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1、基因重组与基因工程基因重组与基因工程生物工程定义 生物工程是生物工程是生物技术生物技术的总称，是对生命有机体的总称，是对生命有机体在在分子分子水平、水平、细胞细胞水平、水平、组织组织水平、水平、个体个体水平进行水平进行不同层次的创造性设计和改造，使之能定向组建具不同层次的创造性设计和改造，使之能定向组建具有特定性状的新物种或新品系，从而造福人类的现有特定性状的新物种或新品系，从而造福人类的现代应用技术学科。代应用技术学科。生物技术的四大体系生物技术的四大体系基因工程基因工程细胞工程细胞工程酶工程酶工程发酵工程发酵工程 重组重组DNA技术（技术（recombinant DNA technique
2、），又叫，又叫DNA克隆克隆（DNA cloning）。在体外将各种来源的遗传物质。在体外将各种来源的遗传物质同源的或异源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的同源的或异源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的DNA与与载体载体DNA结合成一结合成一具有自我复制能力具有自我复制能力的的DNA分子（复制分子（复制子），继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的子），继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，以获得该转化子细胞，再进行扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝。这分子的大量拷贝。这类克隆是在分子水平上操作，故又称类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆（
3、分子克隆（molecular cloning）。一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念（一）（一）DNA克隆克隆 由于由于DNA克隆克隆研究对象常常是特异的基因片研究对象常常是特异的基因片段，所以又称作段，所以又称作基因克隆（基因克隆（gene cloning）。实。实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为基因基因工程（工程（genetic engineering）。1997年年2月月23日日英国英国 Wilmut 从复杂的生物有机体基因组中，从复杂的生物有机体基因组中，分分离出离出目的基因目的基因片段。片段。用合适的酶用合适的酶切切割割目的基因和
4、载体目的基因和载体，产生匹配的末端，产生匹配的末端 在体外，将目的基因片段连在体外，将目的基因片段连接接到能自我复制的并且具有到能自我复制的并且具有 选择标记的载体分子上，形成选择标记的载体分子上，形成重组重组DNA分子分子。将重组将重组DNA分子分子转转移到适当的移到适当的受体细胞受体细胞（亦称宿主细胞），（亦称宿主细胞），并与之一起增殖。并与之一起增殖。筛筛选选出出获获得得了了重重组组DNA分分子子的的受受体体细细胞胞克克隆隆。从从筛筛选选出出的的阳性克隆阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。基因克隆的基本步骤基因克隆的基本步骤
5、基因克隆的基本步骤基因克隆的基本步骤粘性末端粘性末端质粒质粒目的基因目的基因粘性末端粘性末端匹配的粘性末端匹配的粘性末端酶切后的目的基因片段酶切后的目的基因片段接接(连接连接)连接后的重组连接后的重组质粒质粒DNA分子分子重组质粒重组质粒目的基因目的基因大肠杆菌大肠杆菌转转(转化转化)染色体染色体真好玩!筛筛(筛选筛选)分解抗生分解抗生素的酶素的酶含抗生素的培养基含抗生素的培养基还活着还活着!玩完啦玩完啦!大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大量生长大量生长提取大量提取大量质粒质粒酶酶切切鉴定鉴定您已经掌握基因克隆的主要步骤！分分离目的基因和载体离目的基因和载体DNA。用合适的酶用合适的酶切切割上
6、述割上述两者，产生匹配的末两者，产生匹配的末端。端。连连接接酶将目的基因装酶将目的基因装入载体。入载体。转转入细菌。入细菌。筛筛选具有抗药性克隆。选具有抗药性克隆。（二）重组（二）重组DNA中的工具酶中的工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 连接酶连接酶 聚合酶聚合酶 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶1.限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）定义：定义：能识别能识别DNA的的特异序列特异序列，并在识别位点或其周围，并在识别位点或其周围切割双切割双链链DNA的一类核酸内切酶。的一类核酸内切酶。主要来源于原核生物，可将侵入宿主细
