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1、人血清白蛋白的酵母重组表人血清白蛋白的酵母重组表达研究进展达研究进展2011.04.012011-04-011人血清白蛋白供需不平衡监管严格采血站数量下降血液传染病病毒泛滥不再审批新的生产企业进口受到严格限制需求量巨大2011年02月12日有文章称血液制品血液制品“告告荒荒”国内血液制品的严重短缺。这类产品，除了人血白蛋白，其他的血液制品如乙肝免疫球蛋白、静脉丙种球蛋白等都处于严重短缺的状态。来源网址：凤凰网财经频道http:/ pastoris 进行了高密度高表达发酵研究,表达水平已达到5克/升左右。2011-04-016来源网址：http:/ pastoris的基因组染色体上，表达质粒不会
2、因酵母传代而丢失，可稳定表达目的产物，且表达量高，用甲醇诱导时，表达率可占分泌总蛋白的80%以上。这非常有利于产物的提取。2011-04-0112酵母细胞表达系统中常用载体2011-04-0113不同酵母表达体系比较酿酒酵母毕赤酵母汉逊酵母2011-04-0114rHSA常用表达系统中的比较-12011-04-0115rHSA在不同表达系统中的比较-22011-04-0116目前除英国DETLA公司采用酿酒酵母作为宿主表达rHSA以外，其他公司和单位普遍采用毕赤酵母作为rHSA的表达宿主。2011-04-0117毕赤酵母表达重组人血清白蛋白表达系统构建信号序列选择很多异源蛋白分泌表达时已具有成
3、熟蛋白正确的N端氨基酸序列,且大部分分泌表达的异源蛋白是以它们自己同源信号序列引导的,分泌表达rHSA亦可以采用其自身的信号肽序列,即HSA引导肽序列。rHSA的分泌也可用酵母宿主菌本身的同源信号序列，如来自Pichiapastoris的PHO5引导序列和来自S.cerevisiae的-杂交因子(AMF)引导序列。基因剂量表达载体单元插入到宿主菌表达系统时，可采用质粒直接转化到宿主菌细胞中呈附加体型载体(Episomalvector)存在,也可通过线型特异位点整合到酵母菌的染色体上。当外源基因表达单元呈整合型(Integrativetype)存在于染色体上时,因随染色体的复制而复制,遗传极其稳
4、定。2011-04-0118毕赤酵母表达重组人血清白蛋白rHSA的发酵过程包括二个阶段,以甘油为碳源积累生物量的生长期和以甲醇为碳源的rHSA诱导表达期。甲醇的流加速率控制在培养基中的浓度小于1%,一般诱导表达150300h左右。整个过程的pH控制在610左右,溶氧控制在10%以上。在两段法的发酵条件优化方面,发现将甘油和甲醇混合流加可提高rHSA产量,也就是诱导开始时首先流加甲醇,在确保醇氧化酶被诱导后,开始混合流加。混合流加时严格控制甘油和甲醇的度比例和流加速率,使发酵液中甘油不积累,同时甲醇浓度不超过0.5%。2011-04-0119影响酵母表达外源蛋白的因素外源基因特性外源基因特性主要
5、涉及外源基因mRNA5端非翻译区、A+T组成和密码子的使用频率外源基因拷贝数和稳定性外源基因拷贝数和稳定性酿酒酵母和一些其他的酵母有多拷贝的内源质粒是建成高拷贝表达载体基础。克隆位点影响外源基因表达的高效稳定。一般情况下,毕赤甲醇酵母中外源基因整合的拷贝数愈高,则蛋白表达量愈大。2011-04-0120影响酵母表达外源蛋白的因素表达条件的优化表达条件的优化表达条件的优化主要包括通气量、培养基、摇菌密度、蛋白酶、诱导剂的含量等。充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达是极其重要的。有报道认为,如果用发酵罐进行培养,外源蛋白的表达水平要比普通摇瓶发酵高出10100倍。通过调整培养基的pH值,在培养基
6、中添加1%酪氨酸蛋白水解物等措施来抑制蛋白酶活性,使降解程度减至最低。此外选用蛋白酶缺陷的受体菌是减弱蛋白酶作用的有效方法诱导期间培养基中定期补充诱导剂,对于诱导表达外源蛋白十分重要。如对于毕赤甲醇酵母诱导期间培养基中每天应补加甲醇,以弥补甲醇的消耗和蒸发。诱导时间也是影响外源蛋白表达量的重要因素,诱导时间过短表达量低,诱导时间过长则外源蛋白降解增加2011-04-0121提高表达的一些策略启动子：最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PGAG,在它的控制下-LabZ基因表达率比甲醇诱导下PAOX1驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺更简单,同时
7、其产量更高,所以成为代替PAOX1最有潜力的启动子。整合位点：酵母核糖体RNA的基因rDNA在染色体中具有100200个重复,是提高外源基因拷贝数的最佳整合位点之一。宿主菌选择：根据利用甲醇的能力不同,巴斯德毕赤酵母菌分为Mut+、Muts和Mut-3种表型。蛋白酶缺失的宿主菌可减少表达蛋白的酶解消化,有利于外源蛋白的稳定。信号肽修饰：信号肽结构的改变(如突变、修饰、融合等)可能会提高分泌效率。有研究发现，改造了的信号肽大大提高了外源蛋白表达量。2011-04-0122降解控制改造P.pastoris表达宿主菌株,缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因,使目的基因稳定。在培养液中补加一些富含氨基酸的
