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1、第八章荧光分光光度法第八章荧光分光光度法现在学习的是第1页，共50页第八章第八章 荧光分光光度法荧光分光光度法n n分子荧光、磷光分析法的基本原理分子荧光、磷光分析法的基本原理 介绍荧光磷光光谱的产生、主要影响因素、荧光强介绍荧光磷光光谱的产生、主要影响因素、荧光强度与被测物质之间的关系度与被测物质之间的关系n n荧光分析仪器荧光分析仪器n n分子荧光定量分析分子荧光定量分析分子荧光定量分析分子荧光定量分析现在学习的是第2页，共50页 8-1 概述概述一、分子发光分析法及其分类一、分子发光分析法及其分类n n某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐某些物质的分子吸收一定能量
2、后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法立起来的分析方法为分子发光分析法立起来的分析方法为分子发光分析法立起来的分析方法为分子发光分析法较高激发态较高激发态基基 态态吸收能吸收能量受激量受激光辐射光辐射退激退激分子
3、在退激过程中以光辐射形式释放能量分子在退激过程中以光辐射形式释放能量现在学习的是第3页，共50页n n根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：以下几类：光致发光：以光源来激发而发光光致发光：以光源来激发而发光 电致发光：以电能来激发而发光电致发光：以电能来激发而发光电致发光：以电能来激发而发光电致发光：以电能来激发而发光原子发射光谱法原子发射光谱法原子发射光谱法原子发射光谱法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光-化学发光分析法
4、化学发光分析法化学发光分析法化学发光分析法荧光荧光荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法现在学习的是第4页，共50页二、分子荧光分析法的特点二、分子荧光分析法的特点1.1.灵敏度高灵敏度高n n荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度可提高荧光强度可提高荧光强度可提高荧光强度 采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低度，检测限荧光分析法比分光光度法低24个
5、个数量级数量级激发激发发射荧光发射荧光强强强强激发光激发光激发光激发光 物物物物 质质质质现在学习的是第5页，共50页2.选择性好选择性好n n不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长n n不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长n n比较容易排除其它物质的干扰，选择性好比较容易排除其它
6、物质的干扰，选择性好比较容易排除其它物质的干扰，选择性好比较容易排除其它物质的干扰，选择性好3.3.实验方法简单实验方法简单实验方法简单实验方法简单4.待测样品用量少待测样品用量少待测样品用量少待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广；仪器价格适中；测定范围较广n n具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。品分析、卫生检疫等领域。n n荧光法比磷光法应用广泛。荧光法比磷光法应用广泛。荧光法比磷光法应用广泛。荧光法比磷光法应用广
7、泛。现在学习的是第6页，共50页 8-2 荧光和磷光光谱法荧光和磷光光谱法一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生n n具有不饱和基团的基态分子光照后，具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁价电子跃迁产产生荧光和磷光生荧光和磷光 基态分子基态分子 价电子跃迁到激发态价电子跃迁到激发态光照激发光照激发去激发光去激发光 *n基基基基 态态态态现在学习的是第7页，共50页1.电子自旋状态的多重性电子自旋状态的多重性n n大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方大多数
8、分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的向总是相反的向总是相反的向总是相反的 ，处于基态单重态。用，处于基态单重态。用，处于基态单重态。用，处于基态单重态。用“S S0 0”表示表示表示表示 ；当物质受光；当物质受光；当物质受光；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至更高由基态跃迁至更高由基态跃迁至更高由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，的单重态，电子
9、自旋方向没有改变，的单重态，电子自旋方向没有改变，的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋净自旋净自旋净自旋 =0=0.这种跃迁是符合这种跃迁是符合这种跃迁是符合这种跃迁是符合光谱定律的。光谱定律的。光谱定律的。光谱定律的。基态单重态 S0第一激发单重态 S1S S0 0,S1 1,S,S2 2,S3 3分别代表基态分别代表基态,第一第一第一第一,二二二二,三激发单重态三激发单重态三激发单重态三激发单重态单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8现在学习的是第8页，共50页n n若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态若分子中电子跃迁过