7、胞的外源性主要来源于原核生物，可将侵入宿主细胞的外源性DNA迅迅速降解，而对细菌自身的速降解，而对细菌自身的DNA，则通过甲基化酶在该限制酶切，则通过甲基化酶在该限制酶切位点甲基化修饰而保护自身的位点甲基化修饰而保护自身的DNA不被降解。不被降解。限制性内切酶和限制性内切酶和甲基化酶甲基化酶共同构成细菌的共同构成细菌的限制和修饰限制和修饰系统。限制性内切酶由于系统。限制性内切酶由于能限制外源能限制外源DNA的的“入侵入侵”而得名。而得名。限制酶的命名限制酶的命名 限限制制酶酶的的命命名名是是根根据据含含有有该该酶酶的的微微生生物物种种属属而而定定。通通常常有三个斜体字母的缩写表示。有三个斜体字
8、母的缩写表示。第一个大写字母第一个大写字母取自取自细菌属名细菌属名的第一个字母；的第一个字母；第二、三个小写字母第二、三个小写字母取自微生物取自微生物种名种名的头两个字母；的头两个字母；第第四四个个字字母母代代表表该该微微生生物物同同种种内内不不同同的的株株系系；如如果果同同一一株株名名发发现现几几种种限限制制酶酶，则则根根据据其其被被发发现现和和分分离离的的先先后后顺顺序序，用用罗罗马数字马数字表示。表示。例例如如，从从大大肠肠杆杆菌菌（Escherichia Coli）RY13株株中中发发现现分分离离的的第一种限制酶，称为第一种限制酶，称为EcoR I。限制性内切酶的分类和特点限制性内切酶
9、的分类和特点 根据限制酶的组成、辅因子及切割根据限制酶的组成、辅因子及切割DNA方式不同，可方式不同，可分为分为 I、II、III型。重组型。重组DNA技术中常用的是技术中常用的是II型限制性内型限制性内切酶切酶。II型酶作用特点是有严格的识别、切割顺序，以内切型酶作用特点是有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的中的磷酸二酯键，产生的DNA片段片段5 端端为磷酸基为磷酸基，3 端为羟基端为羟基。识别顺序一般为。识别顺序一般为46个碱基，通常个碱基，通常是是回文结构（回文结构（palindrome）。回文结构回文结构 II类限制性核酸内切酶识别类限制性
10、核酸内切酶识别DNA 位点的核苷酸序列呈位点的核苷酸序列呈二二元旋转对称元旋转对称，通常称这种特殊的结构顺序为，通常称这种特殊的结构顺序为回文结构回文结构。EcoR I 5 GAATT C3 3 C TTAAG5 II型酶切割双链型酶切割双链DNA产生产生3种种不同的切口：不同的切口：在在对对称称轴轴中中心心同同时时切切割割双双链链，产产生生平平末末端端或或称称钝钝性性末末端端（blunt end），如），如Hpa I：5 GTTAAC3 Hpa I 5 GTT AAC33 CAATTG5 3 CAA TTG 5 在在对称轴两侧相对位点对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从分别切割一条链。从 5
11、 端端切割产生切割产生 5 端突出的粘性末端端突出的粘性末端，如，如EcoRI：5 GAATT C3 EcoR I 5 G AATTC33 C TTAAG5 3 CTTAA G 5 从从3 端端切割产生切割产生3 端突出的粘性末端端突出的粘性末端。如。如Pst I：5 C TGCAG3 Pst I 5 CTGCA G33 GACGT C5 3 G ACGTC 5 表表15-2一些常用的限制性内切酶位点一些常用的限制性内切酶位点 一些限制酶虽然识别序列不完全相同，但能产生一些限制酶虽然识别序列不完全相同，但能产生相同类型的粘性末端，称为相同类型的粘性末端，称为同尾酶同尾酶，所产生的末端称，所产生
12、的末端称配伍末端（配伍末端（compatible end），可进行相互连接。产生，可进行相互连接。产生平末端的酶切割平末端的酶切割DNA后，也可彼此连接。后，也可彼此连接。连接酶可催化连接酶可催化DNA分子中相邻分子中相邻5 磷酸磷酸和和3 羟基羟基末端之间末端之间形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键，使，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段分子或片段连接。常用的有连接。常用的有T4（噬菌体）（噬菌体）DNA连接酶和连接酶和E.Coli DNA连接连接酶。酶。2.DNA连接酶连接酶3.聚合酶聚合酶 重组重组DNA技术中，聚合酶（技术中，聚合酶（polymerase）的最重要作）的最
