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1、第四章酶的生物有机化学第1页，此课件共69页哦酶是生物催化剂v酶是生物活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子v酶的分类：v按结构：蛋白酶、核酸酶。v按来源：天然酶、人工模拟酶、杂化酶。v按功能：氧化酶、水解酶、还原酶、甲基化酶等。第2页，此课件共69页哦酶的催化特性v高效率：能催化自然条件下难以进行的反应 能使复杂的反应有序可控进行 能使生物有机化学反应在常温常压和水介质中进行。能使反应速率提高1061012倍第3页，此课件共69页哦高选择：v反应专一性：只催化一种或一类化学反应。如蛋白水解酶v底物专一性：只作用于一种或一类结构与性质相似的物质。结构专一性：绝对专一性：只作用于特定的底物。如脲
2、酶 相对专一性：作用于一类化学键。如胰凝乳蛋白酶 立体专一性：专一性地与手性底物结合并催化其反应。如胰蛋白酶、淀粉酶等 几何专一性：只催化某种几何异构体底物的反应。如延胡索水解酶。第4页，此课件共69页哦遵守米氏(Michaelis-Menten)方程v：在底物低浓度时，反应速率与底物浓度成正比表现为一级反应特征：v当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速率达到最大值此时再增加底物浓度，反应速率不再增加，表现为零级反应。vKm为米氏常数第5页，此课件共69页哦影响酶催化特性的因素v酶分子的结构 活性部位：包括结合部位 与催化部位。结合部位：决定酶的专一性。在空间形状和氨基酸残基
3、组成上有利于与底物形成复合物，起到固定底物，使底物中参加化学变化的反应基团相互接近并定向，从而使反应具有分子内反应特点。催化部位：决定酶的高效性。其作用是使底物的价键发生形变或极化，起到将底物激活和降低过渡态活化能作用。调控部位：可以与底物以外的其他分子发生某种程度的结合，从而引起酶分子空间构型的变化，对酶起到激活或抑制作用。第6页，此课件共69页哦酶与底物的相互作用v静电引力：正负带电基团的相互作用。v氢键：酶与底物含有大量能形成氢键的基团。v疏水键：按相似相溶原则，蛋白质分子中含有大量的亲水性和疏水性基团。疏水性基因常常趋向于形成疏水核心。酶分子的活性中心部位，相对处于一定程度的疏水环境。
4、活性中心的疏水键不仅具有维持活性中心空间结构稳定性的重要作用，而且也是和底物分子中疏水部分结合的重要作用力之一。第7页，此课件共69页哦邻基参与和定向效应v分子内反应与分子间反应具有很大的速度差异。K1=0.0018s-1第8页，此课件共69页哦与过渡状态的结合作用v酶与反应过渡状态的亲和能力远大于酶与底物或产物的亲和能力v这种亲和力使过渡态能量降低，反应速度加快。第9页，此课件共69页哦多功能催化作用v酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用，从而使底物达到最佳反应状态。第10页，此课件共
5、69页哦手性选择结合第11页，此课件共69页哦酶的非蛋白成分v辅酶v与酶蛋白结合在一起协同实施催化作用的有机小分子称辅酶。v结构与功能的关系：氧化还原、转移v作用特点：直接参与反应，种类少，各具特殊功能，可与不同的蛋白结合形成不同的全酶。v与维生素的关系：大部分辅酶的前体是维生素，主要是水溶性的B族维生素。第12页，此课件共69页哦酶中金属离子v金属酶：v酶蛋白与金属离子以配位键形式紧密结合。金属离子作为金属酶中的辅助因子，起传递电子、原子和官能团作用。v金属激活酶：v酶从溶液中结合某些金属离子而激活。常为碱金属和碱土金属，结合较松散，对酶有一定选择性。第13页，此课件共69页哦酶的催化作用机
