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1、组织与细胞化学课件第1页，此课件共71页哦目录第一章第一章第一章第一章 概概概概 述述述述第二章第二章第二章第二章 组织学的研究方法组织学的研究方法组织学的研究方法组织学的研究方法 第三章第三章第三章第三章 光镜标本制作光镜标本制作光镜标本制作光镜标本制作 第四章第四章光学显微技术光学显微技术 第五章第五章第五章第五章 组织细胞化学组织细胞化学组织细胞化学组织细胞化学第六章第六章第六章第六章 免疫组织细胞化学免疫组织细胞化学免疫组织细胞化学免疫组织细胞化学 第七章第七章第七章第七章 原位杂交组织化学原位杂交组织化学原位杂交组织化学原位杂交组织化学第八章第八章第八章第八章 细胞分离技术细胞分离技
2、术细胞分离技术细胞分离技术第九章第九章第九章第九章 细胞培养与组织工程细胞培养与组织工程第十章第十章形态计量分析术形态计量分析术第2页，此课件共71页哦第一章第一章概概述述 第一节概述 第二节组织化学与细胞化学的发展史第3页，此课件共71页哦第一节概述概述1.组织与细胞化学 1.1定义：组织化学组织化学(histochemistry)(histochemistry)与细胞化学（cytochemistry)cytochemistry)是运用物理学、化学、免疫学和分子生物学等原理与技是运用物理学、化学、免疫学和分子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成分或酶活性进行定性、定位术，对组织与细胞的化
3、学成分或酶活性进行定性、定位和定量研究的科学。第4页，此课件共71页哦1.2基本原理：组组 织织 化化 学学（histochemistry)histochemistry)和和 细细 胞胞 化化 学学（cytochemistrycytochemistry）技技术术的的基基本本原原理理是是在在组组织织切切片片上上或或被被检检材材料料上上，加加一一定定试试剂剂，使使它它与与组组织织或或细细胞胞中中待待检检物物质质发发生生化化学学反反应应成成为为有有色色沉沉淀淀物物，以以用用光光镜镜观观察察，若若为为重重金金属属沉沉淀淀，可可以以用用电电 镜镜 观观 察察，称称 电电 镜镜 组组 织织 化化 学学（e
4、lectron electron microscope microscope histochemistry)histochemistry)。这这种种方方法法可可用用于于检检测测细细胞胞内内的的酶酶类类、糖糖类类、脂脂类类。核核酸酸与与某某些些金金属属元元素素等等。如如进进一一步步应应用用显显微微分分光光光光度度计计等等测测定定标标本本中中沉沉淀淀物物的的强强度度，则则能能较较精精确确地地进进行行定定量量研究。研究。第5页，此课件共71页哦2.研究组织、细胞传统的化学方法传传统统的的组组织织化化学学只只是是利利用用物物理理或或化化学学反反应应显显示示组组织织或或细细胞胞内内的的化化学学成成分分或
5、或酶酶活活性性而而对对其其进进行行定定性性、定位和定量研究。定位和定量研究。第6页，此课件共71页哦 糖类显示法糖类显示法 最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是过碘酸-雪夫反应（periodic acid Schiff，PAS反应)。基本原理是：糖被强氧化剂过碘酸（HIO4)氧化后，形成2-醛基；后者与Schiff试剂中的无色品红亚硫酸复合物结合，形成紫红色反应产物,PAS反应阳性部位即表示多糖的存在。酶类显示酶类显示 细胞内含有多种酶,每一种酶可催化一定的化学反应。酶的显示法是通过显示酶的活性来表明酶的存在，而不是酶的本身。将具有酶活性的组织放人含有一定底物的溶液中孵育，底物经酶
6、的作用形成初级反应产物，它再与某种捕捉剂相反应,形成显微镜下可视性沉淀,即最终反应产物。如欲显示细胞内酸性磷酸酶,先将切片放入含有酶底物(常用-甘油磷酸钠)的溶液（PH5.0)中孵育，底物经酶的作用，水解并释放出磷酸；用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，形成微细的磷酸铅沉淀，此时，可在电镜下检出；如再用硫化铵处理时，磷酸铅被置换成硫化铝沉淀，可在光镜下见到。第7页，此课件共71页哦 脂类显示 脂类物质包括脂肪与类脂。标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红、苏丹、苏内、苏丹黑B、尼罗蓝等脂溶性染料染色；亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。核酸显示法核酸显示法显示DNA的传统方法为Feulgen反应。切片先经稀盐