10、程中伴随着自旋方向的改变，由基态若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单重态单重态单重态单重态激发三重态，净自旋激发三重态，净自旋激发三重态，净自旋激发三重态，净自旋 0。这种跃迁为禁阻跃迁。这种跃迁为禁阻跃迁 T1、T2、T T3分别表示第一、二、三激发三重态分别表示第一、二、三激发三重态分别表示第一、二、三激发三重态分别表示第一、二、三激发三重态 基态单重态基态单重态 S0第一激发三重态第一激发三重态 T1自旋平行自旋平行三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为10-41S现在学习的是
11、第9页，共50页n n分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激2.2.无辐射去激无辐射去激无辐射去激无辐射去激不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热的
12、形式不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热的形式不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热的形式不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热的形式释放。包括：释放。包括：释放。包括：释放。包括：n n内部转换（内部转换（内部转换（内部转换（ICIC）相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换 S-SS-Sn n系间窜跃（系间窜跃（系间窜跃（系间窜跃（ISCISC）不同的多重态之间的转换不同的多重态之间的转换不同的多重态之间的转换不同的多重态之间的转换 S-T S-T n n振动驰豫（振动驰豫（振动驰豫（振
13、动驰豫（VRVR）同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程n n外部转移外部转移外部转移外部转移指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消灭荧光或磷光强度减弱或消灭荧光或磷光强度减弱或消灭荧光或磷光强度减弱或消灭n n发生系间窜跃电子需
14、转向，发生系间窜跃电子需转向，发生系间窜跃电子需转向，发生系间窜跃电子需转向，S S1 1TT1 1间进行，比内部转换困难间进行，比内部转换困难间进行，比内部转换困难间进行，比内部转换困难 现在学习的是第10页，共50页T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃现在学习的是第11页，共50页3.荧光和磷光光谱的产生荧光和磷光光谱的产生辐射去激辐射去激n n处于处于处于处于S S1 1或或或或T T1 1态的电子返回态的电子返回态的电子返回态的电子返回S S0 0态时，伴随有发光现象，这种过程态时，伴随有发光
15、现象，这种过程态时，伴随有发光现象，这种过程态时，伴随有发光现象，这种过程叫辐射去激叫辐射去激叫辐射去激叫辐射去激 S1或或或或T T1 1 S S0 发光（1 1）荧光：）荧光：）荧光：）荧光：当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单重态S S1 1的最低振动能级回到基态的最低振动能级回到基态的最低振动能级回到基态的最低振动能级回到基态S S0 0各振动能级所各振动能级所各振动能级所各振动能级所产生的光辐射叫荧光产生的光辐射叫荧光产生的光辐射叫荧光产生的光辐射叫荧光n n 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生
16、速度快，荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，1010-9-91010-6-6s s，又叫，又叫，又叫，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭n n 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量后无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量后无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量后无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量
17、后到到到到S S1 1的最低振动能级，发射荧光，荧光波长比激发光波长长。的最低振动能级，发射荧光，荧光波长比激发光波长长。的最低振动能级，发射荧光，荧光波长比激发光波长长。的最低振动能级，发射荧光，荧光波长比激发光波长长。荧荧荧荧 激激激激现在学习的是第12页，共50页T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光图图5-1 分子荧光光谱产生过程示意图分子荧光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃现在学习的是第13页，共50页（2）磷光）磷光n n当当当当受激电子降到受激电子降到受激电子降到受激电子降到S S1 1的最低
