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1、经典免疫学试验沉淀反应第1页，此课件共45页哦第十三章第十三章 沉淀反应沉淀反应第2页，此课件共45页哦可溶性可溶性抗原抗原+相应抗体相应抗体 肉眼可见的沉淀肉眼可见的沉淀第3页，此课件共45页哦返回总目录返回总目录目录目录 1897年年 Kraus 就发现细菌培养液（毒素）与相应抗血清就发现细菌培养液（毒素）与相应抗血清混合出现沉淀混合出现沉淀1905年年 Bechhold 把抗体放在明胶中，将抗原加于其中，把抗体放在明胶中，将抗原加于其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行发现沉淀反应可在凝胶中进行1946年年 Oudin 报告了试管免疫扩散技术报告了试管免疫扩散技术1965年年 Mancini
2、提出单向免疫扩散技术，使定性免提出单向免疫扩散技术，使定性免疫试验向定量化发展免疫浊度法的出现，使沉淀反应疫试验向定量化发展免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、微量、自动化的新阶段。达到快速、微量、自动化的新阶段。第4页，此课件共45页哦 根据沉淀反应的介质和检测方法的不同根据沉淀反应的介质和检测方法的不同,沉淀反应可分为沉淀反应可分为:液相内的沉淀反应液相内的沉淀反应 凝胶内的沉淀反应凝胶内的沉淀反应第5页，此课件共45页哦第一节 液体内沉淀试验 根据沉淀现象的不同，液体内沉淀又可分为三类：根据沉淀现象的不同，液体内沉淀又可分为三类：絮状沉淀絮状沉淀 环状沉淀环状沉淀 免疫浊度沉淀免疫浊度
3、沉淀第6页，此课件共45页哦一、絮状沉淀试验 絮絮状状沉沉淀淀试试验验是是一一项项经经典典实实验验技技术术。曾曾用用于于测测定定梅梅毒毒抗抗体体的的Kahn试试验验是是絮絮状状沉沉淀淀的的代代表表试试验验，现现今已被更简便而敏感的今已被更简便而敏感的USR或或RPR方法替代。方法替代。第7页，此课件共45页哦(一)原理 抗抗原原溶溶液液与与相相应应抗抗体体溶溶液液混混合合，在在电电解解质质存存在在的的条条件件下下，抗抗原原与与抗抗体体结结合合出出现现可可见见的的絮絮状状沉沉淀淀。絮絮状状沉沉淀淀易易受受抗抗原原与与抗抗体体比比例例的的影影响响，由由此此可作为最适比测定的基本方法可作为最适比测定
4、的基本方法。第8页，此课件共45页哦(二二)操作步骤操作步骤1.抗原稀释法抗原稀释法(1)将可溶性抗原作一系列倍比稀释。将可溶性抗原作一系列倍比稀释。(2)各管加入一定浓度的适量抗血清。各管加入一定浓度的适量抗血清。(3)振摇使抗原、抗体充分混匀，置振摇使抗原、抗体充分混匀，置37孵育。孵育。(4)产产生生沉沉淀淀量量随随抗抗原原量量而而不不同同，以以出出现现沉沉淀淀物物最最多多的的管管为为最最适比例管。适比例管。第9页，此课件共45页哦2.2.抗体稀释法抗体稀释法 本本法法采采用用抗抗原原量量恒恒定定与与不不同同倍倍比比稀稀释释度度的的抗抗体体反反应应，出出现现沉沉淀淀物物最最多多的的管管为
5、为抗抗体体最适比例管。最适比例管。3.3.方阵滴定法方阵滴定法 抗抗 原原 和和 抗抗 体体 同同 时时 稀稀 释释，亦亦 称称 棋棋 盘盘(checkerboard)(checkerboard)滴滴定定法法，是是前前二二法法的的结结合合，可可一一次次完完成成抗抗原原和和抗抗体体的的滴滴定定并并找找出出抗抗原原、抗抗体体的最适比。的最适比。第10页，此课件共45页哦(三)方法评价絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，受抗原抗体比例影响非常明显，目前多用以测定受抗原抗体比例影响非常明显，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。抗原抗体反应的最适比