7、酸处理后，使细胞内DNA水解，打开DNA分子中脱氧核糖核酸和嘌呤碱之间的连接键，使其释放出醛基，再用Schiff试剂处理，形成紫红色反应产物。如用甲基绿-派若宁反应，可同时显示细胞内的DNA和RNA甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝绿色，派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色。第8页，此课件共71页哦 3现代意义的细胞与组织化学 包包括括无无机机物物组组织织化化学学、酶酶组组织织化化学学、电电镜镜细细胞胞化化学学、荧荧光光组组织织化化学学、免免疫疫组组织织化化学学、同同工工酶酶组组织织化化学学、定定量量组组织织化化学学、原原位位杂杂交交组组织织化化学学、放放射射自自显显影影技技术术、流流式式细细
8、胞胞术术和和激激光光扫扫描描共共聚聚焦焦显显微微术术等等。故故现现代代组组织织化化学学的的概概念念已已远远远远超超过过了了原原有有的的范范围围，理理论论、内内容容、技技术术手手段段和和研研究究范范围围都都比比过过去去更更广广泛泛、更更深深入入。包包括括经经典典组组织织化化学学、免免疫疫组组织织化化学学和和原原位位杂杂交交组组织织化化学学在在内内的的广广义义组组织织化化学学是是介介于于细细胞胞学学、组组织织学学、生生物物化化学学以以及及分分子子生生物物学学之之间间的的新新兴兴边边缘缘学学科科，已已成成为为医医学学生生物物学学科科研研工工作作的的重重要要手手段段。定定量量组组织织化化学学技技术术主
9、主要要用用于于组组织织化化学学的的原原位位定量研究是组织化学从定性、定位研究进入定量研究的重要手段。定量研究是组织化学从定性、定位研究进入定量研究的重要手段。第9页，此课件共71页哦流式细胞术和激光扫描共聚焦显微术使组织化学的定性、定位和定量研究又有了新的突破，特别是激光扫描共聚焦显微术可在三维立体结构层面上对细胞内化学物质进行更深层次的研究，并在各种细胞的微型手术切割以及细胞膜流动性、膜电位、膜通透性、高分子物质扩散和受体移动等的检测方面有了越来越广泛的应用。然而各类组织化学虽有其特定的概念和范围但都是源于组织化学，且其实验技术也有其共同点。或是在原组织化学基础上进一步发展而成型。细胞是一个
10、生命体，组织的构成也是由细胞组成，在研究生命规律及探索生命规律的过程中，要应用到许多技术和方法，从而产生了组织化学和细胞化学等学科。第10页，此课件共71页哦4.4.组织化学发展的基础组织化学发展的基础组织化学基于并源于组织学、细胞学和生物化学，又有别于这些学科。组织化学与组织学和细胞学的区别：前者的着眼点是研究组织细胞内的化学组成及其含量和酶的存在及其活性，而后者的着眼点是研究组织细胞的形态结构及其与功能的关系。组织化学与生物化学的区别：虽然两者均着眼于组织细胞内的化学组成及其含量和酶的存在及其活性，但是，生物化学技术中通常是将组织和细胞破坏，制成匀浆，然后进行化学测定，而不考虑定位；在组织
11、化学技术中，是尽可能在组织或细胞内原位显示各种化学成分，故定位性能好。生物化学技术中的化学反应是在试管内进行，而组织化学技术中的化学反应通常是在组织切片或细胞涂片中进行。组织化学要求一定在显微镜下能观察到所检测的化学物质，但在大多数情况下，所见到的并不是某种化学物质本身，而是该物质在其存在部位经过化学反应的产物这种产物在镜下可直接或间接被观察到，它所在的位置和数量能够代表该物质的位置和数量。组织化学自出现以来，已取得长足的发展。这些发展以细胞生物学、生物化学、免疫学和分子生物学的快速发展为基础。第11页，此课件共71页哦第二节组织化学与细胞化学的发展史第二节组织化学与细胞化学的发展史我国组织化
12、学发展概况我国组织化学发展概况我国的组织化学研究工作起步于20世纪50年代，组织化学家李肇特、张作干教授等人作为我国组织化学发展的奠基者，积极从事组织化学方面的科研和教学工作。并培养出一大批组织化学的专门研究人才。他们在20世纪50年代末率先应用并在全国范围内推广“组织化学”技术，举办组织化学培训班，招收全国各医学院校青年教师和科研人员进修学习，自编组织化学教材，为研究生开办组织化学课程。随后，我国从事组织化学研究的专家还有张保真、王启民、马仲魁和艾民康等，他们为我国组织化学事业的发展作出了突出贡献。中国解剖学会于1988年3月在广州成立了“组织化学与细胞化学学组”，并决定筹办中国组织化学与细
