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1、关于蛋白质合成分离第一页，讲稿共一百二十八页哦l意义意义l解析蛋白质结构与功能的关系，为应用及人工合成解析蛋白质结构与功能的关系，为应用及人工合成蛋白质提供全面信息；蛋白质提供全面信息；l许多肽具有独特的生物学活性，是目前合成的主许多肽具有独特的生物学活性，是目前合成的主要物质；要物质；第二页，讲稿共一百二十八页哦第一节第一节 肽合成肽合成合成肽的方法有三类合成肽的方法有三类第一类是由不同氨基酸按照一定顺序的控制合成；第一类是由不同氨基酸按照一定顺序的控制合成；第二类是由氨基酸自由共聚；第二类是由氨基酸自由共聚；第三类由酶催化在非水介质中合成。第三类由酶催化在非水介质中合成。第三页，讲稿共一百
2、二十八页哦 第一类是目前合成肽的主要方法，该方法在合成前第一类是目前合成肽的主要方法，该方法在合成前必须先将不参与形成肽键的活泼基团保护起来。必须先将不参与形成肽键的活泼基团保护起来。例如，羧基可用活性酯法（酰氯），氨基可以采例如，羧基可用活性酯法（酰氯），氨基可以采用碳二亚胺法形成卞氧甲酰胺，合成后再将保护用碳二亚胺法形成卞氧甲酰胺，合成后再将保护基水解下来。最后分离产物。基水解下来。最后分离产物。第四页，讲稿共一百二十八页哦第五页，讲稿共一百二十八页哦第六页，讲稿共一百二十八页哦第七页，讲稿共一百二十八页哦l8080年代，开发出固相合成技术。年代，开发出固相合成技术。l合成肽链时，在聚苯乙
3、烯树脂小珠固相上进行。合成肽链时，在聚苯乙烯树脂小珠固相上进行。l待合成的第一个氨基酸的羧基先和氯甲基聚苯乙烯树脂反待合成的第一个氨基酸的羧基先和氯甲基聚苯乙烯树脂反应，共价地挂接在树脂上。应，共价地挂接在树脂上。l除去该氨基酸的除去该氨基酸的N-N-末端保护基末端保护基;第二个氨基酸（氨基第二个氨基酸（氨基被保护）以碳二亚胺为缩合剂，接到第一个氨基酸的氨基上；被保护）以碳二亚胺为缩合剂，接到第一个氨基酸的氨基上；除去除去第二个氨基酸的氨基保护基；第二个氨基酸的氨基保护基；l重复上述步骤，使肽链按控制顺序从重复上述步骤，使肽链按控制顺序从C C端向端向N N端延长。端延长。合成一个十肽，花费合
4、成一个十肽，花费2727小时，产率小时，产率85%85%。第八页，讲稿共一百二十八页哦l肽链合成到最后一步时，把树脂悬浮在无水三氟肽链合成到最后一步时，把树脂悬浮在无水三氟 乙酸乙酸中，通入干燥的中，通入干燥的HBrHBr，使肽与树脂脱离，同时也切除保，使肽与树脂脱离，同时也切除保护基团。护基团。l现在多肽合成仪上进行，反应杯中的试剂按程序泵入和除现在多肽合成仪上进行，反应杯中的试剂按程序泵入和除去。去。第九页，讲稿共一百二十八页哦第十页，讲稿共一百二十八页哦第十一页，讲稿共一百二十八页哦l第二类实际上在讲氨基酸成肽反应时已经讲过，从理第二类实际上在讲氨基酸成肽反应时已经讲过，从理论上讲，该反
5、应在工业上可以用来制备聚氨基酸，但论上讲，该反应在工业上可以用来制备聚氨基酸，但是该反应没有选择性。是该反应没有选择性。l第三类是用酶合成，在水环境下，合成肽需要消耗第三类是用酶合成，在水环境下，合成肽需要消耗能量（能量（ATP）；在非水条件下，蛋白酶等水解酶可转）；在非水条件下，蛋白酶等水解酶可转变成合成酶，将氨基酸合成肽。而且不需要消耗变成合成酶，将氨基酸合成肽。而且不需要消耗ATP。该法优点是条件温和，步骤少，缺点是氨基。该法优点是条件温和，步骤少，缺点是氨基酸或肽的溶剂体系选择以及合成物的卸载。酸或肽的溶剂体系选择以及合成物的卸载。第十二页，讲稿共一百二十八页哦近近2525年来，生物催