6、。第11页，此课件共45页哦二、环状沉淀试验 环环状状沉沉淀淀(ring precipitation)试试验验是是由由Ascoli于于1902年年建建立立的的一一种种经经典典的的血血清清学学定定性性试试验验。用用非非常常简简便便的的技技术术了了解解待待测测血血清内是否存在某种抗原或抗体。清内是否存在某种抗原或抗体。第12页，此课件共45页哦(一)原理把抗原溶液小心地加于已含抗体溶液的细试管液面上。当对应的抗原与抗体相遇，在界面处形成清晰的乳白色沉淀环。第13页，此课件共45页哦(二二)操作步骤操作步骤1.用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管(内径 约1.52mm)底部，避免产生气泡。2.将抗原溶液沿
7、管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。3.置沉淀管于室温下使其反应，15min内 在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。第14页，此课件共45页哦(三)方法评价 该试验是经典的血清学反应之一，简便、快速、该试验是经典的血清学反应之一，简便、快速、实用。故用于鉴定血迹和诊断炭疽实用。故用于鉴定血迹和诊断炭疽(Ascoli(Ascoli试验试验)。只能定性，不能定量、敏感性较低只能定性，不能定量、敏感性较低(320mg/L)(320mg/L)，对含有多个抗原抗体对的反应系统缺乏分辨力。方对含有多个抗原抗体对的反应系统缺乏分辨力。方法难以推广。法难以推广。第15
8、页，此课件共45页哦 三、免疫浊度试验 经经典典的的免免疫疫沉沉淀淀试试验验是是抗抗原原和和相相应应抗抗体体在在反反应应终终点点时时判判定定结结果果，方方法法存存在在耗耗时时、敏敏感感度度低低(10100mg/L)(10100mg/L)和和不不能能自自动动化化等等缺缺点点。7070年年代代以以来来，根根据据抗抗原原和和抗抗体体所所在在液液相相内内快快速速结结合合并并产产生生浊浊度度的的原原理理，建建立立了了免免疫疫比比浊浊法法。临临床床常常用用3 3种种微微量量免免疫疫技技术术，即即透透射射比比浊浊法法、散散射射比比浊浊法法和和免疫胶乳比浊法，借助多种自动化分析仪器来完成。免疫胶乳比浊法，借助
9、多种自动化分析仪器来完成。第16页，此课件共45页哦(一一)透射比浊法透射比浊法1.1.原原理理 抗抗原原抗抗体体在在一一定定缓缓冲冲液液中中形形成成免免疫疫复复合合物物(IC)(IC)，当当光光线线透透过过反反应应溶溶液液时时，由由于于溶溶液液内内复复合合物物粒粒子子对对光光线线的的反反射射和和吸吸收收，引引起起透透射射光光减减少少，免免疫疫复复合合物物量量越越多多，透透射射光光越越少少，即即光光线线吸吸收收越越多多，可可用用吸吸光光度度表表示示。吸吸光光度度和和复复合合物物的的量量成成正正比比，当当抗抗体体量量固固定定时时，与与待待检检抗抗原原量量成成正正比比。用用抗抗原原标标准准品品建建
10、立立标标准准曲曲线线，可可测测出出待待检检抗抗原含量。原含量。第17页，此课件共45页哦2.操作步骤(1)(1)用用稀稀释释缓缓冲冲液液将将待待检检样样品品和和标标准准品品按按规规定稀释，取一定量加至测定管中。定稀释，取一定量加至测定管中。(2)(2)加加最最适适工工作作浓浓度度(用用方方阵阵法法预预先先滴滴定定)的的抗抗体，孵育一定时间，测定吸光度体，孵育一定时间，测定吸光度(A)(A)值。值。(3)(3)以以不不同同浓浓度度抗抗原原含含量量为为横横轴轴，吸吸光光度度为为纵纵轴轴，绘绘标标准准曲曲线线。从从标标准准曲曲线线可可得得待待检检抗抗原量原量。第18页，此课件共45页哦3.方法评价方