6、制v催化机理：v通过形成新的反应途径降低反应活化能。第14页，此课件共69页哦酶催化反应机制类型v酸碱催化v广义酸碱催化是通过质子酸碱提供或接受质子的作用来降低反应活化能。第15页，此课件共69页哦第16页，此课件共69页哦 许多酶促反应同时包括了广义酸和广义碱的催化过程结构研究(包括应用x衍射技术等)证明，RNase A活性中心含有两个His残基(His12和Hisl19)，这两个His的咪唑基作为广义的酸和碱在催化过程中起着重要作用。第一步：His12作为一个广义碱，从RNA核苷酸残基的2oH中接受一个质子，从而促使2oH基上的氧原子亲核进攻相邻的磷原子。而Hisl19则作为一个广义的酸促
7、进了35磷酸酯键的断裂并形成23环磷酸酯中间产物。第二步：23环磷酸酯中间产物，可以通过与第步反应相反的过程，水解生成3磷酸酯产物，而在这一步中，His12起广义酸作用，His119起广义碱作用而酶本身则恢复到原来的状态。第17页，此课件共69页哦共价催化v催化剂与底物形成共价产物，降低活化能，提高反应速度。v亲核共价催化：v催化剂的亲核基团对底物进行亲核进攻形成活性中间体。v亲电共价催化：v催化剂的亲电基团对底物进行亲电进攻形成活性中间体。亲电基团可为非蛋白如金属离子。v形成活性中间体是共价催化剂的关键。vLys的-NH2可以起伯胺类似的反应。第18页，此课件共69页哦金属离子的催化作用v电
8、荷稳定作用：作为Lewis酸，具有高于1价的正电荷，在中性pH下高浓度存在，金属往往比质子酸更强的酸催化作用。v提高水的亲核共价催化作用：金属离子与水中的OH共价结合，提高了水的亲核催化性能。第19页，此课件共69页哦v电荷屏蔽作用：v多种激酶的底物是Mg2+-ATP复合物，金属离子屏蔽磷酸基的负离子。v电子传递中间体：v氧化还原酶中的铁、铜离子可传递电子。第20页，此课件共69页哦丝氨酸蛋白酶水解机制v 丝氨酸蛋白水解酶是一大类蛋白水解酶的总称。这类酶的特征是酶的活性中心都含有ser残基，并具有相似的催化作用机制。v胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶都属于消化酶系。它们在胰腺胞内合成，并分泌
9、到十二指肠中。这几种酶都能催化肽链的水解反应，仅对肽键的选择性有所不同。第21页，此课件共69页哦水解作用的动力学模型以乙酸对硝基苯酚酯酶促水解为模型动力学研究表明，本反应过程具有两相特征(1)快速反应相：水解产物对硝基苯酚离子快速形成，并与活性酶的量成正比。(2)恒态反应相：水解产物对硝基苯酚离子以一种比较慢的，但是恒定的速率形成。反应速率大小与底物浓度无关。这是决定反应速率的步骤。第一阶段酶和底物快速结合并作用，释放出对硝基苯酚离子同时形成共价结合的乙酰基酶中间体。第二阶段是乙酰基酶慢速水解反应，释放出乙酰基。出于这步反应速率慢，使反应体系中酶有效浓度大大下降，因而使整个酶促反应速率也显著
