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1、关于乳铁蛋白的分离与纯化第1页，讲稿共19张，创作于星期一乳铁蛋白的价值乳铁蛋白具有多种生物学功能乳铁蛋白具有多种生物学功能,能提高肠道细胞能提高肠道细胞对铁离子的吸收，具有抗菌，抗病毒，抗氧化，对铁离子的吸收，具有抗菌，抗病毒，抗氧化，抗癌，调节机体免疫反应等多种功能，并己广抗癌，调节机体免疫反应等多种功能，并己广泛应用于食品，畜牧等行业。泛应用于食品，畜牧等行业。LF 可耐受较高温可耐受较高温 度度,使之在使之在 饲料加工过程中不易变性失活，它饲料加工过程中不易变性失活，它促进铁的转运和吸收促进铁的转运和吸收,可以治疗仔猪贫血。它具可以治疗仔猪贫血。它具有广谱的抗菌，抗有广谱的抗菌，抗 病
2、毒作用病毒作用,可用来预可用来预 防和防和 治治疗仔疗仔 猪猪 腹泻腹泻:它它 具有调节免疫系统活性的作用，具有调节免疫系统活性的作用，增强家畜对增强家畜对 疾病的抵抗力，它具有抗真菌和抗脂疾病的抵抗力，它具有抗真菌和抗脂质氧化作用质氧化作用,可用作防霉剂和抗可用作防霉剂和抗 氧化剂。氧化剂。第2页，讲稿共19张，创作于星期一乳铁蛋白乳铁蛋白LF,LF,是存在于哺乳动物外分泌液中的是存在于哺乳动物外分泌液中的一种铁离子结合蛋白结构与转铁蛋一种铁离子结合蛋白结构与转铁蛋 白相似，白相似，但铁结合能力是转铁蛋白的但铁结合能力是转铁蛋白的 260 260 倍，倍，LFLF是由是由689689个氨基酸
3、组成的单一多链分子。个氨基酸组成的单一多链分子。每个分子中每个分子中有有2 2个金属结合位点，每个位点可结合一个个金属结合位点，每个位点可结合一个FeFe3+3+和和一个一个HCOHCO3-3-或或COCO3 3。Lf Lf 的铁结合能力与盐的种类的铁结合能力与盐的种类和浓度有关，在有较高浓度碳酸盐的场合，其和浓度有关，在有较高浓度碳酸盐的场合，其铁结合能力增强，而在有较高浓度柠檬酸盐的铁结合能力增强，而在有较高浓度柠檬酸盐的情况下，其铁结合能力则减弱。情况下，其铁结合能力则减弱。第3页，讲稿共19张，创作于星期一自自 19601960年以来人们就试着采用各种方法年以来人们就试着采用各种方法来
4、制备来制备LF如如离子交换层析色谱离子交换层析色谱,超滤超滤,固定化单克隆抗固定化单克隆抗体体,亲和层析等从人乳或牛乳中分离纯化亲和层析等从人乳或牛乳中分离纯化 LF，但色谱法和固定化单克隆抗体法虽，但色谱法和固定化单克隆抗体法虽能获得较高纯度的能获得较高纯度的 LF但价格昂贵技术要但价格昂贵技术要求高求高,所以并不适用于工业化生产所以并不适用于工业化生产.超滤法简便费用低超滤法简便费用低,易形成易形成 工业化生产，工业化生产，但但 LF 纯度低膜需要经常清洗纯度低膜需要经常清洗。第4页，讲稿共19张，创作于星期一色谱法 -吸附色谱法是利用固定基质和吸附质间物理或化学吸附强度的不同来分离物质的
5、。疏水性的相互作用色谱在乳铁蛋白的分离上有重要的应用。一般以Toyopearl为基质,在(NH4)2 2SO4溶液中达到吸附平衡后再装柱,用去离子水0.25mol/L HAc和0.25mol/L NaOH洗脱,得纯度为80%的乳铁蛋白,其缺点是吸附容量比较小,效率比较低.第5页，讲稿共19张，创作于星期一离子吸附法离子吸附法1 1 最早利用最早利用DEAEDEAE纤维素阴离子交换树脂分离纯化得纤维素阴离子交换树脂分离纯化得到较纯的到较纯的Lf.Lf.2 2 磷酸纤维素交换色谱法磷酸纤维素交换色谱法羧甲基阳离子交换色谱法被广泛应用于羧甲基阳离子交换色谱法被广泛应用于LfLf和乳过和乳过氧化氢酶的