13、胞化学杂志。这标志着中国组织化学与细胞化学的研究进入了一个崭新阶段。国际组织化学与细胞化学学会联合会(InternationalFederationofSocietiesforHistochemistryandCytochemistry，IFSHC)是全世界组织化学与细胞化学工作者的学术组织，于1960年9月成立于法国巴黎，每4年召开一次大会。第12页，此课件共71页哦我国组织细胞化学家艾民康教授代表中国组织细胞化学工作者于1980年首次参加了第6届IFSHC大会，并在第8届IFSHC大会上当选为联盟理事，中国被正式接纳为会员，从此我国成为IFSHC的成员和理事国。此后。苏慧慈、成令忠、蔡文琴
14、教授先后当选为IFSHC的理事。中日组织化学与细胞化学研讨会由我国艾民康、朴英杰教授和日本组织细胞化学家小川和郎教授组织发起，继1989年第一届研讨会在广州召开以来，先后在我国西安、沈阳、重庆、上海、日本东京、中国武汉和日本甲府召开了第28届会议。这些会议展现了中日两国组织化学与细胞化学领域内的最新研究成果、新理论、新技术方法的进展，并加强和促进了我国组织细胞化学界的国际学术交流第13页，此课件共71页哦细胞生物学发展与组织化学细胞生物学发展与组织化学细胞生物学是从细胞、亚细胞和分子三个水平研究生命活动规律的科学，组织化学以细胞生物学是从细胞、亚细胞和分子三个水平研究生命活动规律的科学，组织化
15、学以细胞生物学为基础发展而来。细胞生物学为基础发展而来。显微镜的发明与细胞的发现将人类对机体的认识从宏观世界引向微观世界显微镜的发明与细胞的发现将人类对机体的认识从宏观世界引向微观世界的广阔领域，由此人们从肉眼所见的大体结构开始探索光学显微镜下组织细胞的广阔领域，由此人们从肉眼所见的大体结构开始探索光学显微镜下组织细胞的微细结构，正因为有了对机体微细结构的充分认识，才有可能产生对组织细的微细结构，正因为有了对机体微细结构的充分认识，才有可能产生对组织细胞的化学成分进行定性、定位和定量研究的渴求。然而，光学显微镜的分辨率胞的化学成分进行定性、定位和定量研究的渴求。然而，光学显微镜的分辨率有限，仅
16、能观察到细胞膜、细胞质和细胞核，对于亚细胞结构，即超微结构的有限，仅能观察到细胞膜、细胞质和细胞核，对于亚细胞结构，即超微结构的观察无能为力。观察无能为力。19321932年，德国科学家年，德国科学家KnollKnoll和和RuskaRuska在西门子在西门子(Siemens)(Siemens)公司设计研制了世界上第公司设计研制了世界上第一台透射电子显微镜。又把人类对机体的认识带入了超微结构领域。人们只有对机体结一台透射电子显微镜。又把人类对机体的认识带入了超微结构领域。人们只有对机体结构深入了解。才可能透彻阐明其功能。著名生物学家构深入了解。才可能透彻阐明其功能。著名生物学家WilsonWi
17、lson的名言的名言“一切生物学关键问一切生物学关键问题必须在细胞中寻找题必须在细胞中寻找”，至今还有着很深的内涵。细胞生物学的发展历程为组织化，至今还有着很深的内涵。细胞生物学的发展历程为组织化学的产生和发展奠定了形态学基础。学的产生和发展奠定了形态学基础。第14页，此课件共71页哦免疫学发展与组织化学免疫学发展与组织化学1818世纪世纪7070年代年代英国医生英国医生EdwardJennerEdwardJenner研究出用牛痘菌预防天花的方法，为免疫学对研究出用牛痘菌预防天花的方法，为免疫学对传染病的预防开辟了广阔前景。传染病的预防开辟了广阔前景。1919世纪末世纪末法国化学家、微生物学家
18、法国化学家、微生物学家LouisPasteurLouisPasteur在研究人和动物传染病时，分在研究人和动物传染病时，分析了免疫现象，并在琴纳的启发下发明用减毒炭疽杆菌苗株制成疫苗，预防动物炭疽析了免疫现象，并在琴纳的启发下发明用减毒炭疽杆菌苗株制成疫苗，预防动物炭疽病，用减毒狂犬病毒株制成疫苗预防人类狂犬病。德国细菌学家、免疫学家病，用减毒狂犬病毒株制成疫苗预防人类狂犬病。德国细菌学家、免疫学家EmilEmilAdolfvonBehringAdolfvonBehring于于18901890年发现免疫血清中有抗白喉毒素的抗毒素存在年发现免疫血清中有抗白喉毒素的抗毒素存在日本细菌学家北里柴三郎