10、下降。决定肽键水解速度的步骤是第一步。第22页，此课件共69页哦酶活性中心重要催化活性基团的测定v(1)活性Ser的测定：v二异丙基磷酸氟（DIPF)能特异性地与活性中心Ser的一OH基反应：v反应结果导致酶的不可逆失活。而其他非活性中心的Ser残基则不发生上述反应。应用这一方法已经确定胰凝乳蛋白酶中的ser195是酶活性中心的活性氨基酸残基。DIPF第23页，此课件共69页哦(2)活性His的测定：胰凝乳蛋白酶活性中心的His57是另一个重要的催化活性基团。TPCK能够特异性地与胰凝乳蛋白酶中的His残基结合。本反应可以被-苯基丙酸抑制。因为TPCK具有类似结构。TPCK也不能与DIP胰凝乳
11、蛋白酶中心的His57作用。表明胰凝乳蛋白酶的活性中心已被DIP基团占据。第24页，此课件共69页哦x衍射方法测定酶的空间结构v 用x衍射方法已经分别测定了胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶的结构。它们的空间结构有许多相似之处。基本催化活件基团ser159和His57都位于底物结合部位，并且都与另外一个活性基因Asp302相接近。这二个氨基酸残基通过氢键形成了一个“催化三元区”第25页，此课件共69页哦催化作用机制v(1)形成一个四面体结构的中间物：v 胰凝乳蛋白酶催化肽键水解的反应基本上是按共价催化机制进行的。反应的第一步是酶中Ser195的羟基与His57咪唑基的亲核N原子形成氢键，增强了
12、羟基的亲核性能。ser195的羟基对底物肽键的酰基做亲核进攻然后形成一个Michaelis复合物包括Ser195羟基、底物酰基、氨基在内的一个共价四面体中间物。Asp102的作用是不容忽视的，当用Asn取代Asp102时(用定点基因突变技术)发现，虽然酶与底物结合情况变化不大(Km值在中性条件下几乎不变)，但催化活性只及原酶的005%.第26页，此课件共69页哦(2)形成酰基酶中间物：反应的第二步是四面体中间物分解形成另一个中间物酰基酶中间物，并伴随着cN键断裂的过程：推动这 步反应的作用力主要来自His57中N3给出质子的能力。第27页，此课件共69页哦（3）酰基酶中间物解离：酰基酶中间体解
13、离过程中，His57作为广义酸起催化作用。第28页，此课件共69页哦(4)酶活性中心Asp102，His57和Ser195的三元催化体系；第29页，此课件共69页哦(5)酶的活性中心与底物过渡状态的最优化缔合方式：全面研究和比较了几种丝氨酸蛋白水解酶的x衍射结构以后，发现酶活性中心与底物过渡状态具有最优缔合方式，这是酶催化活性的一个重要结构基础。由于四面体中间物变形、移动，使得酶与肽键断裂部位附近的其他基团也能形成氢键，所以酶既可以与Michaelis中间物，也可以与酰基酶中间物以最优方式缔合。酶的活性中心对底物过渡状态的最优缔合方式，是酶具有高效催化活性的主要因素之一。事实上，DIPF对于丝
14、氨酸蛋白水解酶的高度抑制性质，就是由于它的四面体磷酸酯基在结构上与底物的过渡状态相似。第30页，此课件共69页哦(6)胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶的结构特点和它们的水解选择性在肽键选择性上所表现出来的明显差异，是由于它们活性中心结合部位结构有所不同。胰凝乳蛋白酶的结合部位有一个Ser残基，这个结合部位实际上是一个疏水性大口袋，可以与侧链为芳香基团的氨基酸残甚结合；胰蛋白酶的结合部位虽然与胰凝乳蛋白酶相似，但由一 个带负电荷的Asp代替Ser，因此与氨基酸残基结合性质发生了很大变化，只能与带有正电荷的氨基酸残基如Lys、Arg结合。弹性蛋白酶的结合部位入口处有两个较大的val和Thr存在，