8、组分和酪蛋白水解物、胃蛋白水解物,或在培养基中加入YP(酵母提取物+蛋白胨),提供给酵母细胞蛋白酶过量的底物,以减少目的蛋白的降解加入蛋白酶抑制剂毕赤酵母在非缓冲培养基中生长表达,将pH降到3或更低,使得许多中性pH蛋白酶失活共表达蛋白酶抑制物来抑制蛋白酶活性,减少目的蛋白降解将目的蛋白连上一个过氧化物酶体靶向信号使其被分拣转运入过氧化物酶体贮存起来,免受蛋白酶降解,还可减少对宿主细胞的毒害作用2011-04-0123重组人血清白蛋白在汉逊酵母中的表达与纯化汉逊酵母同巴斯德毕赤酵母一样均是甲基营养型酵母，有相似的特性二者启动子类型、外源基因整合方式、甲醇代谢途径关键酶基因的调控机制、筛选标记等
9、方面存在差异汉逊酵母重组菌遗传性质稳定、表达量和分泌效率高、适合于大规模发酵，是当前国际上公认的最为理想的外源基因表达系统之一国内大连汉信生物制药生产的汉逊酵母重组乙肝疫苗自2004年投放市场由于其更高的抗体水平、更高的阳转率、更高的母婴阻断率而备受市场青睐2011-04-0124重组人血清白蛋白在汉逊酵母中的表达与纯化2006年，大连汉信生物制药有限公司与大连理工大学合作开发研究年，大连汉信生物制药有限公司与大连理工大学合作开发研究试验方法：试验方法：优化HSA编码基因密码子选用毕赤酵母最偏爱或次偏爱的密码子对HAS基因密码序列进行优化构建rHSA表达质粒，转化感受态毕赤酵母细胞筛选重组表达
10、株液培，诱导表达，表达产物经SDS-PAGE、Westernblotting分析得到相对高表达的菌株2011-04-0125重组人血清白蛋白在汉逊酵母中的表达与纯化发酵分离纯化StreamlineSP离子交换层析、PhenylSepharoseHP疏水层析、DEAESepharoseCL-6B阴离子交换层析抗原性分析ELISA、免疫双扩散测定2011-04-0126实验结果证实rHSA在汉逊酵母中可得到高效表达，在摇瓶培养条件下表达量可占外泌蛋白的80%以上。重组菌经高密度发酵，其表达量可达到1.033g/L，由发酵时间与rHSA浓度关系曲线分析：影响产量和产率的主要因素为蛋白酶的降解作用，降
11、低蛋白酶的降解作用进行发酵条件优化后rHSA表达量会有大幅度提升，可以进行工艺放大研究。分离纯化手段有待提高2011-04-0127人血清白蛋白融合技术研制长效蛋白药物蛋白融合技术，是通过基因重组手段将蛋白质药物基因与特定的载体蛋白基因融合，由同一调控元件控制基因表达产物，目前使用最多的蛋白载体是和抗体片段。干扰素是一类重要的家族性细胞因子，具有抵抗病毒感染，抑制肿瘤生长和调节机体免疫功能的作用。但是干扰素分子量大约19kDa，易被肾小球滤过，血浆半衰期短而治疗周期长，需要频繁注射给药，患者依从性较低。中国药科大学田硕、姚文兵等报道利用白蛋白融合技术构建了能够分泌表达与高活性新型干扰素（）的融
12、合蛋白的巴斯德毕赤酵母工程菌株，获得了高纯度的长效新型干扰素分子。新型集成干扰素-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化2010-中国生物工程杂志2011-04-0128新型集成干扰素-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化基本步骤：全基因合成质粒：pBluscript KS（+）-NFIN-HSA合成质粒与毕赤酵母表达载体体pPIC3.5构建重组质粒重组质粒电击转化毕赤酵母、阳性克隆筛选重组毕赤酵母的PCR鉴定重组子的诱导表达HSA-NIFN的纯化Western blot 鉴定重组蛋白质谱和氨基酸序列分析融合蛋白体 HAS-NIFN 外抗病毒活性测定2011-04-012
13、9“新型集成干扰素-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化”应用的一部分策略根据已报道的基因序列及巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因的偏爱密码子，设计了编码HSA-NIFN的全新基因。HSA融合会显著降低IFN的体外生物学活性。将其165位精氨酸突变为丝氨酸，以消除毕赤酵母体内水解酶KEX-的作用位点；同时选用常见的G4S连接肽保证HSA和IFN之间的灵活性。选用HSA天然信号肽来介导HSA-NIFN分泌表达以避免可能出现的序列不均一的问题。2011-04-0130结构分析对于疫苗等微量输人的重组蛋白来说，99.999%的纯度已经足够，但相对于rHSA该纯度依然很低，因为白蛋白每次注射量至少
14、10g，这意味着至少有0.Img的杂质同时输人人体，若其为有害杂质，将可能产生生命危险。目前rHSA纯化研究已取得很多突破性进展，已有纯度高达99.999999%的研究报道，同时纯化得到的高纯度rHSA与pHSA在分子结构上完全相同，且SDS-PAGE分析、HPLC分析及配基结合能力均相同。2011-04-0131重组人血清白蛋白临床研究英国的DELT公司用酿酒酵母生产的rHSA完成了一期临床试验。日本三菱公司用毕赤酵母生产的rHSA已经完成了三期临床试验。2011-04-0132rHSA的应用展望替代人血源HSA产品。由于HSA是一种多功能蛋白，因其具有无酶活性且无免疫原性等特点，rHSA可作为赋形剂和稳定剂及无血清细胞培养基的组分。此外由于具有抗氧化性，rHSA也被用作药物载体从而赋予药物更好的理化特性(肽类和蛋白质类药物在体内很难渗透进入血脑屏障,但通过嵌合肽可实现肽或蛋白质药物向脑的转运。)。rHSA的广泛应用将为人类血液和血液制品翻开新的篇幅。2011-04-0133THANKS2011-04-0134