19、也发现抗破伤风毒素的抗毒素，两人共同研究血清疗法日本细菌学家北里柴三郎也发现抗破伤风毒素的抗毒素，两人共同研究血清疗法成功。从此，人们开始探词成功。从此，人们开始探词 免疫机制，把细胞的吞噬作用和抗毒素的中和作用看免疫机制，把细胞的吞噬作用和抗毒素的中和作用看成是特异性免疫的根据，并逐步展开了细胞免疫和体液免疫两大学派的争鸣。体成是特异性免疫的根据，并逐步展开了细胞免疫和体液免疫两大学派的争鸣。体液免疫学派代表是德国细菌学家液免疫学派代表是德国细菌学家EhrlichPaulEhrlichPaul。他用生物化学方法研究免疫现象。特别。他用生物化学方法研究免疫现象。特别是以蛋白质化学和糖化学作为基
20、础，探讨抗原和抗体的本质及其相互作用。于是以蛋白质化学和糖化学作为基础，探讨抗原和抗体的本质及其相互作用。于18961896年提出年提出抗体形成的侧链学说。抗体形成的侧链学说。第15页，此课件共71页哦到20世纪60年代，对体液免疫研究已经达到分子水平，即揭示了抗体的分子结构和功能。同时，对细胞免疫研究也有明显进展，特别是在杂交瘤技术方面的突破性进展，这不仅丰富了细胞学内容，而且为获得单克隆抗体或介质物质开辟了一条新道路。将抗原、抗体的特异性与组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体
21、以及受体等)，形成了一项新技术免疫组织化学技术。因此，免疫组织化学技术比组织化学技术对细胞成分的检测范围更为广泛特异性也更强。第16页，此课件共71页哦生物化学发展与组织化学生物化学发展与组织化学生物化学是一门运用化学原理及方法研究生命的科学。它一方面是进行细生物化学是一门运用化学原理及方法研究生命的科学。它一方面是进行细胞组成成分的化学分析，另一方面是对这些成分在生命过程中所发生的化学胞组成成分的化学分析，另一方面是对这些成分在生命过程中所发生的化学反应进行分析，而组织化学正是利用这些化学反应原理来实现对组织细胞化反应进行分析，而组织化学正是利用这些化学反应原理来实现对组织细胞化学成分的定性
22、、定位和定量研究。学成分的定性、定位和定量研究。2020世纪初，人类已经认识到组成蛋白质的世纪初，人类已经认识到组成蛋白质的2020个标准氨基酸中的个标准氨基酸中的1919种。种。E EFischerFischer提出蛋白质是由相邻氨基酸之间的肽链连接而成，并推论这些肽链是提出蛋白质是由相邻氨基酸之间的肽链连接而成，并推论这些肽链是由一个氨基酸的。由一个氨基酸的。氨基和相邻的羟基连接时脱去水而形成。到氨基和相邻的羟基连接时脱去水而形成。到1919世纪末，世纪末，其他细胞成分，如脂肪、碳水化合物与核酸也被认知。甚至能被部分提纯。其他细胞成分，如脂肪、碳水化合物与核酸也被认知。甚至能被部分提纯。例
23、如，例如，FriedrichMiescher(1871FriedrichMiescher(1871年年)在其细胞成分研究中，从死的白细胞核中分离出脱在其细胞成分研究中，从死的白细胞核中分离出脱氧核糖核酸氧核糖核酸(DNA)(DNA)。但是，当时这一重要发现并没有与遗传联系起来，几乎过。但是，当时这一重要发现并没有与遗传联系起来，几乎过于于5050年之后，才开始认识到年之后，才开始认识到DNADNA在遗传中所起的重要作用。在遗传中所起的重要作用。因此，在生物化学的发展中对生物体大分子物质结构和功能的认识为组织因此，在生物化学的发展中对生物体大分子物质结构和功能的认识为组织化学奠定了基础。例如。在
24、组织化学中对组织细胞成分中酶的检测，是将组化学奠定了基础。例如。在组织化学中对组织细胞成分中酶的检测，是将组织切片置于含有特异性底物的溶液中，溶液中的底物经组织切片中酶水解、织切片置于含有特异性底物的溶液中，溶液中的底物经组织切片中酶水解、氧化等作用形成反应产物，即初级反应产物。初级反应产物再与某种捕捉剂氧化等作用形成反应产物，即初级反应产物。初级反应产物再与某种捕捉剂结合，形成有色的终产物使组织切片中的酶变成在显微镜下可见物，从而在结合，形成有色的终产物使组织切片中的酶变成在显微镜下可见物，从而在原位检测酶活性，了解它的存在、分布和功能。原位检测酶活性，了解它的存在、分布和功能。第17页，此
25、课件共71页哦现代组织化学的发展现代组织化学的发展近半个世纪是现代组织化学蓬勃发展时期。组织(细胞)化学新方法的建立，使其技术手段更精细，内容更丰富，如Mann自1902年起及此后许多学者的研究，逐渐建立了完善的组织冷冻切片技术，弥补了一般化学固定及石蜡包埋的缺点，可防止脂类、多糖类和无机盐的丢失，防止酶活性丧失等，推动了脂类、黏多糖及酶的组织化学研究。第18页，此课件共71页哦在蛋白质和氨基酸组织化学显色法的研究中，Danielli(1947年)建立了显示蛋白质(酪氨酸、色氨酸和组氨酸)的四氮盐反应，还有坂口(1925年)建立并经其他学者改进的精氨酸(组蛋白中富含)显色法，Danielli(
