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1、基因克隆背景简介基因克隆背景简介March 23,20231 TA克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆缺点：连接效率低 耗时较长 需要特定限制性酶切位点第1页/共32页In-Fusion克隆产品克隆产品March 23,20232 Clontech专利In-Fusion HD Cloning System任意载体任意基因片段这是一款让您随心所欲地实现基因定向克隆的产品！第2页/共32页In-FusionIn-Fusion 基因克隆特点基因克隆特点3 第3页/共32页主要内容主要内容March 23,20234 2In-Fusion优点及应用实例3In-Fusion系列产品介绍4常见问答1In-Fus
2、ion克隆技术的原理第4页/共32页March 23,20235 主要内容2In-Fusion优点及应用实例3In-Fusion系列产品介绍4常见问答1In-Fusion克隆技术的原理第5页/共32页In-FusionIn-Fusion 基因克隆技术原理示意基因克隆技术原理示意图图In-Fusion专利酶Clontech专利In-Fusion是一种快速、简单、高效的基因克隆技术！50，15 min单管反应6 第6页/共32页March 23,20237 主要内容2In-Fusion优点及应用实例3In-Fusion系列产品介绍4常见问答1In-Fusion克隆技术的原理第7页/共32页In-F
3、usionIn-Fusion 克隆技术的优点克隆技术的优点March 23,20238 不附加任何多余序列2不受限制性内切酶酶切位点的限制3可同时克隆两个或多个DNA片段 41简便、快速、高效的克隆技术第8页/共32页简便、快速、高效的克隆技术简便、快速、高效的克隆技术March 23,20239 快速！第9页/共32页March 23,202310 In-Fusion HD无论是克隆长基因片段还是克隆多个基因片段都能保持较高的克隆效率。高效！简便、快速、高效的克隆技术第10页/共32页不附加任何多余序列不附加任何多余序列March 23,202311 线性化载体任意载体克隆位点目的DNA片段
4、不需要的碱基序列引物设计PCR扩增与载体相同的15 个碱基 序列In-Fusion连接反应15 min 不附加任何多余序列的重组载体无缝克隆：不附加任何多余序列ABC第11页/共32页不受限制性内切酶酶切位点的限制不受限制性内切酶酶切位点的限制March 23,202312 In-Fusion克隆不受限制性内切酶酶切位点的限制:在cDNA序列中插入内含子,荧光蛋白基因 在cDNA序列添加UTRs 转换纯化标签例如Myc 转换为His 缺失蛋白表达区域表达载体选择插入位点PCR扩增纯化目的DNA片段混合In-FusionIn-Fusion引物设计PCR扩增 重组载体第12页/共32页可同时克隆两
5、个或多个可同时克隆两个或多个DNADNA片段片段March 23,202313 Step 2:目的DNA片段扩增Step 3:一次In-Fusion连接反应Step 1:制备线性化载体片段1片段2片段3线性化载体重组载体第13页/共32页克服传统克隆技术的限制克服传统克隆技术的限制March 23,202314 克服其它克隆技术的限制其它克隆技术的限制In-Fusion解决方案载体的限制 不同克隆试剂盒都需要与之匹配的载体必须使用提供的载体只要载体末端和插入片段末端具有15个同源碱基，In-Fusion就可以将任意PCR片段插入任意线性化载体中。必须进行限制性内切酶酶切和连接需要独一无二、兼容
6、的酶切位点极少的合适酶切位点In-Fusion不受限制性酶切位点的限制，因此在目的片段及使用的载体中是否存在合适的酶切位点并不妨碍克隆。亚克隆繁琐多片段不能同时克隆In-Fusion能够在一次反应中同时克隆多个片段，无需进行亚克隆。对于大片段克隆效率较低对于插入片段有限制In-Fusion系统能够高效克隆0.05-15 kb DNA片段。非定向克隆需要筛选目的片段插入方向 正确的克隆In-Fusion是基因定向克隆技术，因此无需进行目的基因片段正确插入的克隆的筛选。会附加多余碱基序列In-Fusion是无缝克隆：不附加任何多余碱基序列。不适合中型和大规模克隆工程In-Fusion技术已经成功用