13、重要作用是以用是以DNA或或RNA为模板在体外合成为模板在体外合成DNA或或RNA。可分为。可分为DNA聚合酶聚合酶和和RNA聚合酶聚合酶两大类。两大类。名称名称 功能及应用功能及应用大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 以以DNA为模板，催化为模板，催化5 3 核酸链的延长，另有核酸链的延长，另有3 5 的外切酶的外切酶 大片段大片段（klenow）活性。常用于活性。常用于DNA 3 末端的标记和填充、末端的标记和填充、cDNA第二链的合成、第二链的合成、DNA测序。测序。Taq DNA聚合酶聚合酶 以以DNA为模板，催化为模板，催化5 3核酸链的延长，另有核酸链的延长，另有弱的弱的5 3的
14、外切的外切 酶酶活性，耐高温。常用于活性，耐高温。常用于PCR及及DNA测序。测序。末端转移酶末端转移酶 催化催化NTP中的中的NMP通过其磷酸基与通过其磷酸基与DNA 3-OH连接而使连接而使DNA链链 延长，延长，无需模板无需模板。常用于。常用于3 端标记或形成端标记或形成DNA共聚尾巴。共聚尾巴。逆转录酶逆转录酶 以以RNA为模板，合成为模板，合成cDNA链链（5 3），另有），另有RNA酶酶H活性。常活性。常 用于用于cDNA第一、二链的合成及反转录第一、二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。）。RNA聚合酶聚合酶 以以DNA为模板合成为模板合成RNA。常用于离体条件下，合成单链。
15、常用于离体条件下，合成单链RNA作为作为 杂交探针。杂交探针。T4多核苷酸激酶（多核苷酸激酶（polynucleotide kinase）催化）催化ATP的的-磷酸基磷酸基转移至转移至DNA或或RNA的的5 末端羟基末端羟基上。常用于单链上。常用于单链或双链或双链DNA和和RNA探针的探针的5 端标记。端标记。4.多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶5.碱性磷酸酶碱性磷酸酶 牛小肠碱性磷酸酶（牛小肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase,CIP），催化），催化DNA或或RNA的的5 磷酸基水解磷酸基水解。常用于去除线状载。常用于去除线状载体体DNA两端的两
16、端的5 磷酸基团，磷酸基团，防止载体自身连接环化防止载体自身连接环化；也用于用；也用于用32P标记标记DNA的的5 末端之前除去原来的末端之前除去原来的5 磷酸基。磷酸基。应用重组应用重组DNA技术有时是为分离、获得某一技术有时是为分离、获得某一感兴趣的基感兴趣的基因或因或DNA片段片段，或是获得感兴趣的表达产物，或是获得感兴趣的表达产物 蛋白质蛋白质。这。这些感兴趣的基因或些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因。目的基因有两种序列就是目的基因。目的基因有两种类型，即类型，即cDNA和和基因组基因组DNA。（三）目的基因（三）目的基因（target gene）（四）（四）基因工程载体基因工程载
17、体基因载体：基因载体：或称或称克隆载体（克隆载体（cloning vector）,是在基因工程中是在基因工程中为为“携带携带”感兴趣的感兴趣的外源外源DNA（目的基因、外源基因目的基因、外源基因）、实）、实现外源现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，具有自我复制和表达功能。其中，为使插入的外分子，具有自我复制和表达功能。其中，为使插入的外源源DNA 序列可转录、进而翻译成多肽链而特异设计的克隆载序列可转录、进而翻译成多肽链而特异设计的克隆载体又称体又称表达载体表达载体。能能自主复制自主复制并能并能带动插入的目的基因一起复制带
18、动插入的目的基因一起复制。具有一个以上的单一具有一个以上的单一限制性酶切位点（多克隆位点限制性酶切位点（多克隆位点，multiple cloning sites），以便目的基因的），以便目的基因的 插入。插入。具有合适的具有合适的筛选标记筛选标记（如抗药性基因，酶基因等），以（如抗药性基因，酶基因等），以 便筛选阳性克隆。便筛选阳性克隆。载体载体分子量小分子量小，以便容纳较大目的基因，拷贝数高。，以便容纳较大目的基因，拷贝数高。在细胞内在细胞内稳定性高稳定性高，以便确保重组体稳定传代而不易丢失。，以便确保重组体稳定传代而不易丢失。理想载体应具备的基本条件理想载体应具备的基本条件载体的分类载体的
19、分类 质粒质粒（plasmid）噬菌体噬菌体（phage）病毒病毒（virus）克隆载体克隆载体（cloning vector）表达载体表达载体（expression vector）常用的载体按来源分为常用的载体按来源分为载体按得到的产物分类可分为载体按得到的产物分类可分为质粒（质粒（plasmid）质粒是存在于细菌染色体外的小型质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链环状双链DNA分子，分子，能在宿主细胞能在宿主细胞独立自主地进行复制独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息遗传信息，会赋予宿，会赋予宿主细