26、1950年)和Pearse(19年)等建立的SS基和SH基反应(显示胱氨酸和半胱氨酸，与角蛋白检测相关)，vanGieson的胶原显示法，Foot(1925年)显示网状纤维的银浸法，Weigert、Verhoeff(1908)和Gomori(1950年)等的弹性纤维染色法，Mallory(1938年)的纤维蛋白染色法等。第19页，此课件共71页哦在核酸组织化学显色法的研究中，最著名的是Feulgen和Rossenbeck(1924年)建立的Feulgen-Schiff反应，用以显示细胞核内的DNA。另一个是Brachet于19401944年建立的甲基绿焦宁(pyronine)染色法显示细胞内的
27、RNA。此法使胞质和核仁内的RNA显红色，核内的DNA显绿色，标本色彩鲜艳，为研究者所乐用。第20页，此课件共71页哦碳水化合物组织化学显色法中，最著名的是McManus(1946年)和Hotchkiss(1948年)建立的过碘酸-Schiff反应(PAS反应)，可使细胞和组织内的多糖、黏多糖、糖蛋白呈红色；Steedman(1950年)建立了用alcian蓝显示酸性黏多糖和透明质酸的方法；Michaelis等(1945年)发现用甲苯胺蓝染色，可使组织中的肝素等酸性黏多糖呈异染性。第21页，此课件共71页哦脂类的组织化学显色法中，除用苏丹外，Michaelis(1901年)、Lison(193
28、0年)和Liliie(1944年)等还发现用苏丹、油红O、苏丹黑等脂溶性染料的染色法。此外，还有用锇酸浸染显示脂类的方法。有关酶组织化学的研究从20世纪40年代兴起，至20世纪50年代初已建立了18类酶的数十种显色方法。Takamatsu(高松英雄)和Gomori于1939年同时证明了碱性磷酸酶的组织化学方法，这一年标志着酶组织化学真正开始，以后相继出现了许多酶的显示方法。此时，随着电子显微镜的问世和超薄切片技术的发展，Scheldon等(1955年)首先将超薄切片技术应用到酶组织化学中，在电镜下观察酸性磷酸酶的分布，Brand等(1956年)又用此法观察到碱性磷酸酶存在于溶酶体内，他们的成就
29、使组织化学技术与电镜技术结合起来，从而开创了电镜组织化学的新领域，使酶在细胞中的定位进入到亚细胞水平。第22页，此课件共71页哦1941年Coons和他的同事首次用荧光素标记抗体检测肺组织内肺炎双球菌而获得成功，开创了免疫细胞化学的新篇章。为在荧光显微镜下能够对酶进行观察，Coons等人(1950年)提出了荧光抗体法。但是，荧光标本不能长期保存以及需要价格昂贵的荧光显微镜才能观察。Nakane等人(1966年)尝试用酶代替荧光素来标记抗体的方法，从而成功地开创了酶标记抗体的新技术(酶标抗体法)。Sternberger等人(1970年)又将非标记抗体过氧化物酶法成功地引入，建立了过氧化物酶抗过氧
30、化物酶(PAP)法，使免疫酶法有了很大的进步。Geoghega(1978年)建立了胶体金标记术。Hsu等于20世纪80年代发明了亲和素生物素过氧化物酶复合物法(ABC法)。在此之后免疫金银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术等相继问世。随着抗原的提纯和抗体标记技术的改进，特别是德国人Kohler和英国人Milstein(1975年)建立杂交瘤制备单克隆抗体技术以来使免疫组织化学发展到一个新的水平，使免疫组织化学技术在生命科学研究中日益显示出巨大的实用价值。第23页，此课件共71页哦近二十年来，相继发现了多种亲和物质?如植物凝集素(1ectin)与糖结合物(glycolconjugate)、葡萄球
31、菌A蛋白(staphylococcalproteinA)与IgG、生物素(biotin)与卵白素(avldin)(亲和素)、激素、脂质与受体等。这些物质是一些有多价结合能力的物质，不但亲和物质之间有高度亲和力，而且可以与标记物如荧光素、酶、放射性核素、铁蛋白等相结合。Bayer(1976年)将这种利用两种物质之间的高度亲和力而相互结合的反应进行细胞化学检测的技术称为亲和细胞化学(affinitycytochemistry)。亲和细胞化学技术的建立。提高和增加了免疫细胞化学的敏感性和检测范围，是免疫细胞化学的新发展。第24页，此课件共71页哦分子杂交(insituhybridization)技术
