶。右手拉开捆）。左手持锥形瓶。右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥在右手手心，以扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥在右手手心，以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰，右手用镊子夹取菊花茎段，使瓶口旋转通过火焰，右手用镊子夹取菊花茎段，放入培养基中。插入时应注意不要倒插。每瓶接放入培养基中。插入时应注意不要倒插。每瓶接种种6 68 8块外植体。接种后，将封口膜重新扎好块外植体。接种后，
17、将封口膜重新扎好4 4、接种注意事项、接种注意事项每接种一块外植体前，镊子需放入体积分每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为数为7575的酒精溶液中消毒一次，然后在酒的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3 34 4块，菊的茎或叶块，菊的茎或叶6 68 8块，也不要太少，以充块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件分利用培养基中的营养成分和光照条件插入时应注意方向，不要倒插。茎段、
18、茎尖插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分基部插入培养基利于吸收水分和养分（四）培养（四）培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒。培养温度控制在培养期间应定期消毒。培养温度控制在18-22，并且每日用日光灯光照，并且每日用日光灯光照12h。（五）移栽（五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日1 1、打开封口膜、打开封口膜2 2、清洗转移、清洗转移用流水清洗根部的培养基，用流水清洗根部的培养基，
19、将幼苗移植到消将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间生活一段时间（六）栽培（六）栽培3 3、移栽、移栽珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培透性好，适合栽培幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花况，适时浇水、施肥，直至开花三、课题延伸三、课题延伸1 1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养易进行组织培养.2 2、实例：芦荟、豆瓣绿
20、、秋海棠、月季、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季.n n植物组织培养之所以发展如此之快，应用的范围如此之植物组织培养之所以发展如此之快，应用的范围如此之植物组织培养之所以发展如此之快，应用的范围如此之植物组织培养之所以发展如此之快，应用的范围如此之广泛，是由于具备以下几个特点：广泛，是由于具备以下几个特点：广泛，是由于具备以下几个特点：广泛，是由于具备以下几个特点：n n 培养条件可以人为控制培养条件可以人为控制n组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年
21、培养生产。n n生长周期短，繁殖率高生长周期短，繁殖率高n生长较快。植株比较小，往往20-30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。n n管理方便，利于工厂化生产和自动化控制管理方便，利于工厂化生产和自动化控制n它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。本课题内容小结菊花组织培养基础知识基础知识实验操作实验操作植物体的植物体的组织培养组织培养影响组织培影响组织培养的因素养的因素细胞分化细胞分化细胞全能性细胞全能性组织培养过程组织培养过程营
22、养营养激素激素环境条件环境条件MS固体培养基制备固体培养基制备外植体消毒外植体消毒接种接种培养培养移栽移栽栽培栽培作业：作业：P36P361 1、在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒、在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作。灭菌，并且要求无菌操作。2 2、在选取菊花茎段是，为什么要选取生长旺盛的嫩枝？、在选取菊花茎段是，为什么要选取生长旺盛的嫩枝？外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。植物组织
23、培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。练习练习1 1、下图是植物组织培养的简略表示。据此回答：、下图是植物组织培养的简略表示。据此回答：（1 1）表示表示_，它能被培养成为，它能被培养成为的根本原因是的根本原因是_。（2 2）表示表示_，它与，它与相比分化程度相比分化程度_，全，全能性能性_._.（3 3）若想制成人工种子，应选用）若想制成人工种子，应选用_。（4 4）若）若是花药，则是花药，则是是_，继续对其使用，继续
24、对其使用_处理可获得处理可获得_正常植株，该过程称为正常植株，该过程称为_。（5 5）若）若是胡萝卜根尖细胞，则培养成是胡萝卜根尖细胞，则培养成的叶片的颜色为的叶片的颜色为_，这说明，这说明_。（6 6）若利用此项技术制造治疗烫伤、割伤的药物）若利用此项技术制造治疗烫伤、割伤的药物紫草素，培紫草素，培养将进行到养将进行到_。脱分化再分化答案：（答案：（1 1）离体的植物组织或器官）离体的植物组织或器官 植物细胞具有全能性植物细胞具有全能性 （2 2）愈伤组织愈伤组织 低低 高高 （3 3）（4 4）单倍体植株）单倍体植株 秋水仙素秋水仙素 纯合纯合体体 单倍体育种单倍体育种 （5 5）绿色）绿
25、色 含有表达叶绿体的基因含有表达叶绿体的基因 （6 6）练习练习2 2、基因型为基因型为AaBbAaBb的水稻（含的水稻（含2424条染色体）的花药通过无菌条染色体）的花药通过无菌操作接入试管后，在一定条件下形成试管苗，问：操作接入试管后，在一定条件下形成试管苗，问：（1 1）愈伤组织是花粉细胞不断分裂后形成的不规则的细胞团，愈）愈伤组织是花粉细胞不断分裂后形成的不规则的细胞团，愈伤组织形成过程中，必须从培养基中获得伤组织形成过程中，必须从培养基中获得_等营养物等营养物质。质。（2 2）要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有）要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有_和和_两类激素。两类激素。（3
26、3）愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和）愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和茎。这一过程必须给予光照，其原因是茎。这一过程必须给予光照，其原因是_能利用光能能利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。制造有机物，供试管苗生长发育。（4 4）试管苗的细胞核中含）试管苗的细胞核中含_条脱氧核糖核苷酸链。条脱氧核糖核苷酸链。（5 5）培育成的试管苗可能出现的基因型有）培育成的试管苗可能出现的基因型有_。答案：（答案：（1 1）水、无机盐、维生素和小分子有机物）水、无机盐、维生素和小分子有机物 （2 2）细胞分裂）细胞分裂素素 植物生长素植物生长素 （3 3）叶绿体）叶绿体 （4 4）24 24 （5 5）ABAB、aBaB、AbAb、abab