6、化剂在非水介质中催化反应以及应用年来，生物催化剂在非水介质中催化反应以及应用的研究论文呈现爆炸性增长。的研究论文呈现爆炸性增长。这里的生物催化剂主要指酶，非水介质包括微水有机溶这里的生物催化剂主要指酶，非水介质包括微水有机溶剂体系；反胶束体系；水剂体系；反胶束体系；水-水不互溶两相体系。水不互溶两相体系。在有机介质中，酶改变反应方向，例如水解酶变成合成在有机介质中，酶改变反应方向，例如水解酶变成合成酶；刚性增加，对底物的专一性大大提高；热稳定性显酶；刚性增加，对底物的专一性大大提高；热稳定性显著提高；可重复使用；避免微生物污染；可对水敏感的著提高；可重复使用；避免微生物污染；可对水敏感的底物进
7、行催化。底物进行催化。非水介质中生物催化简介非水介质中生物催化简介第十三页，讲稿共一百二十八页哦酶催化的反应酶催化的反应氧化还原酶氧化还原酶转移酶转移酶第十四页，讲稿共一百二十八页哦l水解酶水解酶裂合酶裂合酶异构酶异构酶合成酶合成酶第十五页，讲稿共一百二十八页哦酶分子在非水介质中主要以下列形式存在，即：酶分子在非水介质中主要以下列形式存在，即：固态固态-冻干粉或固定化酶或结晶酶；冻干粉或固定化酶或结晶酶；可溶解酶可溶解酶-水溶性大分子修饰酶；非共价修饰的高分子水溶性大分子修饰酶；非共价修饰的高分子-酶复酶复合物、表面活性剂合物、表面活性剂-酶复合物、乳液酶等；酶复合物、乳液酶等；在非水介质中酶
8、能保持整体结构的完整性；在非水介质中酶能保持整体结构的完整性；其活性部位的结构与在水溶液中相同；其活性部位的结构与在水溶液中相同；非水介质中酶的状态非水介质中酶的状态第十六页，讲稿共一百二十八页哦非水介质中的酶学性质非水介质中的酶学性质l非水介质中，酶分子内的氢键起主要作用，导非水介质中，酶分子内的氢键起主要作用，导致其致其刚性增加刚性增加，维持其活性中心的构象与，维持其活性中心的构象与在水介质中的一致。在水介质中的一致。第十七页，讲稿共一百二十八页哦在非水介质中，酶与介质间的疏水相互作用平衡改变，在非水介质中，酶与介质间的疏水相互作用平衡改变，导致酶的专一性、催化性质等受到影响导致酶的专一性
9、、催化性质等受到影响酶的稳定性提高，例如脂肪酶酶的稳定性提高，例如脂肪酶酶的特异性不变，但是对底物的催化效率会发生变化，即催酶的特异性不变，但是对底物的催化效率会发生变化，即催化效率增加了分配系数项化效率增加了分配系数项第十八页，讲稿共一百二十八页哦微量水的影响微量水的影响l是影响非水介质中酶活力及选择性的控制步骤是影响非水介质中酶活力及选择性的控制步骤l水的作用：调控酶构象水的作用：调控酶构象l微量水对酶发挥有效催化是必需的，水分子直接微量水对酶发挥有效催化是必需的，水分子直接或间接参与酶稳定构象的各种非共价作用，弱化或间接参与酶稳定构象的各种非共价作用，弱化荷电基团或极性基团间的相互作用，
10、增加酶柔性荷电基团或极性基团间的相互作用，增加酶柔性及选择性及选择性第十九页，讲稿共一百二十八页哦非水介质中酶结合水的位点及结合量非水介质中酶结合水的位点及结合量l离子化基团水化：与酶分子表面的荷电基团结合；结合量离子化基团水化：与酶分子表面的荷电基团结合；结合量0-0-0.07g/g0.07g/g酶酶l极性水族生长：与酶分子表面极性基团结合；结合量极性水族生长：与酶分子表面极性基团结合；结合量0.07-0.07-0.25g/g0.25g/g酶酶l弱吸附：与酶表面弱极性区域结合；结合量弱吸附：与酶表面弱极性区域结合；结合量0.25-0.38g/g0.25-0.38g/g酶酶l完全水化：酶蛋白表