32、引入免疫细胞化学，是现代免疫细胞化学向基因水平深入发展的重要标志。Hall(1961年)首先建立了液相核酸杂交技术，开创了核酸杂交技术的研究和应用。Bohon(1962年)设计了较简单的固相核酸杂交术。Gall和Pardue(1969年)应用蟾蜍核糖体基因探针与卵母细胞杂交，确定该基因位于细胞核的核仁内，开创了原位杂交组织化学技术的应用。Bauman(1981年)发明了用荧光素标记cRNA探针做原位杂交(FISH术)，Brigat(1983年)建立了生物素标记探针术。Boeringer等(1987年)发明了地高辛标记探针，并将药盒投放市场，使原位杂交的应用更安全和简便。1998年，Konone
33、n等首次提出组织芯片(tissuechip)的概念，并很快证实了其应用价值。组织芯片又称组织微阵列(tissuemlcroarray，TMA)，它是将数十个乃至数以千计不同来源的组织样品黏贴到同一张固相载体如玻璃片或硅片上，形成组织微阵列。在同一反应条件下对组织芯片进行免疫组织化学染色、原位杂交、FISH或原位PCR等，以了解病变组织与相应正常组织内靶基因或蛋白质的细胞来源、分布特征和表达差异等。它的最大便利之处在于可以对大量组织标本同时进行检测，缩短了检测时间，减少了不同染色玻片间人为造成的差异，使得各组织或穿刺标本间对某一生物分子的测定更具有可比性。组织芯片虽说是一种快速、高通量获取生物信
34、息的好方法，但是由于使用石蜡切片，对那些只能应用于冷冻组织切片的抗体或核酸分子杂交方法则不适合。为了弥补这一缺陷，最近美国又发展了冷冻细胞阵列(frozencellarray)，其基本原理与组织芯片相似，但使用的材料是新鲜的细胞系而不是经固定剂固定、石蜡包埋的组织第25页，此课件共71页哦细胞生物学发展与组织化学细胞生物学发展与组织化学细胞生物学是从细胞、亚细胞和分子三个水平研究生命活动规细胞生物学是从细胞、亚细胞和分子三个水平研究生命活动规律的科学，组织化学以细胞生物学为基础发展而来。显微镜的律的科学，组织化学以细胞生物学为基础发展而来。显微镜的发明与细胞的发现将人类对机体的认识从宏观世界引
35、向微观世发明与细胞的发现将人类对机体的认识从宏观世界引向微观世界的广阔领域，由此人们从肉眼所见的大体结构开始探索光学界的广阔领域，由此人们从肉眼所见的大体结构开始探索光学显微镜下组织细胞的微细结构，正因为有了对机体微细结构的显微镜下组织细胞的微细结构，正因为有了对机体微细结构的充分认识，才有可能产生对组织细胞的化学成分进行定性、定充分认识，才有可能产生对组织细胞的化学成分进行定性、定位和定量研究的渴求。然而，光学显微镜的分辨率有限，仅能位和定量研究的渴求。然而，光学显微镜的分辨率有限，仅能观察到细胞膜、细胞质和细胞核，对于亚细胞结构，即超微结观察到细胞膜、细胞质和细胞核，对于亚细胞结构，即超微
36、结构的观察无能为力。构的观察无能为力。19321932年，德国科学家年，德国科学家KnollKnoll和和RuskaRuska在西门在西门子子(Siemens)(Siemens)公司设计研制了世界上第一台透射电子显微镜。公司设计研制了世界上第一台透射电子显微镜。又把人类对机体的认识带入了超微结构领域。人们只有对机又把人类对机体的认识带入了超微结构领域。人们只有对机体结构深入了解。才可能透彻阐明其功能。著名生物学家体结构深入了解。才可能透彻阐明其功能。著名生物学家WilsonWilson的名言的名言“一切生物学关键问题必须在细胞中寻找一切生物学关键问题必须在细胞中寻找”，至，至今还有着很深的内涵
37、。细胞生物学的发展历程为组织化学的产今还有着很深的内涵。细胞生物学的发展历程为组织化学的产生和发展奠定了形态学基础。生和发展奠定了形态学基础。第26页，此课件共71页哦第二章组织学的研究方法第二章组织学的研究方法第一节概述第二节组织学制片概述 第三节取材和固定第四节固定后的处理第五节染色及染色方法第27页，此课件共71页哦第一节概述 组织学（组织学（histofogyhistofogy）是应用显微镜研究机体微细结构）是应用显微镜研究机体微细结构及其相关功能的科学，是在解剖学的基础上从宏观到微观及其相关功能的科学，是在解剖学的基础上从宏观到微观发展形成的，故又被称为显微解剖学（发展形成的，故又被