18、振动能级后，未发射荧光，而是经过系的最低振动能级后，未发射荧光，而是经过系的最低振动能级后，未发射荧光，而是经过系的最低振动能级后，未发射荧光，而是经过系间窜跃到间窜跃到间窜跃到间窜跃到T T1 1振动能级，经振动驰豫到振动能级，经振动驰豫到振动能级，经振动驰豫到振动能级，经振动驰豫到 T T1 1最低振动能级，从最低振动能级，从最低振动能级，从最低振动能级，从T T1 1最低最低最低最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光n n从从从从T T1
19、1 S S1 1要改变电子自旋，发光速度慢，约为要改变电子自旋，发光速度慢，约为要改变电子自旋，发光速度慢，约为要改变电子自旋，发光速度慢，约为 1010-4-4 10s 10s，光，光，光，光照停止后，磷光仍可持续一段时间照停止后，磷光仍可持续一段时间照停止后，磷光仍可持续一段时间照停止后，磷光仍可持续一段时间n n分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长n n 磷磷 荧荧 激激激激 *易产生荧光易产生荧光 n n *易产生磷光易产生
20、磷光现在学习的是第14页，共50页T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光 磷光磷光图图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图分子荧光、磷光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃VR现在学习的是第15页，共50页二、荧光、磷光与分子结构的关系二、荧光、磷光与分子结构的关系n n了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，在什么条件下产生，以及发
21、射的荧光有什么特征以便更好地在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么特征以便更好地在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么特征以便更好地在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体（一）荧光效率（
22、一）荧光效率（一）荧光效率（一）荧光效率 n n荧光强度常用荧光量子效率荧光强度常用荧光量子效率 f f 来描述来描述 荧光量子效率荧光量子效率 f f=发荧光的分子数发荧光的分子数激发态分子总数激发态分子总数 f 是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力，发射荧光的能力，f 越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在0101之间之间现在学习的是第16页，共50页n n若以各种跃迁速率常数来表示若以各种跃迁速率常数来表示n nKf 为荧光发射过程的速率常数为荧光发射过程的速率常数取决于取决于物质的化学结构物质的化学结构n nKi 为非辐射
23、跃迁的速率常数之和为非辐射跃迁的速率常数之和主要主要取决于化学环境，也与化学结构有关取决于化学环境，也与化学结构有关n n分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在率在0.11之间之间现在学习的是第17页，共50页n n至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描述荧光至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描述荧光至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描述荧光至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描述荧光与分子结构之间的关系与分子结构之间的关系与分子结构之间的关系与分子结构之间的关系n n一般情况，一般情况，一般情况，一般情况，有机芳香族化合物及金
24、属离子配合物有机芳香族化合物及金属离子配合物是最强是最强是最强是最强最有用的荧光体最有用的荧光体最有用的荧光体最有用的荧光体（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系n n物质只有吸收了紫外可见光，产生物质只有吸收了紫外可见光，产生物质只有吸收了紫外可见光，产生物质只有吸收了紫外可见光，产生 *n *跃迁，跃迁，跃迁，跃迁，产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光n n *与与与与n n *跃迁相比，摩尔吸收系数大跃迁相比，摩尔吸收系数大跃迁相比，摩尔吸收系数大跃迁相比，摩尔吸收系数大10102 2103，寿，寿命短命短n n *跃迁常产生较强的荧光，跃迁常产生较强的荧光
25、，跃迁常产生较强的荧光，跃迁常产生较强的荧光，n n *跃迁产生的荧光跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光现在学习的是第18页，共50页1.共轭体系共轭体系有较强的荧光有较强的荧光有较强的荧光有较强的荧光n n具有共轭体系的芳环或杂环化合物，具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度电子共轭程度越大，越易产生荧光越大，越易产生荧光;环越多，共轭程度越大，产生环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强荧光波长越长，发射的荧光强度越强 f f ex ex/nm/nm emem/nm/nm 0.11 205 278 0.29 286