11、面完全水化；结合量完全水化：酶蛋白表面完全水化；结合量0.38g/g0.38g/g酶酶第二十页，讲稿共一百二十八页哦第二十一页，讲稿共一百二十八页哦非水介质中酶催化反应类型及应用非水介质中酶催化反应类型及应用l酶催化反应的类型酶催化反应的类型lC-OC-O键的形成，包括酯合成、环氧化、糖苷合成、加氧氧化键的形成，包括酯合成、环氧化、糖苷合成、加氧氧化lC-NC-N键的反应，包括肽的合成键的反应，包括肽的合成lC-CC-C键的形成，包括羟醛、酮醛和羟醛转移、醛缩合、醛加成等键的形成，包括羟醛、酮醛和羟醛转移、醛缩合、醛加成等l还原反应还原反应l氧化反应，包括氧化反应，包括C-HC-H、C=CC=
12、C氧化，醇氧化，酚氧化，羧酸氧化，氧化，醇氧化，酚氧化，羧酸氧化，C-NC-N氧化，氧化，异构化反应异构化反应l形成形成C-XC-X的反应的反应 （卤化反应）（卤化反应）l包括烯烃、炔烃、芳香族及含有活泼的包括烯烃、炔烃、芳香族及含有活泼的C-HC-H键的化合物的卤化。键的化合物的卤化。第二十二页，讲稿共一百二十八页哦酶非水催化反应的应用酶非水催化反应的应用l制备光学活性化合物制备光学活性化合物 l合成旋光性高分子合成旋光性高分子 l糖和类固醇的选择性催化糖和类固醇的选择性催化 l功能性高分子合成功能性高分子合成 l可生物降解高分子的酶促合成可生物降解高分子的酶促合成 第二十三页，讲稿共一百二
13、十八页哦合成肌肽及其类似物合成肌肽及其类似物l存在于动物肌肉中的肌肽是由存在于动物肌肉中的肌肽是由-丙氨酸与丙氨酸与L-L-组氨酸组成组氨酸组成的二肽，具有抗氧化、清除自由基，的二肽，具有抗氧化、清除自由基，pHpH缓冲等生理功能。缓冲等生理功能。其最显著的性质是抗氧化，主要表现为捕获活性氧和其最显著的性质是抗氧化，主要表现为捕获活性氧和自由基，螯合金属离子，结合脂肪酸氧化产物自由基，螯合金属离子，结合脂肪酸氧化产物-醛，是醛，是迄今发现的最有效天然抗氧化、抗衰老二肽。迄今发现的最有效天然抗氧化、抗衰老二肽。第二十四页，讲稿共一百二十八页哦肌肽及其类似物的结构式肌肽及其类似物的结构式第二十五页
14、，讲稿共一百二十八页哦正丁醇中合成肌肽正丁醇中合成肌肽4040、pH6.5pH6.5，转化率，转化率84.26%84.26%第二十六页，讲稿共一百二十八页哦四氢呋喃中合成肌肽类似物四氢呋喃中合成肌肽类似物50505050、pH8.5pH8.5pH8.5pH8.5，转化率，转化率，转化率，转化率 76.35%76.35%76.35%76.35%第二十七页，讲稿共一百二十八页哦第二十八页，讲稿共一百二十八页哦合成硬脂酰三乙醇铵单酯合成硬脂酰三乙醇铵单酯l硬脂酰三乙醇胺盐酸盐是一种季铵化合物，在日化硬脂酰三乙醇胺盐酸盐是一种季铵化合物，在日化行业主要用于洗发香波中，中和头发蛋白质的负电行业主要用于洗
15、发香波中，中和头发蛋白质的负电荷及抗菌。荷及抗菌。l该分子在头发上的附着力强，产生该分子在头发上的附着力强，产生飘逸飘逸效果，但无效果，但无光亮。光亮。l该物质目前采用酸催化剂在该物质目前采用酸催化剂在140140左右脱水合成左右脱水合成第二十九页，讲稿共一百二十八页哦用脂肪酶在正己烷中合成，合成温度用脂肪酶在正己烷中合成，合成温度用脂肪酶在正己烷中合成，合成温度用脂肪酶在正己烷中合成，合成温度55555555，转化率，转化率，转化率，转化率72.75%72.75%72.75%72.75%，酶可以反复使用多次。，酶可以反复使用多次。，酶可以反复使用多次。，酶可以反复使用多次。第三十页，讲稿共一