15、只能让侧链体积小的氨基酸残基如Glg和Ala等进人。第31页，此课件共69页哦4.5 酶催化活性的调控和酶的抑制作用v1酶催化活性的生物学调控v (1)动力学调控：酶的催化反应速率与酶的浓度、底物的浓度、酶与底物的结合状态、酶与产物的结合状态以及产物的浓度等动力学因素有关。v 酶的浓度调控：v 酶在细胞内的含量取决于酶的合成速率和分解速率。细胞根据白身运动需要严格控制细胞内某种酶的合理含量。例如，大肠杆菌培养过程中如果缺少乳糖，那么细胞中就不含任何可以代谢乳糖的酶。但是在培养基中加人乳糖后，只要过几分钟，细胞就能合成出乳糖水解酶，以便能利用这种营养物质。这种调控能力对于生物体适应不同的环境具有
16、重要意义。v 产物浓度水平调控和变构调控：v 在某些生物合成反应中，最终产物往往会对合成反应起抑制作用。当产物浓度达到一定程度时，可自动抑制反应进行。而反应产物浓度下降到一定水平后，又可恢复合成反应。这种调控作用又称为“反馈抑制调控”。第32页，此课件共69页哦(2)共价修饰调控：某些酶的激活作用是通过共价修饰而实现的。例如肌肉中存在一种能催化糖原的合成和分解的酶，即磷酸化酶 b。该酶本身的活性很低，当磷酸化酶b活性中心的丝氨酸残基被磷酸化后，即形成高活性磷酸化酶。由磷酸化酶b转化为活化形式a的反应，被磷酸化酶激酶 所催化，而磷酸化酶a去活化则由另一种磷酸水解酶所催化。第33页，此课件共69页
17、哦(3)水解活化：有些酶在通常情况下是以非活化形式存在的。某些消化酶，如胰蛋白酶原即属这类酶。当胰蛋白面原分子中某一个肽键被水解后，即转变成活性的胰蛋白酶。第34页，此课件共69页哦2酶活性的化学调控和抑制剂v(1)抑制剂的结构和性质特点：v a在化学结构上(包括分子大小、形状、官能团等)与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似；vb能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合体。v(2)抑制剂的作用方式：v a.不可逆抑制：抑制剂与酶的反应中心的活性基团以共价形式结合引起酶的永久性失活。例如，前面提到DIPF对丝氨酸蛋白水解酶酌抑制作用即属这类。v b.可逆抑制：抑制剂与酶
18、蛋白以非共价键结合，引起酶活性暂时性丧失,抑制剂可以通过透析、过滤等方法除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。v 竞争性抑制:某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能和底物竞争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。竞争性抑制通常可以通过增大底物浓度来消除。v 非竞争性抑制：酶可以同时与底物和抑制剂结合，两者没有竞争关系，非竞争性抑制剂通常与酶的调控部位结合，这种结合将引起酶分子构型变化，导致酶活性下降：如某些金属离子(Cu+，Ag+，Hg+)等，通常能与酶分子中的调控部位中的一sH基团等作用改变酶的空间构型，引起非竞争性抑制。第35页，此课
19、件共69页哦第36页，此课件共69页哦4.5酶的作用机制与生物活性分子的设计v1酶的结构及其作用机制是设计生物活性分子的基础。v生物活性物质，主要是指能够影响酶的结构及其功能的一类化学物质。v酶的结构及其作用机制、酶与生物活性物质之间的相互作用及其影响是进行生物活性分子设计的基础第37页，此课件共69页哦 2、具有抗内酰胺水解酶的青霉素青霉素的作用机制是抑制细菌的细胞壁生物合成第38页，此课件共69页哦 由于青霉素在结构上与转胺酶的天然底物肽聚糖的反应部位相似，所以能竞争性地与转胺酶的活性中心结合(与活性中心的丝氨酸残基形成共价键)，从而抑制了细胞壁的合成。应用青霉素菌发酵得到的青霉素，主要成