20、胞主细胞新的遗传性状新的遗传性状。因为质粒。因为质粒DNA有自我复制功能及携有自我复制功能及携带遗传信息等特性，可作为重组带遗传信息等特性，可作为重组 DNA操作的载体。操作的载体。染色体染色体质粒质粒 pBR322 质粒图谱氨苄青霉素氨苄青霉素抗性基因抗性基因四环素抗四环素抗性基因性基因多克隆位点多克隆位点噬菌体载体噬菌体载体 噬菌体是一种细菌病毒，可作为克隆载体。是一种细菌病毒，可作为克隆载体。目前使目前使用的噬菌体载体主要有用的噬菌体载体主要有噬菌体噬菌体衍生物载体、衍生物载体、M13噬菌体噬菌体载体等。除载体等。除M13噬菌体载体外，这类载体的特点是其噬菌体载体外，这类载体的特点是其容
21、量容量比质粒载体比质粒载体大大，即可插入较大的外源，即可插入较大的外源DNA片段（如片段（如20kb以上）。以上）。可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。噬 菌 体头部头部尾部尾部尾丝尾丝 噬菌体噬菌体 噬噬菌菌体体（lambdla bacteriophage）是是一一种种大大肠肠杆杆菌菌病病毒毒，为为线线性性双双链链DNA，它它的的两两端端各各有有12个个碱碱基基的的互互补补粘粘性性末末端端，称称COS位位点点。当当噬噬菌菌体体侵侵入入宿宿主主细细胞胞，两两个个粘粘性性末末端端互互补补结结合合，形形成成环环状状分分子子。DNA在在体体外外可可包包
22、装装成成病病毒毒颗颗粒粒，并并高高效效感感染染大肠杆菌。大肠杆菌。噬菌体侵入细菌后，即可噬菌体侵入细菌后，即可裂解生长裂解生长（环状（环状DNA在细菌在细菌中多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗中多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌），又可以粒，裂解宿主菌），又可以溶源生长溶源生长（噬菌体噬菌体DNA整合整合到细胞染色体基因组到细胞染色体基因组DNA中，与染色体中，与染色体DNA一起复制，一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解）。并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解）。噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌示示意意图图裂解生长裂解生长 噬噬菌菌体体基基因因组组中
23、中有有较较大大区区域域仅仅与与溶溶源源生生长长有有关关，而而对对裂裂解解生生长长并并非非绝绝对对需需要要，因因此此可可以以缺缺失失或或被被外外源源DNA取取代代。经改造的经改造的噬菌体衍生载体可分两类噬菌体衍生载体可分两类:一一类类是是插插入入型型载载体体，即即外外源源基基因因插插入入到到载载体体上上单单一一的的限限制酶位点，如制酶位点，如gt系列等。系列等。另另一一类类是是置置换换型型，即即两两个个限限制制酶酶位位点点之之间间的的DNA片片段段可可被外源被外源DNA取代，如取代，如Charon，EMBL系列等。系列等。M13噬菌体载体噬菌体载体 M13噬噬菌菌体体基基因因组组是是单单链链环环
24、状状DNA，当当它它侵侵犯犯宿宿主主菌菌后后，在在细细菌菌胞胞内内酶酶的的作作用用下下，单单链链DNA转转变变成成复复制制型型双双链链DNA，可提取出来做基因重组。，可提取出来做基因重组。经改造的经改造的M13噬菌体有噬菌体有M13 mp系列和系列和pUC系列。系列。M13噬菌体载体噬菌体载体pUC19互补互补：单独存在的：单独存在的及及 片段都没有半乳糖苷酶片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞的活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两与克隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内个片段时，宿主细胞内才有才有 半乳糖苷酶活性，半乳糖苷酶活性，使特异性作用物（使特异性作用物（X-gal）变为）变为蓝
25、色化合物蓝色化合物。突变型突变型lac-E.coli表达表达-半乳糖苷半乳糖苷酶的酶的 片段片段。如果插入的外源基因是在如果插入的外源基因是在lacZ基因内，就会影基因内，就会影响响lacZ的表达，利用的表达，利用lac-E.coli为转染或感染细为转染或感染细胞，在含胞，在含X-gal的培养基上生长时会出现的培养基上生长时会出现白色菌白色菌落落；若无外源基因插入，则出现；若无外源基因插入，则出现蓝色菌落蓝色菌落。多克隆位点多克隆位点编码编码-半乳半乳糖苷酶的糖苷酶的片段片段病毒载体病毒载体 是一类是一类真核载体真核载体，能把基因引入到，能把基因引入到 真核细胞中，并真核细胞中，并在其中被表达