7、于多项高通量克隆工程。第14页/共32页In-FusionIn-Fusion 克隆技术的应用克隆技术的应用March 23,202315 多片段克隆构建载体模型插入突变位点高通量克隆第15页/共32页March 23,202316 应用实例实例：多个DNA片段（1 kb,2 kb,3 kb)同时克隆【方法】使用TaKaRa高品质PCR酶分别扩增1 kb、2 kb、3 kb的目的DNA片段 和2.7 kb的载体，并将扩增产物混合，使用In-Fusion HD试剂盒完成 克隆。利用高效率的感受态细胞StellarTM Competent Cells（产品编 号：636763）转化并进行蓝/白斑筛选
8、。第16页/共32页引物设计及目的基因片段扩增引物设计及目的基因片段扩增March 23,202317 引物的5末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列引物的3末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列第17页/共32页载体线性化载体线性化March 23,202318 PCR扩增酶切处理第18页/共32页In-FusionIn-Fusion连接反应连接反应March 23,202319 In-Fusion专利酶线性化载体目的基因片段反应液直接转化In-Fusion连接反应50 15 min【结果】Cloning Enhancer处理，37 15 min，80 15 min 第19页/共
9、32页引物设计原则引物设计原则引物的5末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列引物的3末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列March 23,202320 第20页/共32页引物设计原则引物设计原则March 23,202321 第21页/共32页引物设计网络工具引物设计网络工具March 23,202322 在线支持工具第22页/共32页March 23,202323 主要内容2In-Fusion优点及应用实例3In-Fusion系列产品介绍4常见问答1In-Fusion克隆技术的原理第23页/共32页产品列表产品列表March 23,202324 第24页/共32页基础款相关产品
10、基础款相关产品March 23,202325 5X In-Fusion HD Enzyme Premix pUC19 Control Vector,linearized(50 ng/l)2 kb Control Insert(40 ng/l)In-Fusion HD Cloning Kit（639648/49/50)组分第25页/共32页附带附带Cloning Enhancer的相关产的相关产品品March 23,202326 Cloning Enhancer的作用：消除PCR反应液中的引物二聚体和dNTP等的影响无需对PCR产物进行胶纯化操作简单In-Fusion HD Cloning Ki
11、t w/Cloning Enhancer(639633/34/35)第26页/共32页March 23,202327 Up to 5X Higher Efficiency未经处理Cloning Enhancer处理Cloning Enhancer的实用例第27页/共32页March 23,202328 主要内容2In-Fusion优点及应用实例3In-Fusion系列产品介绍4常见问答1In-Fusion克隆技术的原理第28页/共32页In-Fusion Kit In-Fusion Kit 常见问答常见问答March 23,202329 Q1.如何选择PCR酶？A1.可以使用任何PCR酶。由于
12、科研人员进行克隆表达的实验较多，我们推荐使用高保真的PCR酶。Q2.载体和插入的DNA片段末端结构有限制吗？A2.没有特别的限制。无论是平滑末端、粘性末端或者末端有无A尾均可 进行有效的连接反应。Q3.载体和插入的DNA片段的长度有限制吗？A3.没有特别的限制。载体和插入的DNA片段即使超过10 kb也可以进 行连接反应，只是连接效率会有所降低。插入的DNA片段只要不少 于50 bp就可进行有效的连接反应。Q4.线性化载体末端是否需要进行去磷酸化处理？A4.线性化载体末端磷酸基团的存在与否不会影响In-Fusion连接效率。因此，不需要对线性化载体进行去磷酸化处理。第29页/共32页技术支持技术支持March 23,202330：800-810-6261；/86：我们将竭诚为您服务！第30页/共32页Thank You！March 23,202331 3Q！第31页/共32页感谢您的观看！第32页/共32页