11、法评价 敏感度高于单相琼脂扩散试验敏感度高于单相琼脂扩散试验510510倍，批倍，批内、批间重复性较好，变异系数内、批间重复性较好，变异系数10%10%，操，操作简便快速，作简便快速，1h1h可报告结果。可报告结果。第19页，此课件共45页哦(二二)散射比浊法散射比浊法散散射射光光系系指指一一定定波波长长的的光光沿沿水水平平轴轴照照射射，碰碰到到小小颗颗粒粒的的免免疫疫复复合合物物，光光线线被被折折射射，发发生生偏偏转转，这这种种偏偏转转的的角角度度可可因因光光线线波波长长和和颗颗粒粒大大小小不不同同而而有有所所区区别别。散散射射浊浊度度法法是是在在入入射射光光的的一一定定角角度度检检测测粒粒
12、子子发发出出的的散散射射光光，散散射射光光的的强强度度与与复复合合物物的的含含量量呈呈正正比比，即即待待测测抗抗原原越越多多，形形成成复复合合物物越越多多，散散射射光光强强度度越越强强。又又可可分分为为速速率率散散射射比比浊浊法和终点散射比浊法。法和终点散射比浊法。第20页，此课件共45页哦1.速率散射比浊法速率散射比浊法(1)(1)原原理理：是是一一种种抗抗原原抗抗体体结结合合动动态态测测定定法法。所所谓谓速速率率是是抗抗原原抗抗体体结结合合反反应应过过程程中中，在在单单位位时时间间内内两两者者结结合合的的速速度度。速速率率法法是是测测定定最最大大反反应应速速率率，即即在在抗抗原原抗抗体体反
13、反应应达达最最高高峰峰时时，通通常常为为数数十十秒秒钟钟，测测定定其其复复合合物物形形成成的的量量。峰峰值值的的高高低低在在抗抗体体过过量量情情况况下下与与抗抗原原的的量量成成正正比比。峰峰值值出出现现的的时时间间与与抗抗体体的的浓浓度度及及其其亲亲和和力力直直接接相相关关。不不同同抗抗原原含含量量其其速速率率峰峰值值不不同，通过微电脑处理，求出抗原含量。同，通过微电脑处理，求出抗原含量。第21页，此课件共45页哦(2)操作步骤：操作步骤：1)1)用稀释液将待检抗原稀释成一定浓度。用稀释液将待检抗原稀释成一定浓度。2)2)将将稀稀释释待待检检抗抗原原和和不不同同浓浓度度抗抗原原标标准准品品加加
14、至至试试管管内内，再加入一定量抗体，立即比浊，记录速率单位再加入一定量抗体，立即比浊，记录速率单位(RU)(RU)。3)3)以以抗抗原原标标准准品品含含量量为为横横坐坐标标，RURU值值为为纵纵坐坐标标，于于普普通通坐坐标标纸纸上上绘绘制制标标准准曲曲线线。根根据据待待测测抗抗原原RURU值值，查查出相应抗原含量。出相应抗原含量。第22页，此课件共45页哦(3)方法评价：方法评价：检测不必等到抗原抗体反应达到平衡，大大节检测不必等到抗原抗体反应达到平衡，大大节约反应时间，每小时可检测数十份标本，敏感约反应时间，每小时可检测数十份标本，敏感度高，最小检出量达度高，最小检出量达g/Lg/L水平。水
15、平。第23页，此课件共45页哦2.终点散射比浊法终点散射比浊法(1)原理：原理：让让抗抗原原抗抗体体作作用用一一定定时时间间，使使其其反反应应达达到到平平衡衡后后，测测定定其其复复合合物物的的量量。复复合合物物的的浊浊度度不不再再受受时时间间的的影影响响，但但反反应应复复合合物物聚聚合合产产生生絮絮状状沉沉淀淀之之前前(大大约约反反应应数数十十分分钟钟)进进行浊度测定。行浊度测定。第24页，此课件共45页哦(2)操作步骤操作步骤1)1)用稀释液稀释待检抗原和抗原标准品。用稀释液稀释待检抗原和抗原标准品。2)2)取取一一定定量量稀稀释释待待检检抗抗原原液液和和不不同同浓浓度度抗抗原原标标准准品品
16、溶溶液液加加至至试试管管中中，加加抗抗体体充充分分混混匀匀，孵孵育育一定时间，比浊。一定时间，比浊。3)3)以以抗抗原原标标准准品品量量为为横横坐坐标标，浊浊度度值值为为纵纵坐坐标标，绘绘制制标标准准曲曲线线。根根据据待待检检抗抗原原的的浊浊度度值值，查查出出抗原含量。抗原含量。第25页，此课件共45页哦(3)方法评价：方法评价：敏感度达敏感度达mg/Lmg/L水平，可自动化，水平，可自动化，但反应时间较长但反应时间较长 第26页，此课件共45页哦(三三)免疫胶乳比浊法免疫胶乳比浊法1.1.原原理理 选选择择一一种种大大小小适适中中，均均匀匀一一致致的的胶胶乳乳颗颗粒粒，吸吸附附抗抗体体后后，