26、。因此是研究真核细胞表达及调控的有力在其中被表达。因此是研究真核细胞表达及调控的有力工具。如工具。如:腺病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒等。腺病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒等。二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理 目的基因目的基因的获取的获取 克隆克隆载体载体的选择和构建的选择和构建 外源基因与载体的外源基因与载体的连接连接 重组重组DNA导入受体菌导入受体菌 重组体的重组体的筛选筛选 克隆基因的克隆基因的表达表达（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取 化学合成法化学合成法 基因组基因组DNA cDNA 聚合酶链反应聚合酶链反应1.化学合成法化学合成法 已已知知某某种种基基因因的的核核苷
27、苷酸酸序序列列，或或根根据据某某种种基基因因产产物物的的氨氨基基酸酸序序列列推推导导出出编编码码该该多多肽肽链链的的核核苷苷酸酸序序列列，再再利用利用DNA合成仪合成仪通过化学合成原理合成目的基因。通过化学合成原理合成目的基因。利利用用该该法法合合成成的的基基因因有有：人人生生长长激激素素释释放放抑抑制制因因子、子、胰岛素原、胰岛素原、脑啡肽、干扰素基因等脑啡肽、干扰素基因等2.基因组基因组DNA 利用利用限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶将染色体将染色体DNA切割成一定基因水平切割成一定基因水平的许多片段，将这些片段与适当的克隆载体拼接成重组的许多片段，将这些片段与适当的克隆载体拼接成重组DN
28、A分分子，继而子，继而转入受体菌转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带扩增，使每个细菌内都携带一种一种重组重组DNA分子的多个拷贝。分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组不同细菌所包含的重组DNA分子可能为不同的染色体分子可能为不同的染色体DNA片段，这样全部转化细菌所携带的各种染色体片段就代表了染片段，这样全部转化细菌所携带的各种染色体片段就代表了染色体的整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的色体的整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有所有基因组基因组DNA片段的集合片段的集合称为称为基因组基因组DNA文库文库（genomic DNA library）。基因组）。基因组DN
29、A文库涵盖了基因组全部的遗传信息。文库涵盖了基因组全部的遗传信息。建建立立基基因因组组文文库库后后，需需结结合合适适当当筛筛选选方方法法从从众众多多转转化化子子菌菌落落中中选选出出含含有有某某一一基基因因的的菌菌落落，再再进进行行扩扩增增，将将重组重组DNA分离、回收，以获得目的基因。分离、回收，以获得目的基因。3.cDNA 把把细细胞胞总总mRNA通通过过逆逆转转录录合合成成总总cDNA，再再与与适适当当载载体体连连接接后后转转入入受受体体菌菌，从从而而得得到到含含有有某某种种生生物物体体全全部部cDNA集集合合（称称为为cDNA 文文库库，cDNA library）。然然后后用用适当的方法
30、从适当的方法从cDNA文库中文库中筛选筛选出目的出目的cDNA。cDNA文库文库的特点是它只包括已经的特点是它只包括已经被转录被转录成成mRNA的的那些那些基因序列基因序列，且，且不包括内含子及调控序列不包括内含子及调控序列，所以，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。文库的复杂性要比基因组文库低的多。但由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的但由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达所决定的，因此各自的特定状态是由特定基因的表达所决定的，因此各自的mRNA种类就不同，由此产生的种类就不同，由此产生的cDNA又是独特的。与又是独特的。与基因组基因组DNA文