6、分离纯化氧化氢酶的分离纯化,用用pHpH值值7.7,7.7,浓度浓度0.05mol/L0.05mol/L的磷酸钠溶液或浓度的磷酸钠溶液或浓度0.3mol/LNaCl0.3mol/LNaCl溶液作为洗脱液来洗脱溶液作为洗脱液来洗脱,它可将它可将LfLf的的a,ba,b两种变异体分离出来两种变异体分离出来,而且树脂能用浓度而且树脂能用浓度0.2mol/L0.2mol/L的的NaOHNaOH溶液和浓度溶液和浓度0.2mol/L0.2mol/L的的HCIHCI溶液再溶液再生生,此法相对来说要更有效此法相对来说要更有效第6页，讲稿共19张，创作于星期一亲合色谱法亲合色谱法不容基质不容基质-连接物连接物-
7、隔离臂隔离臂-连接物连接物-配体，配体，基质一般用琼脂多糖基质一般用琼脂多糖,隔离臂一般多是有一定长隔离臂一般多是有一定长度的可以连接基质的有机物度的可以连接基质的有机物例如，肝素琼脂糖亲合色谱例如，肝素琼脂糖亲合色谱能从琼脂乳中一步分离来得到乳铁蛋白能从琼脂乳中一步分离来得到乳铁蛋白,并且经并且经电泳分析表明其纯度极高电泳分析表明其纯度极高。第7页，讲稿共19张，创作于星期一例如，换例如，换CuCu2+2+的的1,41,4一丁二醇二环氧甘油醚亚氨一丁二醇二环氧甘油醚亚氨二乙酸琼脂糖二乙酸琼脂糖,用用CuCu2+2+交换后该树脂呈蓝色交换后该树脂呈蓝色,装柱时上面装柱时上面1/21/2或或2/
8、32/3是铜树脂下半部分未直接是铜树脂下半部分未直接交换的交换的CuCu2+2+树脂树脂,洗脱液为用洗脱液为用pHpH值值8.0-2.88.0-2.8浓度浓度0.05mol/L0.05mol/L的的Tris-HACTris-HAC溶液或浓度溶液或浓度0.5mol/L0.5mol/L的的NaCINaCI溶液作为洗脱液，一般来说溶液作为洗脱液，一般来说,25mL,25mL的树脂可的树脂可以吸附以吸附1L1L干酪乳清的干酪乳清的LfLf和免疫球蛋白和免疫球蛋白,并且产品并且产品的纯度极高。的纯度极高。第8页，讲稿共19张，创作于星期一固定化单克隆抗体法固定化单克隆抗体法利用抗原利用抗原-抗体之间的高
9、特异性结合抗体之间的高特异性结合在在6 68 8周的鼠腹中注入人或牛的乳铁蛋白进行周的鼠腹中注入人或牛的乳铁蛋白进行免疫免疫,经一系列操作分离出抗体经一系列操作分离出抗体,用抗体和异丙醇用抗体和异丙醇活化的亲合凝胶混合制得免疫亲合色谱。用脱脂活化的亲合凝胶混合制得免疫亲合色谱。用脱脂牛初乳或常乳作为料液牛初乳或常乳作为料液,用洗脱用洗脱0.2 mol/L 0.2 mol/L pH2.7pH2.7醋酸缓冲液醋酸缓冲液(含含0.1 5mol/L NaCl)0.1 5mol/L NaCl)洗脱。洗脱。-成本贵成本贵第9页，讲稿共19张，创作于星期一超滤法是一种基本的膜分离技术，其原理是根据是一种基本