26、 3100.46 365 400苯苯萘萘蒽蒽 350菲菲线状环结构比非线状结线状环结构比非线状结构的荧光波长长构的荧光波长长现在学习的是第19页，共50页 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光数能发生荧光 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定定 3，4-苯并苯并芘是强致癌物芘是强致癌物 ex ex=386 nm em=430 nm现在学习的是第20页，共50页2.刚性平面结构较稳定的平面结构n n具有强荧光的分子多数有刚性平面结构具有强荧光的分子多数有刚性平面结构荧光素：氧桥把两个荧光素：氧桥把两
27、个环固定在一个平面上，环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧具有平面结构，强荧光物质光物质酚酞：无氧桥把两酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很个环固定，不能很好的共平面，为非好的共平面，为非荧光物质荧光物质现在学习的是第21页，共50页例 1，2-二苯乙烯二苯乙烯反式：平面构型 强荧光体顺式：非平面构型 非荧光体现在学习的是第22页，共50页（三）金属螯合物的荧光（三）金属螯合物的荧光n n大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定的测定n n不少有机配体是弱
28、荧光体不少有机配体是弱荧光体不少有机配体是弱荧光体不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与或不发荧光，但与或不发荧光，但与或不发荧光，但与Mn+形成螯形成螯形成螯形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光n n例：例：例：例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+n+Al3+3+、MgMg2+2+形形形形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强成螯合物后，能形成刚性结构，荧
29、光加强现在学习的是第23页，共50页（四）取代基的类型（四）取代基的类型n n取代基对荧光物质的荧光特征和强取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：度也有很大影响。分成三类：（1 1）增强荧光的取代基）增强荧光的取代基 有有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等给电子基团等给电子基团n n由于基团的由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云与电子（孤对电子）的电子云与苯环上的苯环上的 轨道平行，共享了共轭轨道平行，共享了共轭 电子，电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强度增强现在学习的是第24页，共50页（2 2）减弱荧光
30、的取代基）减弱荧光的取代基 -COOH、-NO-NO2 、-COOR、-NO-NO、-SH-SH 吸电子基团吸电子基团,使荧光波长短移，荧使荧光波长短移，荧使荧光波长短移，荧使荧光波长短移，荧光强度减弱光强度减弱光强度减弱光强度减弱芳环上被芳环上被F、Cl、BrBr、I I 取代后，使系间窜跃加强，取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。（3 3）影响不明显的取代基）影响不明显的取代基 -NH -NH3 3+、-R-R、-SO-SO
31、3HH等等等等现在学习的是第25页，共50页三、环境对荧光的影响三、环境对荧光的影响 1.1.溶剂的影响溶剂的影响 同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质同的荧光性质 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大荧光强度增大 2.温度的影响温度的影响低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度 因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而
32、非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大现在学习的是第26页，共50页3.pH的影响n n大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液质受溶液pHpH的影响很大的影响很大n n共
33、轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长各自的荧光效率和荧光波长例：例：苯酚苯酚离子化后，离子化后，荧光消失荧光消失pH1有有荧光荧光pH13无无荧光荧光现在学习的是第27页，共50页n n但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光形式无荧光，离子化后显荧光形式无荧光，离子化后显荧光形式无荧光，离子化后显荧光例：例：苯酚苯酚有荧光有荧光无荧光无荧光另外
34、，表面活性剂也会影响荧光强度和特性现在学习的是第28页，共50页四、荧光强度与荧光物质浓度的关系四、荧光强度与荧光物质浓度的关系n n用强度为用强度为用强度为用强度为I I0 0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度生荧光，荧光强度生荧光，荧光强度生荧光，荧光强度If 用仪器测得，在荧光浓度很稀用仪器测得，在荧光浓度很稀用仪器测得，在荧光浓度很稀用仪器测得，在荧光浓度很稀 (A(A0.05)时，荧光物质发射的荧光强度时，荧光物质发射的荧光强度I If 与浓度有下与浓