31、库类似，由文库类似，由总总mRNA制作的制作的cDNA文库包文库包含了细胞表达的各种含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴信息，自然也含有我们感兴趣的编码趣的编码cDNA。4.4.聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase polymerase chainchain reaction,PCR reaction,PCR）参见参见437页页Chain ReactionChain ReactionPolymerasePolymerase chain reaction chain reactionPCRPCR的产物数目的产物数目的产物数目的产物数目以指数级方式增长以指数级方式增长以指
32、数级方式增长以指数级方式增长中子的释放数目中子的释放数目中子的释放数目中子的释放数目以指数级方式增长以指数级方式增长以指数级方式增长以指数级方式增长中子中子中子中子原子核原子核原子核原子核短时间内巨大的短时间内巨大的短时间内巨大的短时间内巨大的能量释放，能量释放，能量释放，能量释放，原子爆炸原子爆炸原子爆炸原子爆炸DNADNA片段片段片段片段Cycle 1Cycle 1Cycle 2Cycle 2Cycle 3Cycle 3Cycle NCycle N理论上可达理论上可达理论上可达理论上可达2 2n n个拷贝个拷贝个拷贝个拷贝原料原料原料原料（pgpg）产物产物产物产物(ugug)PCR PC
33、R 的基本原理的基本原理体外体外高效、快速、特异高效、快速、特异地扩增目的基因或地扩增目的基因或DNA片段的片段的技术技术。其原理类似于其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给的体内复制，只是在试管中给DNA的体的体外合成提供一种合适条件外合成提供一种合适条件模板模板DNA，寡核苷酸引物，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸变性、复性及延伸的温度与时间等，使的温度与时间等，使目的目的DNA得以迅速扩增得以迅速扩增 DNA的体内复制：的体内复制：原料：原料：模板模板DNA（基因组基因组DNA），），随机小分子随机小分子RNA引物，引物
34、，dNTPs酶：酶：DNA聚合酶，解旋酶，引发酶聚合酶，解旋酶，引发酶反应条件：反应条件：胞液环境，胞液环境，37 反应过程：反应过程：模板模板DNA解旋、引发体的解旋、引发体的形成、延长形成、延长（三阶段）（三阶段）产物：产物：模板模板DNA（基因组基因组DNA）拷）拷贝数增加贝数增加一倍一倍 原料：原料：模板模板DNA（基因组基因组DNA，cDNA）一对一对特异性特异性寡核苷酸引物，寡核苷酸引物，dNTPs酶：酶：Taq DNA聚合酶聚合酶反应条件：反应条件：合适的缓冲液，三种合适的缓冲液，三种变化的变化的温度温度（94，50-70，72），一定的），一定的循环循环数数（25-35）l反应
35、过程：反应过程：DNA模板变性（解链）、模板变性（解链）、模板与引物退火模板与引物退火、引物延伸、引物延伸（三阶段，（三阶段，多循环多循环）l产物：产物：目的目的DNA（特异性）拷贝数增加（特异性）拷贝数增加2 2n n倍倍PCR：DNADNA模板变性模板变性与体内与体内DNA解链过程不同，解链过程不同，PCR中作为模板的中作为模板的双链双链DNA是通过是通过95左右的左右的高温高温使其发生变性，形成使其发生变性，形成单链单链DNA 模板与引物退火模板与引物退火 PCR通通常常需需要要两两条条寡寡核核苷苷酸酸链链作作为为DNA合合成成时时的的引引物物（primer）,这这两两个个引引物物分分别
36、别与与待待扩扩增增模模板板DNA的的目目标标片片段段两两端端的的序序列列互互补补。在在降降低低温温度度的的过过程程中中，通通过过控控制制退退火火条件条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。primers引物引物短短，不易缠绕；，不易缠绕；设计的引物是与模板设计的引物是与模板DNA两端序列互补；两端序列互补；引引物物的的量量远远大大于于模模板板分分子子的的量量，引引物物与与模模板板DNA形形成成双双链的几率远远高于链的几率远远高于DNA分子自身的复性。分子自身的复性。引物延伸引物延伸在在PCR反应体系中的反应体系中的DNA聚合酶聚合酶，能够催化反应体系中游
37、，能够催化反应体系中游离的单核苷酸（离的单核苷酸（dNTPs）由引物）由引物53方向，按碱基配对方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。互补的复制链。Taq 酶酶dNTPSl 新合成的链又可作为下轮循环反应的模板新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。热变性热变性-复性复性-延伸延伸的过程就是一个的过程就是一个PCR循环循环 每一循环后的模每一循环后的模板均比前一循环增加板均比前一循环增加1倍。理论上讲，扩增倍。理论上讲，扩增DNA产量是呈指产量是呈指数上升的，即数上升的，即n个循环后，产量为个循环后，产量为2n拷贝。而实际上，拷贝。而实际上，PC