17、当当遇遇到到相相应应抗抗原原时时，则则发发生生凝凝集集，单单个个胶胶乳乳颗颗粒粒在在入入射射光光波波长长之之内内，光光线线可可透透过过，当当两两个个胶胶乳乳凝凝集集时时，则则使使透透过过光光减减少少。这这种种减减少少的的程程度度与与胶胶乳乳凝凝集集成成正正比比，与与抗抗原原量量成成正正比。比。第27页，此课件共45页哦2.操作步骤操作步骤1)1)用稀释液将待测抗原和抗原标准品稀释。用稀释液将待测抗原和抗原标准品稀释。2)2)将将抗抗体体致致敏敏胶胶乳乳溶溶液液和和待待测测抗抗原原、不不同同浓浓度的抗原标准品反应一段时间，测吸光度值。度的抗原标准品反应一段时间，测吸光度值。3)3)以以抗抗原原标
18、标准准品品量量为为横横坐坐标标，吸吸光光度度值值为为纵纵坐标绘制标准曲线，查出待测抗原量。坐标绘制标准曲线，查出待测抗原量。第28页，此课件共45页哦3.方法评价方法评价 敏感度高，试剂稳定，因反应液中无敏感度高，试剂稳定，因反应液中无PEGPEG沉淀沉淀剂的影响，个体剂的影响，个体ICIC对结果影响也小，所以结对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用散射比浊仪均可使用。第29页，此课件共45页哦 第二节 凝胶内沉淀试验 凝胶内沉淀试验(gel
19、 phase precipitation)主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(gel diffusion)。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为3类：双相琼脂扩散试验(double gel diffusion test)，单相琼脂扩散试验(single gel diffusion test)，凝胶免疫电泳(gel immuno-electrophoresis)。这是一项凝胶内电泳加扩散技术，专门一章介绍。第30页，此课件共45页哦一、单相琼脂扩散试验一、单相琼脂扩散试验(一一)原理原理将将一一定定量量的的抗抗体体混混入入琼琼脂脂凝凝胶胶中
20、中，使使待待测测的的抗抗原原物物质质在在凝凝胶胶中中自自由由扩扩散散，与与抗抗体体结结合合形形成成沉沉淀淀环环，沉沉淀淀环环的大小与抗原浓度呈正相关。的大小与抗原浓度呈正相关。第31页，此课件共45页哦(二)操作步骤1.将抗体和0.9%琼脂糖5056混合，即刻倾注成平板。2.待凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。3.置37，让其向四周自由扩散，2448h后可见其孔周围出现沉淀环。第32页，此课件共45页哦(三三)方法评价方法评价单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，特殊设备，一般
21、实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L1.25mg/L。第33页，此课件共45页哦(四四)影响因素影响因素1.1.抗原分子量抗原分子量 抗抗原原分分子子量量大大，扩扩散散慢慢，沉沉淀淀环环较较小小；抗抗原原分分子子量量小小，扩扩散散快快，沉沉淀淀环环相相对对较较大大。要要求求待待检检血血清清和和抗抗原原标标准准品品在在血血清清学学上上具具有有均均一一性性，否否则则可可能能出出现结果偏高或偏低。现结果偏高或偏低。第34页，此课件共45页哦2.抗体种类 实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原0.11IU/ml，马抗血清
