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1、关于凝胶色谱法第1页，讲稿共16张，创作于星期日专题专题专题专题5 DNA5 DNA5 DNA5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术和蛋白质技术和蛋白质技术第2页，讲稿共16张，创作于星期日蛋白质分离的原理：蛋白质分离的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。可以用来分离不同种类的蛋白质。一、基础知识一、基础知识第3页，讲稿共16张，创作于星期日（一）（一）凝胶色谱法凝胶色谱法2.凝胶
2、：大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖葡聚糖或或琼琼脂糖脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。道。根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大的大小，利用具有小，利用具有网状结构网状结构的凝胶，来进行分离。的凝胶，来进行分离。1.概念：（分配色谱法分配色谱法）第4页，讲稿共16张，创作于星期日3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程第5页，讲稿共16张，创作于星期日第6页，讲稿共16张，创作于星期日4.凝胶色谱法的原理相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部
3、的通道，路程较长，移动速度较慢道，路程较长，移动速度较慢;相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？生变性呢？第7页，讲稿共16张，创作于星期日 （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。1.
4、1.作用作用:2.2.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制:通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。3 3.在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液磷酸缓冲液,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠 如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？第8页，讲稿共16张，创作于星期日 （三）（三）电泳：电泳：1.1.概念：概
5、念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些下，这些基团会带上正电或负电。基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁
6、移速度，从而实现样品中各种分子的产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离分离。第9页，讲稿共16张，创作于星期日3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。第10页，讲稿共16张，创作于星期日 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时常用在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂烯酰胺和交联剂N,NN,N-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网
7、状结构的凝胶。化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应第11页，讲稿共16张，创作于星期日 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。1.1.原理：原理：SDSSDS能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋。由几条肽链组成的蛋白质复合体在白质复合
8、体在SDSSDS的作用下会的作用下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链解聚成单条肽链解聚成单条肽链，因此测定，因此测定的结果只是的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDSSDS能与各种蛋白质形成能与各种蛋白质形成蛋白质蛋白质SDSSDSSDSSDS复合物复合物复合物复合物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子质分子原有的电荷量原有的电荷量。因而掩盖了。因而掩盖了不同种蛋白质间的电不同种蛋白质间的电不同种蛋白质间的电不同种蛋白质间的电荷差别荷差别荷差别荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。，使电泳迁移率完全取决于分子的大
9、小。2.SDS2.SDS作用机理作用机理:第12页，讲稿共16张，创作于星期日用用SDS SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白测定蛋白质的分子量时，可选用一组质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准已知分子量的标准蛋白蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，可以测定，可以测定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分子量、次高分子量市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。及低分子量
10、的标准蛋白试剂出售。第13页，讲稿共16张，创作于星期日第14页，讲稿共16张，创作于星期日 二、实验操作二、实验操作样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定蛋白质提取和分离步骤蛋白质提取和分离步骤血血液液血浆血浆水水 分分固体物质：固体物质：血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细 胞胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白（90909090）两个两个肽链肽链两个两个一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？（一）血红蛋白（一）血红蛋白第15页，讲稿共16张，创作于星期日感感谢谢大大家家观观看看4/9/2023第16页，讲稿共16张，创作于星期日