20、分是青霉素G，它的抗菌效果好，但是，容易被胃酸水解，口服效果差。后来发现在发酵生产青霉素时，加入N(2羟基)苯氧乙酰胺做前体，可以得到另一种青霉素v。青霉素v能耐胃酸适于口服。第39页，此课件共69页哦 青霉素在经过长期使用以后，能够诱导生物体(包括细菌等微生物)产生青霉素酶，它能够水解内酰胺环，从而导致青霉素失效。(1)研制对青霉素酶不敏感的青霹素新品种：青霉素G和v都是青霉素酶的良好底物，青霉素酶能够水解内酰胺环，从而导致青霉素失效。改变青霉素分子中的R基或噻唑环的结构，可影响青霉素分子与青霉素酶的结合。具有与青霉亲G和v相似的抗茵活性，但是对青霉素酶不敏感先锋霉素青霉素酶催化先锋霉素的水
21、解速率要比催化青霉素v的水解速率小将近150倍oxacillin第40页，此课件共69页哦(2)研制对青霉素酶具有抑制作用的青霉素产品本身并没有显著的抗菌活性，但它对青霉素酶则是一种非常好的非可逆抑制剂clavulanic acid既具有抑制青霉素酶作用，又具有良好抗茵活性第41页，此课件共69页哦3具有抗癌活性的生物还原烷基化剂抑制癌细胞的繁殖是治疗癌症的关键第42页，此课件共69页哦好的生物还原烷基化剂，结构上应该是多官能团的化合物，必须有一个容易被还原的基团，有一个以上易离解基团以及其他的能够促进还原或离解的基团。它能够被酶催化还原活化、并形成一个很容易发生烷基化反应的活性中间体(如甲烯
22、醌)第43页，此课件共69页哦4降高血压新药血管紧张肽转化酶抑制剂血压产生的原因是由于一种称为血管紧张肽的多肽能引起血管的收缩和刺激肾上腺皮质激素分泌。血管紧张肽l是由血管紧张肽原经过血管紧张肽原酶选择性水解后得到的10肽。血管紧张肽是已知的一种最强的内源性产生高血压的物质第44页，此课件共69页哦人们发现有几种蛇毒对ACE有很好的抑制作用。其中一个9肽化合物(SQ 20881)具有明显的降低血压作用。但是这个化合物只能注射，口服无效，因而药用价值受到很大的限制。ACE是一种含锌二肽外切酶羧肽酶A的强抑制第45页，此课件共69页哦47 非蛋白生物催化剂核酸酶v核酸酶的发现是研究核糖核酸酶P(R
23、NaseP)作用机制的结果。vRNaseP作用是能将tRNA的前体水解切去一部分核苷酸链，得到活性tRNA。vRNaseP由蛋白质和RNA织成。开始人们认为其中的蛋白质组分应该是活性郎分，而RNA只是辅助成分。Altman等人在详细研究了RNaseP作用机制后，发现了一个非常重要的现象：RNaseP的蛋白部分本身并不具有任何催化功能，而其中的RNA部分在有足够浓度Mg2+离子存在情况下，能起核酸水解酶的作用。而RNaseP中的蛋白质部分，则起着增加活性作用。v 这种RNA催化的反应遵守米氏动力学原则。第46页，此课件共69页哦差不多在同一时期，Cech等人也提出了RNA可以作为催化剂的证据。原