38、R的的扩增倍数为扩增倍数为（1+X）n，X为扩增效率，平均为为扩增效率，平均为75%热变性热变性-复性复性-延伸延伸25-35 次循环次循环百万倍扩增百万倍扩增尽管尽管PCR扩增扩增DNA非常有效，但目的非常有效，但目的DNA序列的指数扩增序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。并不是一个无限制的过程。在正常的反应条件下，经在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现饱和，就会出现平台效应平台效应(Plateau)，产物的量不再增加。，产物的量不再增加。“平台效应平台效应”出现的迟早还取决于出现的迟早还取决于酶的性能酶的性能、模板、模板DNA的
39、的拷拷贝数、贝数、dNTP浓度浓度等多种因素。等多种因素。（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接（二）克隆载体的选择（二）克隆载体的选择 粘性末端连接粘性末端连接 平端连接平端连接 同聚物加尾连接同聚物加尾连接 人工接头连接人工接头连接1.粘性末端连接粘性末端连接 外源外源DNA片段与片段与载体用载体用同一种同一种限制性限制性内切酶切割，获得相内切酶切割，获得相同的粘性末端，相互同的粘性末端，相互互补配对，在互补配对，在DNA连连接酶作用下，形成重接酶作用下，形成重组组DNA分子。分子。5CCG G3 5C CGG33G GCC5 3G GC C 5Hpa II2.平端连接平端连
40、接 因因载载体体分分子子和和目目的的DNA分分子子之之间间并并不不一一定定都都产产生生互互补补的的粘粘性性末末端端，有有的的限限制制性性内内切切酶酶只只能能切切成成平平末末端端。平平末末端端仍仍用用T4DNA连接酶连接酶连接，只是连接，只是效率低效率低，需要的，需要的DNA浓度更高。浓度更高。3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接 同聚物加尾连同聚物加尾连接是利用同聚物序接是利用同聚物序列，如列，如polyG与与poly C之间的之间的退火退火作用完作用完成连接。成连接。在在末端转移酶末端转移酶作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，如将片段末端加上同聚物序列，如将poly（dC）加到双链
41、）加到双链DNA片段片段3 羟基上，而将羟基上，而将poly（dG）加到质粒）加到质粒载体载体3 羟基上，制造出羟基上，制造出粘性末端粘性末端，然后进行粘性末端连接。，然后进行粘性末端连接。4.人工接头连接人工接头连接 接接头头（linker）是是指指人人工工合合成成的的一一段段双双链链寡寡核核苷苷酸酸，其其中中包包含含一一个个（或或两两个个）酶酶切切位位点点。首首先先将将接接头头与与目目的的DNA片片段段进进行行平平末末端端连连接接，继继而而用用适适当当的的内内切切酶酶将将接接头头部部位切出粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接。位切出粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接。（四）重组体导入受体
42、细胞四）重组体导入受体细胞 在在分分子子克克隆隆中中，将将质质粒粒或或以以它它为为载载体体构构建建的的重重组组分分子子导导入入受体细胞的过程称为受体细胞的过程称为转化（转化（transformation）。以以噬噬菌菌体体和和真真核核病病毒毒作作载载体体构构建建的的重重组组分分子子导导入入受受体体细细胞胞的过程称为的过程称为转染（转染（transfection）。基基因因片片段段（特特别别是是纯纯化化的的DNA）很很难难直直接接导导入入受受体体细细胞胞，通通常常将将受受体体细细胞胞预预先先加加以以处处理理，使使其其提提高高基基因因导导入入细细胞胞的的效效率率。例例如如用用低低温温CaCl2（冰
43、冰浴浴）处处理理大大肠肠杆杆菌菌，可可以以大大大大提提高高质质粒粒的的转转化化效效率率。这这种种经经过过预预处处理理的的、容容易易导导入入外外源源核核酸酸分分子的受体细胞被称作子的受体细胞被称作“感受态细胞感受态细胞”（competent cell）。（五）重组体的筛选五）重组体的筛选 通通过过转转化化、转转染染等等方方式式，重重组组体体DNA分分子子被被导导入入受受体体细细胞胞，经经适适当当涂涂布布的的培培养养基基培培养养得得到到大大量量转转化化子子菌菌落落或或转转染染噬噬菌菌斑斑。因因为为每每一一重重组组体体只只携携带带某某一一段段外外源源基基因因，而而转转化化或或转转染染时时每每一一受受