22、为110IU/ml，羊为0.44IU/ml，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。第35页，此课件共45页哦3.抗体稀释度 抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度。下图为抗体分别以1:25、1:50、1:75、1:100稀释，所形成的4条标准曲线。第36页，此课件共45页哦4.扩散时间 抗原达到扩散终点后，其沉淀环直径才与抗原含量呈一定关系。抗原含量越高，达到一定关系所用扩散时间越长5.扩散温度 在437范围内，提高温度加快扩散速度
23、，缩短反应时间。但有的沉淀环仅在低温下形成，温度高反而消失。在同一次试验的孵育过程中，要防止温度急剧变化，以免出现双圈。6.琼脂板厚度 琼脂板厚度增加，沉淀环面积相应缩小。第37页，此课件共45页哦二、双相琼脂扩散试验(一)原理 将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩散速率等有关。第38页，此课件共45页哦(二)操作步骤1.融化琼脂，浇板 每张载玻片约4ml。2.凝固，打孔 孔径3mm，孔间距35mm，孔型有双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔型。3.加样 在相对孔内加
24、抗原或抗体。4.孵育 使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的纯度、浓度和扩散速度有关。第39页，此课件共45页哦(三)双相琼脂扩散试验的应用1.检测未知抗原或抗体将已知的抗体或抗原与待检标本加入成对孔中，根据沉淀线有无定性；根据沉淀线的位置估计抗原或抗体的相对含量；根据沉淀弧形状判断抗原或抗体的相对扩散速率，见图。第40页，此课件共45页哦A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；浓度及扩散率近似；B：Ag、Ab浓度近似，扩散率浓度近似，扩散率Ag Ab；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率浓度近似，扩散率Ag Ab；D：扩散率近似，浓度
25、扩散率近似，浓度Ag Ab；E：浓度：浓度Ag Ab，扩散率，扩散率Ag Ab；F：浓度：浓度Ag Ab，扩散率，扩散率Ag Ab沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系第41页，此课件共45页哦 2.抗原性质分析 利用三角孔型，将待检抗原和标准抗原加入相邻两个孔中，与另一孔相对，根据沉淀线形状分析待测抗原，见图。第42页，此课件共45页哦(1)沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相同。沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相同。(2)沉沉淀淀线线相相切切：待待检检抗抗原原中中含含有有与与标标准准抗抗原原相相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。(3)沉沉淀淀线线相相交交：待待检检抗抗原原有有与与抗抗血血清清对对应应的的抗抗原原，但和标准抗原不同。但和标准抗原不同。(4)沉沉淀淀线线部部分分吻吻合合：待待测测抗抗原原和和标标准准抗抗原原性性质质相相同同，但含量较低。但含量较低。第43页，此课件共45页哦第44页，此课件共45页哦3.抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的效价。第45页，此课件共45页哦