16、百二十八页哦合成羟基脯氨酸双酯l羟基脯氨酸（羟基脯氨酸（L-Hyp L-Hyp），修饰氨基酸，抗自由基、抗衰），修饰氨基酸，抗自由基、抗衰老，日化行业在功能性皮肤化妆品中使用。老，日化行业在功能性皮肤化妆品中使用。l脂脂/水平衡系数低，不能透过皮肤细胞膜。水平衡系数低，不能透过皮肤细胞膜。l目前采用两步法化学合成。单酯合成温度达目前采用两步法化学合成。单酯合成温度达120120，苯，苯系物为带水剂，双酯的合成方法未见公开报道。由系物为带水剂，双酯的合成方法未见公开报道。由于其吡咯环的干扰，预计合成温度将超过于其吡咯环的干扰，预计合成温度将超过160 160，伴，伴随单酯键部分水解。随单酯键部分
17、水解。第三十一页，讲稿共一百二十八页哦合成羟基脯氨酸双酯合成羟基脯氨酸双酯无溶剂、脂肪酶、无溶剂、脂肪酶、6060、6-8h6-8h，转化率超过，转化率超过93%93%93%93%第三十二页，讲稿共一百二十八页哦酯交换合成单酯酯交换合成单酯第三十三页，讲稿共一百二十八页哦单酯酯化合成双酯单酯酯化合成双酯第三十四页，讲稿共一百二十八页哦第二节第二节 蛋白质分子量测定蛋白质分子量测定最小分子量最小分子量最小分子量最小分子量l如血红蛋白含如血红蛋白含0.335%0.335%铁，其最低分子量铁，其最低分子量=16700=16700l渗透压法渗透压法l=RT=RT（c/M+Kcc/M+Kc2 2）,l
18、M=RT/lim M=RT/lim(c 0)(c 0)/C/C第三十五页，讲稿共一百二十八页哦第三十六页，讲稿共一百二十八页哦l凝胶过滤凝胶过滤lV Ve e/V/Vo o=a-blog M=a-blog M l式中，式中，V Ve e为洗脱液体积，为洗脱液体积，V Vo o为外水体积，为外水体积，M M为相对分子质量，为相对分子质量，a a，b b为常为常数。数。l移项得：移项得：log Mlog M=a/b-1/b=a/b-1/b（V Ve e/V/Vo o）l基于蛋白质主要呈球状，假设分子量相同，其分子体积及直径相同。基于蛋白质主要呈球状，假设分子量相同，其分子体积及直径相同。先测几种标
19、准蛋白质的先测几种标准蛋白质的V Ve e，以其相对分子质量的对数（，以其相对分子质量的对数（log Mlog M）对）对V Ve e作图，作图，得一条直线。得一条直线。l再测样品的再测样品的V Ve e，即可从图中查出其相对分子量，即可从图中查出其相对分子量。第三十七页，讲稿共一百二十八页哦第三十八页，讲稿共一百二十八页哦第三十九页，讲稿共一百二十八页哦lSDSSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳这是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。基于被分离物质的分这是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。基于被分离物质的分子大小和电荷。子大小和电荷。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和聚丙烯酰胺凝