44、体体菌菌又又只只能能接接受受一一个个重重组组体体分分子子，所所以以设设法法将将众众多多的的转转化化菌菌落落或或噬噬菌菌斑斑区区分分开开来来，并并鉴鉴定定哪哪一一菌菌落落或或噬噬菌菌斑斑所所含含的的重重组组DNA分分子子确确实实带带有有目目的的基基因因，即即可可得得到到目目的的基基因因的克隆，这一过程即为的克隆，这一过程即为筛选（筛选（screening）。根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取不同的筛选方法。胞表达情况不同，可采取不同的筛选方法。1.直接筛选法直接筛选法 （1）抗药性标志筛选）抗药性标志筛选 （2）标志补救
45、）标志补救 （3）分子杂交法）分子杂交法2.非直接筛选法非直接筛选法 免疫学方法免疫学方法抗药性标志筛选抗药性标志筛选 如果克隆载体携带有某种如果克隆载体携带有某种抗药性标志基因抗药性标志基因，如，如Ampr或或Tetr，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗生素的培养板上生存并形成菌落，这样就可将转化菌与非抗生素的培养板上生存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。转化菌区别开来。如果重组如果重组DNA时将时将外源基因插入标志基因内外源基因插入标志基因内，如插入，如插入Tetr内，使标志基因内，使标志基因Tetr失活失活，阳性
46、重组子则不能在含有，阳性重组子则不能在含有Tet的培养板上生长。用的培养板上生长。用插入失活插入失活筛选的重组子载体往往带有筛选的重组子载体往往带有另一个抗生素抗性基因另一个抗生素抗性基因如如Ampr，因此可以通过，因此可以通过双抗生素双抗生素对对照筛选，即阳性转化子可以在含照筛选，即阳性转化子可以在含Amp的培养板上生长而不的培养板上生长而不能在含能在含Tet的培养板上生长。的培养板上生长。标志补救标志补救 若克隆的基因能够在宿主菌内表达，且表达产物若克隆的基因能够在宿主菌内表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，则可以利用与宿主菌的营养缺陷互补，则可以利用营养突变菌株营养突变菌株进行筛选，
47、这就是进行筛选，这就是标志补救（标志补救（marker rescue）。-互补：互补：通过通过蓝白斑蓝白斑筛选可以筛选、鉴定重组体与筛选可以筛选、鉴定重组体与非重组体载体。非重组体载体。当外源基因插入后，当外源基因插入后，LacZ基因被破坏，基因被破坏，不能合成完整的不能合成完整的-半半乳糖苷酶，因此不乳糖苷酶，因此不能分解底物能分解底物X-gal，菌落成菌落成白色白色-半半乳乳糖糖苷苷酶酶能能分分解解X-gal，形形成成蓝色蓝色菌落。菌落。分子杂交法（分子杂交法（molecular hybridization）参见参见435页页核酸分子杂交核酸分子杂交（molecular hybridiza
48、tion）：指用标记的已知）：指用标记的已知DNA或或RNA片段（片段（探针探针）检测样品中未知核酸序列，通过碱基）检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。合的核酸序列的位置或大小显示出来。探针探针：带有可检测标记的已知序列的：带有可检测标记的已知序列的DNA或或RNA片段。片段。核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理变性（变性（denaturation）复性（复性（renaturation）杂交（杂交（hybridization）预杂交（预杂交（preh
49、ybridization）变性（变性（denaturation）l概概念念：在在某某些些理理化化因因素素的的作作用用下下，核核酸酸双双链链分分子子碱碱基基对对的的氢氢键键断断裂裂，疏疏水水作作用用被被破破坏坏，双双股股螺螺旋旋或或发发夹夹结结构构打打开开，有有规规则则的结构被破坏，形成单链分子。的结构被破坏，形成单链分子。l变性的因素变性的因素：加热、酸、碱、尿素、甲酰胺等：加热、酸、碱、尿素、甲酰胺等增增色色效效应应（hyperchronic effect）：核核酸酸变变性性时时，紫紫外外吸吸收收值值A260随之升高的现象。随之升高的现象。热变性热变性 DNA的熔解曲线的熔解曲线Tm值值（m
50、elting temperature）:热变性时，热变性时，50%DNA分子变性的温分子变性的温度。又叫解链温度、熔解温度。度。又叫解链温度、熔解温度。复性（复性（renaturation）概概念念：在在适适当当条条件件下下，变变性性DNA的的两两条条互互补补单单链链重重新新缔缔合合，形成双链的过程。形成双链的过程。热热变变性性后后，缓缓慢慢降降低低温温度度至至比比Tm值值低低20-30时时，变变性的单链性的单链DNA可恢复其双链结构，称为可恢复其双链结构，称为退火退火。杂交（杂交（hybridization）来来源源不不同同的的两两条条单单链链核核酸酸分分子子通通过过碱碱基基互互补补可可形形