38、称为显微解剖学（microscopic microscopic anatomyanatomy）。）。组织学的研究内容，首先要研究组成机体的形态结构组织学的研究内容，首先要研究组成机体的形态结构与功能单位与功能单位细胞；继而 研究在细胞及其产物所组成的基本组织（primary tissueprimary tissue）上皮组织。结缔上皮组织。结缔组织、肌肉组织和神经组织；在此基础上研究各器官系组织、肌肉组织和神经组织；在此基础上研究各器官系统的微细结构及其有关功能统的微细结构及其有关功能.第28页，此课件共71页哦 组织学是重要的基础课程，只有对机体微细结构的深入了解才可能透彻地阐明其功能；组织
39、学的研究极大地促进了生理学的发展、生物化学的进步也促进了组织学的发展，例如，将生物化学及分子生物学的原理用于组织学而建立起组织化学及分子细胞学，将免疫学的原理用于组织学而建立起免疫组织化学等。从而使人们得知各种细胞与组织的化学组成、分子结构及其基本生命现象，这些知识已成为现代组织学的重要组成部分。第29页，此课件共71页哦第二节 组织学制片1.组织学制片方法组织学制片方法 非切片法非切片法直接取物体进行观察，不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法。直接取物体进行观察，不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法。包括：包括：a.a.整体封藏法整体封藏法 水螅水螅 鸡胚鸡胚 蛙胚蛙胚b.b.涂片法
40、涂片法 针对液体或半液体。针对液体或半液体。血液血液 骨髓骨髓 腹水腹水c.c.活体标本观察法活体标本观察法 蛙口腔黏膜的纤毛运动蛙口腔黏膜的纤毛运动 细胞吞噬细胞吞噬d.d.分离法分离法 分离三种肌细胞神经纤维脊髓前角神经细胞分离三种肌细胞神经纤维脊髓前角神经细胞e.e.铺片法铺片法 肠系膜可观察肥大细胞弹力纤维胶元纤维等肠系膜可观察肥大细胞弹力纤维胶元纤维等f.f.磨片法磨片法 骨组织或牙齿骨组织或牙齿 切片法切片法需依靠切片机将组织切成薄片的方法。需依靠切片机将组织切成薄片的方法。第30页，此课件共71页哦2.2.组织切片制作流程：组织切片制作流程：杀死、取材与固定、洗涤、脱水、透明、透
41、入、包埋、切片、贴片、染色、封藏。第31页，此课件共71页哦第三节取材和固定1.取材与固定（组织切片制作的关键步骤）取材：首首先先动动物物组组织织需需从从动动物物体体中中取取出出。方方法法有有多多种种,主主要要是是视视材材料料的的种种类类，实实验验动动物个体大小及观察的目的而定。物个体大小及观察的目的而定。杀死的方法：大的个体杀死的方法：大的个体(实验动物实验动物)用刀，斧头，麻醉等方法用刀，斧头，麻醉等方法.小的个体（实验动物）采用大号剪刀或断头法等。小的个体（实验动物）采用大号剪刀或断头法等。取材注意事项：取材需速度快，取材以后，应立即进行固定。否则细胞会自溶。取材注意事项：取材需速度快，
42、取材以后，应立即进行固定。否则细胞会自溶。第32页，此课件共71页哦固定 固定的目的：1.防止组织腐败及自溶。2.将所需要的物质原位沉淀、保存，尽量使各种成分保持与原来（活着）的状况相仿。3.沉淀下来以后，会造成组织的折光率的变化。即增加折光性，并使易染色。4.通过固定以后,使组织产生硬化现象,有利于切片的制作。第33页，此课件共71页哦 2 2固定的对象固定的对象 构成细胞的主要物质是蛋白质,它分散在细胞内,所以固定的对象是蛋白质。第34页，此课件共71页哦 作为固定剂的化学试剂必须具有能凝固或沉淀蛋白质,脂肪等成分,并具有强的渗透力.固定剂必须具备的性质固定剂必须具备的性质:1)迅速渗入组
43、织杀死原生质(渗透速度要快),即很快能将细胞杀死,不会使组织产生变化。2)渗透要均匀。(使组织内外尽量保持一致)3)尽量避免出现膨胀和收缩状况。4)尽量避免使组织块变形,卷曲。5)使细胞内蛋白质凝固,沉淀。6)增加折光性,媒染作用和染色能力。7)使组织变硬,适于切片,但又不至于使材料坚硬而松脆。8)固定以后,又能有保存组织的特性(如用福尔马林浸泡)。3组成固定剂的性质和条件组成固定剂的性质和条件 第35页，此课件共71页哦4.固定剂的作用方式（三种）固定剂的作用方式（三种）1)使蛋白质变性.蛋白质变性会成为沉淀物质,其是不可逆的.例：酒精使蛋白质变性不是与蛋白质形成化合物，而是使蛋白质脱水而使
44、之变性。2）固定剂与蛋白质发生化合作用，改变了蛋白质的结构，产生沉淀。3）使蛋白质冻胶化，固定液与蛋白质间起了化学上的结合，改变了分子结构，不产生沉淀，是使蛋白质凝胶化，并不溶与水。第36页，此课件共71页哦5.5.固定剂的媒染效果固定剂的媒染效果 生活细胞大多不易染色，但经过固定后便易染色，这是由于固定剂与蛋白质相结合，同时也能与染料分子结合，从而使蛋白质着色。第37页，此课件共71页哦6.6.固定剂的穿透率。穿透率要强，迅速，才能在短时间内使组织内外都得到固定。第38页，此课件共71页哦7.7.取材和固定应注意事项取材和固定应注意事项1）固定的材料要新鲜。组织会产生自溶。夏天不超过2-4小