20、胶是由丙烯酰胺和N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。分子。第四十页，讲稿共一百二十八页哦聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的高聚物，聚合前调节单体浓度比，聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的高聚物，聚合前调节单体浓度比，使之既有适宜的空隙度，又有较好的机械性质。使之既有适宜的空隙度，又有较好的机械性质。第四十一页，讲稿共一百二十八页哦丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在水溶液中通过丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在水溶液中通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。自由基引发的聚合反应形成凝胶。聚合反应的催化剂包括引发剂和加速剂。引发剂使丙烯酰聚合反应的催化剂包括引发剂和加速剂。引发
21、剂使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应，加速剂则加快引发剂释放胺成为自由基，发动聚合反应，加速剂则加快引发剂释放自由基的速度。自由基的速度。聚丙烯酰胺热稳定，无色透明，可肉眼观察或用检测仪测聚丙烯酰胺热稳定，无色透明，可肉眼观察或用检测仪测定。定。第四十二页，讲稿共一百二十八页哦常用的引发剂和加速剂的配伍如下表：常用的引发剂和加速剂的配伍如下表：引引 发发 剂剂 加加 速速 剂剂（NHNH4 4)2 2S S2 2O O8 8 TEMED TEMED N N，N N，N N，N;N;四甲基乙二胺四甲基乙二胺(NH(NH4 4)2 2S S2 2O O8 8DMAPNDMAPN二甲基胺基丙晴二甲基
22、胺基丙晴核核 黄黄 素素 TEMEDTEMED第四十三页，讲稿共一百二十八页哦用过硫酸铵引发的反应为用过硫酸铵引发的反应为化学化学聚合反应；聚合反应；用核黄素引发，需要强光照射反应液，为用核黄素引发，需要强光照射反应液，为光光聚合反应。聚合反应。聚丙烯酰胺聚合反应受下列因素影响：聚丙烯酰胺聚合反应受下列因素影响：1 1、大气中、大气中氧氧能淬灭自由基，使聚合反应终止（空气隔绝）。能淬灭自由基，使聚合反应终止（空气隔绝）。2 2、某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应（选择容器材质）、某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应（选择容器材质）。3 3、某些试剂可以减慢反应速度，如赤血盐（电位）。、某些试剂可
23、以减慢反应速度，如赤血盐（电位）。4 4、温度高聚合快，温度低聚合慢（控温）。、温度高聚合快，温度低聚合慢（控温）。第四十四页，讲稿共一百二十八页哦每每100mL100mL凝胶溶液中含有单体和交联剂的凝胶溶液中含有单体和交联剂的总质量数（总质量数（g g）称）称凝胶浓度，常用凝胶浓度，常用T%T%表达表达；凝胶中交联剂占单体或交联体质；凝胶中交联剂占单体或交联体质量的百分数称为量的百分数称为交联度交联度，常用，常用C%C%表示。表示。此外，聚丙烯酰胺凝胶还有分子筛效应。此外，聚丙烯酰胺凝胶还有分子筛效应。电泳迁移率与肽链分子量的对数有如下关系：电泳迁移率与肽链分子量的对数有如下关系：log M