24、生动物四膜虫中含有一种核蛋白RNA前体。其组成除了核蛋白体rRNA外，还有个由423个核苷酸组成的插入序列。在研究从PrerRNA切去插入序列形成rRNA过程中，他们发现这是一个自催化剪接过程。所以 Pre-rRNA是一种具有自催化性能的核酸酶。核酸酶的发现，证明了核酸既是信息分子又是功能分子，对于研究生命的起源，了解核酸新功能具有重要意义第47页，此课件共69页哦核酸酶制备新途径v 定向分子进化技术的出现，为核酸酶的制备开辟了一条新的途径。1992年，Joyce G F报道了制备具有能够切割DNA的新型核酸酶方法。v他们先选择一种已知的核酸酶(从四膜虫中分离，具有自催化剪接功能)作为母体。应
25、用定向分子进化技术通过复制、突变和扩增获得将近1013个各种不同的RNA突变分子。让它们作用于DNA，发现有极少一部分突变RNA个体表现出具有切割DNA的性能。v经筛选出来的突变RNA，再经过扩增、突变和筛选，最后得到了具有切割DNA特性的新型核酸酶：第48页，此课件共69页哦核酸酶的催化性质v已知核酸酶的作用底物基本上都是RNA分子，即RNA作用于RNA。v核酸酶催化的反应主要包括：水解反应(RNA限制性内切酶活性)，连接反应(聚合酶活性)和转核苷酰反应等。v最近核酸酶的其他作用底物也巳被发现，如多糖、DNA以及氨基酸酯等。这表明核酸酶很可能具有氨基酸酯酶、氨酰tRNA合成酶和肽基转移酶活性
26、。v由于这些反应均与蛋白质的生物合成有关。因此核酸酶在核酸的翻译、表达和核糖体功能中有可能起着重要作用。式中 为水解位点，UUU为目前已经得到的最小的核酸酶第49页，此课件共69页哦48 抗体酶和杂化酶v 1抗体酶v(1)抗体酶的理论基础v抗体蛋白的特性：酶与抗体这两种蛋白质之间尽管功能不同，但也存在许多相似之处尤其是它们与各自的配基(酶底物、抗体抗原)的结合特件，如结合方式、动力学过程等都非常相似。所以，从20世纪60年代起，就有人开始试图对抗体进行修饰，并使其获得酶的属性的研究。v酶活性中心与底物形成过渡态理论：酶在催化底物发生化学变化过程中，处于酶活性中心的活性基团与底物相互作用形成稳定
27、的过渡状态，从而大大降低了反应的活化能。可以设想，如果构建一个对某种过渡状态具有最佳缔合状态的抗体，就有可能观察到抗体催化相应底物发生化学反应的效果。第50页，此课件共69页哦2)抗体酶的制备 过渡状态类似物(半抗原)的构建：根据酶催化作用机制，人们有可能设计构建一个底物的过渡状态的化学模型。实际上由于准确的过渡状态很难确定或难以合成，因此，制备抗体酶时用的半抗原是一个结构比较稳定，在价键取向、电荷分布等都与过渡态相似的类似物第51页，此课件共69页哦 抗原的制备：将人工设计并构建的过渡态类似物(半抗原)，用化学方法经间隔基与载体蛋白相连即形成一个抗原。应用单克隆抗体筛选技术制备抗体酶：单克隆
28、抗体技术是20世纪70年代发展起来的一项重要的生物技术。我们知道，当一个抗原，如一种蛋白质注射到动物体内后，动物血液即产生相应的抗体。但是，在已经产生抗体的血清中，可能含有多种能与抗原作用的抗体。而血清本身也含有它原有的抗体。因此，人们无法从血清中得到单一的抗体，当然也就更谈不上大量复制这种抗体。人们发现，动物脾脏中有一种称为淋巴细胞B的细胞，它能产生并分泌出唯一的一种抗体。但是，淋巴细胞B在通常细胞培养条件下不能繁衍，所以难以用这一技术制备大量单一抗体。单克隆抗体技术的关键是将分离纯化的骨髓瘤细胞在培养条件下与淋巴细胞B融合生成一种特殊的杂交瘤细胞，这种杂交瘤细胞能够产生单一的抗体，又能够在