35、度有下面的关系面的关系n nIf f=f f Ia a=f f（I0-I-I）I Ia a为吸收的辐射强度为吸收的辐射强度为吸收的辐射强度为吸收的辐射强度I I0 0为入射光强度为入射光强度为入射光强度为入射光强度荧光池I I0 0I IIf荧光强度检测器n n I If f=f（I0-I0 01010-A-A）=f f I I0 （1 1-10-10-A-A ）I=I0 01010-A将上式展开现在学习的是第29页，共50页 当当当当A 0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不时，方括号中其它各项与第一项
36、相比可忽略不计，上式简化计，上式简化计，上式简化计，上式简化 If=2.3 =2.3 f I I0A A =2.3 =2.3 f I0 bcbc当当A 0.05时，时，If f与与 f、I0 0、和和c c 有关，对一给定物有关，对一给定物质，当激发光波长和强度一定时，质，当激发光波长和强度一定时，f f、I0 0、和和和和b b为为为为常数，合并为常数，合并为常数，合并为常数，合并为K If=KC Ip=KC定量分析依据定量分析依据定量分析依据定量分析依据现在学习的是第30页，共50页n n荧光强度与物质浓度呈线形关系，荧光强度与物质浓度呈线形关系，If=KC只只有在浓度低时使用，荧光物质测
37、定的是微有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高量或痕量组分，灵敏度高n n浓度高时，浓度高时，If与与C不呈线形关系，有时不呈线形关系，有时C增增大，大，If反而降低因为公式反而降低因为公式 中后面影响，中后面影响，有时发生荧光猝灭效应有时发生荧光猝灭效应现在学习的是第31页，共50页n n荧光猝灭荧光猝灭 荧光物质与溶剂或其它物质之间荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降下降或荧光效率或荧光效率 f 下降称为荧光猝灭。下降称为荧光猝灭。n n使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭
38、剂n n氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂物等都是常见的荧光猝灭剂n n碰撞猝灭碰撞猝灭 M+激激 M*M*+Q M+Q+热热n n自熄灭自熄灭荧光物质发射的荧光被荧光物荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象质的基态分子所吸收，即自吸收现象现在学习的是第32页，共50页 荧光分析仪器荧光分析仪器主要由光源、单色器、液槽、主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成检测器和显示器组成光源第一单色器液池检测器第二单色器检测器放大器及记录器 ex ex em与分光光度计有两点不同与分光光度计有两点不同两个单色器两个单色
39、器检测器与激发光互成直角检测器与激发光互成直角I0I五、荧光分析仪器五、荧光分析仪器现在学习的是第33页，共50页1、光源、光源n n激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽射强度；适用波长范围宽n n荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源n n荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的光
40、源；常用其发射光源；常用其发射365 nm365 nm、405 nm405 nm、436 nm 436 nm 三条谱线三条谱线三条谱线三条谱线以以365 nm 365 nm 的谱线最强的谱线最强应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm很强的连续光源很强的连续光源现在学习的是第34页，共50页2、单色器n n荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱不能获得光谱n n大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器
41、，有较高的大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱光光谱光光谱光光谱n n第一单色器作用：第一单色器作用：第一单色器作用：第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长佳激发波长 ex，用此激发光激发液池内的荧光物质，用此激发光激发液池内的荧光物质，用此激发光激发液池内的荧光物质，用此激发光激发液池内的荧光物质 exexn n第二单色器作用：第二单色器作用
42、：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长扰光，用来选择测定用的荧光波长 em。在选定的在选定的 emem 下测定荧光强度，定量分析下测定荧光强度，定量分析现在学习的是第35页，共50页3、样品池、样品池、样品池、样品池n n盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边只能用手拿棱或最上边只能用手拿棱或最上边只能用手拿棱或最上边4、检测器、检测器n n把光信号转化成电信号