45、时。材料取出后应立即固定,有些组织自溶很快。冬天不超过12小时。2）取材的部位要准确。（要清楚所需的材料位于动物体内哪个位置）3）取材工具要锋利，动作需仔细。4）切取的组织块必须小而薄，一般取0.3-0.5mm厚的组织块进行固定。5）清洗。如小肠组织需清洗其内的黏液及食物残渣，才能投入到固定剂内。6）组织块附加标记的方法。组织块取得较多并放在同一容器内，易发生混淆。应加标签以区别之，并注明固定液，材料，日期等。7）固定剂的用量。固定组织，一般所采用的固定液体积为组织块的10-15倍，容器勿过小，材料勿太多。第39页，此课件共71页哦8.8.常见固定剂的性质及使用常见固定剂的性质及使用-)-)单
46、纯固定剂 A 甲甲醛醛（纯甲醛为一种气体）溶于水成为甲醛水溶液或称福尔马林。市面上出甲醛浓度通常为37-40%。甲醛使用时，需采用新鲜的。放置时间较长的甲醛会变成多聚甲醛。为强的还原剂，其不可与氧化剂混合使用。作为固定剂的优点：渗透力强，使组织收缩少，固定均匀。能较好的固定脂肪，神经及髓鞘，且能固定高尔基体，线粒体。缺点：不能固定白蛋白和核蛋白。B B 乙醇乙醇（为无色透明的液体)其可与水与任意比例混合。优点:可以沉淀白蛋白,球蛋白,核蛋白。缺点:不宜作低温固定,渗透力较弱,使组织收缩,酒精浓度超过50%可溶解组织内的脂肪.类脂体,血色素等。C 醋酸（具刺激味的无色液体)固定组织通常用5%的H
47、AC。PH2-6，能防止细胞自溶及腐败。优点:其能沉淀核蛋白,是种好的染色质固定剂.穿透速度快.固定时间较短,通常1小时即可。缺点:其不能沉淀白蛋白、球蛋白使组织膨胀,高浓度HAC会破坏线粒体和高尔基。第40页，此课件共71页哦 D D 苦味酸苦味酸(常见的一种酸)为一种强酸,黄色结晶.其在干燥空气中激烈晃动,会发生爆炸,苦味酸的运输以溶解在水中的饱和苦味酸,浓度为1%。作为固定液的优点:能沉淀所有的蛋白质。缺点:使组织收缩，穿透力弱。E 重重铬铬酸酸钾钾 橙红色的结晶,强氧化剂,不可与还原剂(酒精)等混用.重铬酸钾溶液中加醋酸后,产生铬酸,才能使蛋白质产生沉淀。优点:穿透力较强。缺点:使组织
48、产生一点膨胀。F.F.锇酸锇酸(四氧化锇)为黄色的结晶,为强的氧化剂。优点:其为脂肪及类脂体的唯一的固定剂,能将线粒体及高尔基体固定成为黑色.可保持组织柔软。缺点:穿透速度慢,难固定组织,毒性高,易损伤眼睛及黏膜,价格昂贵。G G 氯化汞:通称升汞,剧毒,呈白色粉末状,以针状结晶为最纯。优点:其对蛋白质有较强的沉淀作用,能沉淀一切蛋白质(包括核蛋白)，能充分固定细胞质和细胞核。缺点：第41页，此课件共71页哦二二)混合固定液.Bouin.Bouin液液 苦味酸饱和水溶液甲醛冰醋酸该固定液渗透力强,使组织收缩少.固定时间12-24小时.Carnoy液无水乙醇氯仿冰醋酸对组织穿透速度快,多用于糖原
49、,脱氧核糖核酸固定.Zenker液重铬酸钾升汞双蒸水冰醋酸采用该液,须脱汞处理.Helly液重铬酸钾升汞双蒸水甲醛第42页，此课件共71页哦第四节 固定后的处理1.洗涤洗涤的目的 组组织织在在固固定定后后一一定定要要把把渗渗入入组组织织里里面面的的固固定定液液洗洗去去，然然后后进进行行下下一一个个过过程程，为为防防止止组组织织中中留留有有较较多多的的固固定定剂剂影影响响脱脱水水剂剂，甚甚至至可可在在组组织织中中发发生生沉沉淀淀或或结结晶晶而而影影响响观观察察，特特别别是是对对陈陈旧旧性性标标本本更更应应注注意意流流水水冲冲洗洗，尽尽可可能能减减少少组组织织中中的的酸酸性性程程度度和和甲甲醛醛色
50、色素素。对对于于混混合合性性固固定定液液，更更应应及及时时洗洗涤涤，有有利利于于脱脱水，切片和染色。水，切片和染色。第43页，此课件共71页哦洗涤的方法1 1固定剂以水配置者固定剂以水配置者 用用流流水水冲冲洗洗，可可使使组组织织中中固固定定液液随随时时溢溢出出和和随随时时洗洗去去。大大的的动动物物组组织织冲冲洗洗时时间间为为2424小小时时左左右右，小小动动物物组组织织冲冲洗洗时时间间为为2-102-10小小时时。冲冲洗洗的的时时间间基基本本根根据据固固定的时间而定定的时间而定,新鲜的标本固定时间短新鲜的标本固定时间短,需及时脱水者需及时脱水者,冲洗时间短。冲洗时间短。2 2 固定剂含乙醇者