29、细胞培养条件下快速繁殖因而可以大量制备单一抗体。将半合成的抗原给小鼠免疫注射和单克隆筛选，获得单克隆抗体。对制备好的单克隆抗体进行催化活性筛选，即可找到对碳酸酯具有水解催化活性的抗体酶。由此产生的抗体酶具有酶的属性。它具有很高的专一性，例如，用对硝基磷酸酯半抗原产生的抗体，只能水解对位硝基取代的碳酸酯，而对邻位取代物无效。抗体酶也具有明显催化活性，如schultz等制备的抗体酶催化水解速率提高了12000倍，其动力学性质符合米氏方程。第52页，此课件共69页哦第53页，此课件共69页哦第54页，此课件共69页哦第55页，此课件共69页哦第56页，此课件共69页哦第57页，此课件共69页哦(3)
30、抗体酶的发展前景v抗体酶的出现虽然只有短短的十多年时间，但是已经清楚地表明它是研究酶的作用机制的一个有力的工具，在此之前，对于酶催化作用过渡态理论的依据，主要是来自酶抑制作用机制的研究结果。抑制剂只能提供酶作用过程中的专一性结合的信息，但不能给出结合后发生的催化过程信息：而在抗体酶研究过程中，可以直接观察到过渡态理论对抗体酶设汁所起到的重要作用。这也就为酶的过渡态理论的正确性提供了一个有力的实验证据。v 另一方面，抗体酶在有机合成和有机反应机制研究方面，也引起了有机化学家的广泛兴趣。抗体酶的应用，使过去很多不能应用酶促反应的有机合成得以实现。所以，抗体酶的发展前景是令人鼓舞的。第58页，此课件
31、共69页哦杂化酶v杂化酶是一种半合成酶，它是以天然蛋白为母体，用化学方法引进适当活性部分，从而形成一种新的”人工酶”。v杂化酶可分为两种类型：一类是以具有特异性识别功能的蛋白(如抗体)，引进具有催化功能部分：另一类是以具有催化活性的蛋白(非专一选择性晦)为母体，引进具有特殊识别功能的部分。第59页，此课件共69页哦(1)抗体杂化酶：利用抗体蛋白作为母体，引入适当的催化活件中心是构建杂化酶的 一个可行途径。其基本方法是用化学方法将一个催化活性基团(带有双向可反应基团)引进抗原类似物中。利用抗体蛋白与抗原类似物亲和结合作用，使催化活性基团与抗体结合部位附近氨基酸残基共价结合，然后将催化活性基团与抗
32、原类似物分离，并将抗原类似物从抗体的结合部位除去。通常被引进的活性基团是一sH基或咪唑基。第60页，此课件共69页哦2)核酸水解杂化酶：核酸水解杂化酶：准确地定位并切割DNA和RNA是基因重组和基因图谱建立的关键。迄今为止，只有为数不多的天然限制性内切酶能够做到这一点，局限性很大。核酸水解杂化酶是以非选择性的具有水解DNA或RNA磷酸二酯键性质的核酸水解酶为母体，在酶的活性中心邻近位点引进个识别部分，如一段寡聚核苷酸等，从而成为能够对核酸进行定位切割的杂化核酸酶。识别部分寡聚核苷酸链的构建：能满足对DNA或RNA进行定位切割的识别部分，只能是特殊构建的寡聚核苷酸链。这种寡聚核苷酸链必须满足两个
33、条件：一是能与被切割位点附近的核苷酸链完全互补；二是寡聚核苷酸链的一个端基(靠近被切割位点)核苷酸含有个能与催化部分结合的活性基团。通常是用DNA固相合成法来合成这种特殊的寡聚核苷酸链，活性端基一般是含有一SH基的脱氧胸苷。催化部分核酸水解酶的选择和修饰：选择葡萄球菌核酸水解酶作为催化部分母体是比较理想的。它是种性质比较稳定，含有149个氨基酸残基的单链多肽酶，而在它的分子中，没有游离的半胱氨酸，也没有链间的二硫键。它能水解DNA或RNA的磷酸二酯键，生成3-O-PO32-和5-OH的端基产物。同时这种酶对被水解的核苷酸残基没有特别的选择性。为了要将葡萄球菌核酸水解酶与识别部分共价结合，还必须