10、的膜分离技术，其原理是根据膜孔径不同可以实现不同分子质量和分子膜孔径不同可以实现不同分子质量和分子形状的大分子物质的分离，非常适合热敏形状的大分子物质的分离，非常适合热敏性的功能性组分的分离。选用孔径或截留性的功能性组分的分离。选用孔径或截留分子量不同的一系列超滤膜，可以以干酪分子量不同的一系列超滤膜，可以以干酪乳清为原料生产乳清为原料生产 LfLf基料。基料。第10页，讲稿共19张，创作于星期一盐析法 和层析法从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白并利用电从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白并利用电泳和分光光度法检测其纯度和含量所获泳和分光光度法检测其纯度和含量所获得的乳铁蛋白的分子质量为得的乳铁蛋白的分子质量为
11、90000u,90000u,纯度纯度大约为大约为92%92%。采用。采用3 3次盐析和次盐析和1 1次凝胶层析次凝胶层析的方法。的方法。第11页，讲稿共19张，创作于星期一试验方 法乳样前期处理：乳样前期处理：乳样在盐析和凝胶层析之前要进行前期处理乳样在盐析和凝胶层析之前要进行前期处理,即除去脂即除去脂 肪肪和大量的酪蛋白和大量的酪蛋白,物料的前期处理方法基本相同采用新鲜牛初乳通过离心脱去物料的前期处理方法基本相同采用新鲜牛初乳通过离心脱去脂肪脂肪(4(4，3000r/min3000r/min、30min)30min)得到脱脂乳，得到脱脂乳，将脱脂乳将脱脂乳稀释后，稀释后，边搅拌边向其中加入边
12、搅拌边向其中加入 1mol/L 1mol/L 盐酸溶液调整盐酸溶液调整脱脂乳的脱脂乳的 pH pH 值到值到 4.6(4.6(酪蛋白的等电点酪蛋白的等电点)，室温放置，室温放置 30min30min，离心除去酪蛋白，离心除去酪蛋白(4(4、10000r/min10000r/min、30min)30min)，得，得到的上清就是我们需要的乳清，用它来分离到的上清就是我们需要的乳清，用它来分离 LfLf第12页，讲稿共19张，创作于星期一盐析：选用硫酸胺沉淀以除去分子量比较小的盐析：选用硫酸胺沉淀以除去分子量比较小的蛋白，将乳清用蛋白，将乳清用30%30%的饱和硫酸铵沉淀的饱和硫酸铵沉淀 30min
13、30min后，后，44条件条件4000r/min4000r/min离离40min;40min;将得到的上清液再用将得到的上清液再用50%50%的饱和硫酸铵沉的饱和硫酸铵沉30min30min后后,4,4条件下条件下4000r/min4000r/min离心离心40min40min，除去免疫，除去免疫球蛋白沉淀，将得到的上清液用球蛋白沉淀，将得到的上清液用85%85%的饱和硫酸铵沉淀的饱和硫酸铵沉淀30min30min。此时需在此时需在PH8.5PH8.5的情况下，的情况下，44000r/min,44000r/min,离心离心40min40min。此时收集沉淀，并用蒸馏水溶解。此时收集沉淀，并用蒸
14、馏水溶解。第13页，讲稿共19张，创作于星期一凝胶层析：凝胶层析：为了获得较高纯度的为了获得较高纯度的LFLF，选用，选用 sephadex-G-100 sephadex-G-100 对对LFLF进行分离和纯化。进行分离和纯化。将透析后的乳清将透析后的乳清1mL1mL加入平衡过的凝胶层析加入平衡过的凝胶层析柱，在柱，在2020条件下以条件下以0.2mL/min0.2mL/min的流速的流速 进进行洗脱，洗脱液选用行洗脱，洗脱液选用pH7.4pH7.4的的PBsPBs（NaclNacl含量含量 8g/1000mL)8g/1000mL)，待出现峰值后收集洗，待出现峰值后收集洗脱液，每管收集脱液，每