43、把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号,放大放大,直接转成荧光强度直接转成荧光强度n n荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管荧光光度计采用光电倍增管n n荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可强度与激发光强度成正比，
44、提高激发光强度可 大大提高大大提高大大提高大大提高荧光强度荧光强度荧光强度荧光强度5、读出装置、读出装置n n记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱射光谱现在学习的是第36页，共50页（二）激发光谱和荧光、磷光光谱（二）激发光谱和荧光、磷光光谱n n荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定光谱确定光谱确定光谱确定激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体激发光谱是在固定荧光
45、波长下，测量荧光体激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱的荧光强度随激发波长变化的光谱的荧光强度随激发波长变化的光谱的荧光强度随激发波长变化的光谱I exex固定固定 em em 荧光波长荧光波长荧光波长荧光波长获得方法：先把第二单色器的波长固获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的定，使测定的 emem不变，改变第一单不变，改变第一单色器波长，从色器波长，从200700 nm 200700 nm 扫描，让扫描，让扫描，让扫描，让不同波长的光照在荧光物质上，测定不同波长的光照在荧光物质上，测定不同波长的光照在荧光物质上，测
46、定不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以它的荧光强度，以它的荧光强度，以它的荧光强度，以I 为纵坐标，为纵坐标，exex为为横坐标得左图，即荧光物质的激发横坐标得左图，即荧光物质的激发光谱光谱从曲线上找出从曲线上找出 exex，实际上选波长较长的高波长峰，实际上选波长较长的高波长峰现在学习的是第37页，共50页I emem固定固定 ex 激发光波长激发光波长激发光波长激发光波长获得方法：先把第一单色器获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的的波长固定，使激发的 exex不不不不变，改变第二单色器波长，变，改变第二单色器波长，变，改变第二单色器波长，变，改变第二单色器波长，让不同波
47、长的光扫描，测定让不同波长的光扫描，测定让不同波长的光扫描，测定让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以它的发光强度，以它的发光强度，以它的发光强度，以I I 为纵坐为纵坐为纵坐为纵坐标，标，标，标，emem为横坐标得左图，为横坐标得左图，为横坐标得左图，为横坐标得左图，即荧光物质的发射光谱即荧光物质的发射光谱即荧光物质的发射光谱即荧光物质的发射光谱 从曲线上找出最大的从曲线上找出最大的从曲线上找出最大的从曲线上找出最大的 emem现在学习的是第38页，共50页n n从图中看出从图中看出n n 磷磷 荧荧 激激图吸收峰荧光峰磷光峰现在学习的是第39页，共50页六、六、荧光分析及应用荧光分析及应
48、用（一）定量分析方法（一）定量分析方法 定量分析依据定量分析依据定量分析依据定量分析依据 If f=KC Ip p=KC=KC1.标准曲线法标准曲线法最常用的定量分析方法最常用的定量分析方法n n将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。n n以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标横坐标浓度浓度 C C1 1 C2 2 C3 3 C4 C C5 Cx Cx荧光强度荧光强度荧光强度荧光强度 If1 If2f2 I If3
49、f3 If4 If5f5 If fx x I If If fxCxC现在学习的是第40页，共50页2.荧光猝灭法荧光猝灭法n n把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性n n若荧光物质若荧光物质若荧光物质若荧光物质 M M 与猝灭剂与猝灭剂与猝灭剂与猝灭剂 Q Q 生成不发荧光的基态配合物生成不发荧光的基态配合物生成不发荧光的基态配合物生成不发荧光的基态配合物MQMQ M+Q=MQ M+Q=MQ（非荧光物质）（非荧光物质）（非荧光物质）
50、（非荧光物质）经推导得出：经推导得出：经推导得出：经推导得出：猝灭剂加入前的荧光强度猝灭剂加入后试液的荧光强度常数猝灭剂浓度I I前前/I后后与与与与C C（QQ）有线性关系，可求猝灭剂含量）有线性关系，可求猝灭剂含量）有线性关系，可求猝灭剂含量）有线性关系，可求猝灭剂含量现在学习的是第41页，共50页n n与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分别加入与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分别加入与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分别加入与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分别加入一系列不同量的猝灭剂一系列不同量的猝灭剂一系列不同量的猝灭剂一系列不同量的猝灭剂 Q Q，配成一个