34、对该酶活性部位进行修饰。其目的是引进一个-SH基。方法是应用定点突变技术，将葡萄球菌核酸水解酶中的Lys-116换成Cys-116。得到的突变酶(K116c)是一个双体酶(两个单体酶中的Cys之间形成二硫健)，再经过DTT还原可以得到单体突变酶。单体突变酶的活性区含有一个一SH基，但它的性质，如催化性能和Km值等，都与野生型酶很接近。核酸水解杂化酶的合成：将单体突变酶与3-S-thiopyridyl oligonucleotide在温和氧化条件下通过形成二硫键得到目标核酸水解杂化酶。第61页，此课件共69页哦第62页，此课件共69页哦第63页，此课件共69页哦核酸水解杂化酶的选择性切割性质：在
35、图426中，底物是一个5-32P端基标记的人工合成DNA。它含有64个核苷酸残基，其中有一段的核苷酸顺序与核酸水解杂化酶的识别部分完全互补。图426(b)所示的是用单纯的突变酶(K116C)水解DNA的结果。可以看出，定点切割选择性能很羔。图426(a)所示的是应用核酸水解杂化酶水解DNA的结果，表明该杂化酶具有良好的顺序选择择切割性能。第64页，此课件共69页哦(3)RNase S核酸水解杂化酶：RNase S核酸水解杂化酶也是一种具有顺序选择特性的核酸水解杂化酶。但它的合成方法则有其自己的特点。核酸水解酶A(RNase A)是一种低选择性RNA水解酶。应用枯草杆菌蛋白酶限制性水解RNase
36、 A时，转变成另一种具有酶活性的RNA水解酶，称为RNase S。它可以被分离成两部分：s-肽(含氨基酸编号为120的肽段)和s-蛋白(含氨基酸编号为21124的肽段)。这两部分均不显示催化活性，当将这两部分按比例重组后，即形成非共价复合物，并且具有与RNase S相似的催化活性 第65页，此课件共69页哦4.9 酶模型v 酶模型是人工合成的一类具有酶的某些属性的有机化合物。虽然它的分子比较小，结构也比较简单，但是含有酶所具有的主要活性基团以及与酶的活性中心相似的空间结构能够模拟酶的某些关键性功能。v 水解酶是相对比较简单的一类酶，它的分子小不含辅酶，一部分水解酶含有金属离子。这类酶中的典型代
37、表，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶A等的分了结构及作用机制等都研究得比较清楚，为构建相关的酶模型打下了基础。第66页，此课件共69页哦酯键水解酶模型v催化活性酯键水解的酶模型 对硝基苯酚乙酸酯是一个活性酯，有利于咪唑环上的氨基亲核进攻酯的羰基碳原子，因而表现出比较高的催化活性；但是，咪唑对一般的非活性酯如乙酸甲酯，三氟乙酸甲酯，则催化活性很低，其催化能力只及碱的百万分之一。咪唑对活性酯的催化行为表明它具有酶的一般属性。因此，可以把咪唑看作是最简单的能够水解活性酯的酶模型。第67页，此课件共69页哦2)催化非活性酯键水解的酶模型：人工合成的两种金属-单水复合物1和2-水解金属酶模型，能够催化对
38、硝基苯酚乙酸酯和三氟乙酸甲酯的水解反应但不能催化乙酸甲酯的水解。第68页，此课件共69页哦酰胺键水解酶模型v复合物2和3都是含铜复合物。前者为单水铜复合物，后者为顺双水铜复合物。研究发现复合物3催化N-甲基甲酰胺和N,N-二甲基甲酰胺(中性pH，100)水解反应速率比复合物2大几百倍。v复合物3的催化活性比2高得多的原因，可以从催化反应机制来解释。前面已经提到，金属水解酶催化水解反应有两种可能的机制，即广义碱催化机制(a)和金属羟基催化机制(b)。但是，在详细分析研究后发现，这两种作用机制都不能满意地解释复合物2和3的催化活性的差异。v含铜酶模型催化酰胺键水解的机制是一种综合了广义碱催化机制和金属羥基催化机制的新机制。第69页，此课件共69页哦