15、管收集lmLlmL。第14页，讲稿共19张，创作于星期一LF 的鉴 定采用非连续性采用非连续性SDS-PAGESDS-PAGE电泳对脱脂乳和盐析电泳对脱脂乳和盐析分离得到的上清液，以及凝胶层析的洗脱产分离得到的上清液，以及凝胶层析的洗脱产物进行检测。物进行检测。采用分光光度法对凝胶层析所得到的乳铁蛋白采用分光光度法对凝胶层析所得到的乳铁蛋白的浓度进行测定。的浓度进行测定。第15页，讲稿共19张，创作于星期一结果与分析结果与分析由于由于LFLF的的pHpH为为7.0-8.0,7.0-8.0,所以本所以本试验凝胶层析选用的洗脱液为试验凝胶层析选用的洗脱液为pH7.4pH7.4的的PBSPBS，在这
16、个，在这个pHpH范围内范围内均可以得到均可以得到LFLF。由图。由图1 1可知峰可知峰l l显示样品的吸收峰峰值较小，说明显示样品的吸收峰峰值较小，说明LFLF含量较低，但是非含量较低，但是非LFLF成分含量却很低成分含量却很低,可以忽略可以忽略,样品纯度比较高经样品纯度比较高经SDS-PAGESDS-PAGE电泳检测仅出现一条可见的区带电泳检测仅出现一条可见的区带,相对分子质量为相对分子质量为9000u,9000u,对电泳凝胶进行扫描和计算机分析对电泳凝胶进行扫描和计算机分析LFLF的纯度达的纯度达 到到92%,LF92%,LF峰峰2 2和峰和峰3 3显示样品的吸收峰峰值较大显示样品的吸收
17、峰峰值较大,说明说明LFLF含量较高含量较高,但是样品不纯但是样品不纯,含有其他成分含有其他成分,经经SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳检测结果为峰检测结果为峰2 2样品中含有两种成分样品中含有两种成分,峰峰3 3样品中含有三种样品中含有三种成分。峰成分。峰IVIV则说明样品的各个成分含量都很低则说明样品的各个成分含量都很低,经经SDS-SDS-PAGE PAGE 电泳检测可见条带非常不清晰电泳检测可见条带非常不清晰.第16页，讲稿共19张，创作于星期一分光光度法分光光度法采用分光光度法测采用分光光度法测定定LFLF浓度浓度,首先利首先利用纯度为用纯度为92%92%的的LFLF溶液在溶液
18、在400-650nm400-650nm下扫描，发现在下扫描，发现在475nm475nm波长产生特征吸波长产生特征吸 收收峰峰(见图见图3)3)于于475nm475nm测定其吸光度测定其吸光度,作出浓度作出浓度C C与吸光度与吸光度A A之间关系的线性回归方程之间关系的线性回归方程,如图如图四四,得方程为得方程为:c=827.49A+5.7315(R:c=827.49A+5.7315(R2 2=0.9954)=0.9954)。第17页，讲稿共19张，创作于星期一图图4 4显示显示A475A475值未能达到一般分光光度法的值未能达到一般分光光度法的线性范围线性范围(0.1-0.7)(0.1-0.7)。这是由于。这是由于A475A475与与LFLF铁饱和度有关铁饱和度有关100%100%铁饱和度的铁饱和度的LFLF的的A475A475仅仅为为0.570.57。LFLF的铁饱和度越低的铁饱和度越低,A4A475,A4A475就越就越低本文制备的低本文制备的LFA475LFA475为为0.116,0.116,则质则质量浓度为量浓度为101.73g/ml.101.73g/ml.第18页，讲稿共19张，创作于星期一感感谢谢大大家家观观看看第19页，讲稿共19张，创作于星期一