24、=a-blog M=a-bR R 或或 log M=Klog M=K1 1-K-K2 2R R式中式中R R为为相对迁移率相对迁移率=样品迁移距离样品迁移距离/前沿（染料）迁移前沿（染料）迁移距离，其余为常数。距离，其余为常数。第四十五页，讲稿共一百二十八页哦l测定时，以几种标准物蛋白质的测定时，以几种标准物蛋白质的M M的对数值对其的对数值对其R R值作值作图，根据待测样品的图，根据待测样品的R R，从标准曲线上查出它的从标准曲线上查出它的M M。含丙烯酰胺含丙烯酰胺7-7.5%7-7.5%的凝胶，适用于分离的凝胶，适用于分离1 1万至万至100100万物质，万物质，1 1万以下的则采用万以
25、下的则采用15-30%15-30%的凝胶，分子量特别大的采用含的凝胶，分子量特别大的采用含4%4%的凝胶。的凝胶。第四十六页，讲稿共一百二十八页哦SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDSSDS）是一种有效的蛋白质变性剂，它能）是一种有效的蛋白质变性剂，它能破坏蛋白质的氢键和疏水作用。破坏蛋白质的氢键和疏水作用。SDSSDS与蛋白质结合使变性蛋白质带负电荷，覆盖于多与蛋白质结合使变性蛋白质带负电荷，覆盖于多肽链上，数量远远超过蛋白质所带电荷。肽链上，数量远远超过蛋白质所带电荷。第四十七页，讲稿共一百二十八页哦第四十八页，讲稿共一百二十八页哦SDS
26、SDS改变了蛋白质单体分子的构象改变了蛋白质单体分子的构象SDSSDS蛋白质复合物呈近似雪茄的长椭圆棒，不同蛋白质蛋白质复合物呈近似雪茄的长椭圆棒，不同蛋白质的的SDSSDS复合体直径（短轴）都是一样的，约为复合体直径（短轴）都是一样的，约为1.8nm1.8nm，而，而长轴长度却随蛋白质的相对分子质量成正比例变化。因此，长轴长度却随蛋白质的相对分子质量成正比例变化。因此，电泳时蛋白质迁移率仅与其分子量相关。电泳时蛋白质迁移率仅与其分子量相关。第四十九页，讲稿共一百二十八页哦l因此，在电泳时以同样的电荷因此，在电泳时以同样的电荷/蛋白质比蛋白质比(荷质比）荷质比）向正极方向移动；消除了蛋白质原有
27、的电荷、分向正极方向移动；消除了蛋白质原有的电荷、分子形状等因素的影响。子形状等因素的影响。第五十页，讲稿共一百二十八页哦第五十一页，讲稿共一百二十八页哦第五十二页，讲稿共一百二十八页哦第五十三页，讲稿共一百二十八页哦第五十四页，讲稿共一百二十八页哦l常用的电泳方法常用的电泳方法l除了凝胶电泳以外，还有区带电泳：支持介质为薄膜、纸等；除了凝胶电泳以外，还有区带电泳：支持介质为薄膜、纸等；l等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（IEFIEF）：以两性电解质为电泳介质，将其制）：以两性电解质为电泳介质，将其制备成备成pHpH梯度，分离蛋白质等带电离子的方法。梯度，分离蛋白质等带电离子的方法。l两性电解质是由
28、多种氨基与羧基比例不同的两性电解质是由多种氨基与羧基比例不同的多氨基多羧酸多氨基多羧酸的混合物的混合物构成，例如丙稀酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、亚甲构成，例如丙稀酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、亚甲基丁二酸等；常用的脂肪胺有乙二胺、二乙烯三胺、乙醇胺等。基丁二酸等；常用的脂肪胺有乙二胺、二乙烯三胺、乙醇胺等。将上述的酸与胺进行加成反应获得。将上述的酸与胺进行加成反应获得。第五十五页，讲稿共一百二十八页哦l当被分离的蛋白质到达其等电点区间时，以兼性离子当被分离的蛋白质到达其等电点区间时，以兼性离子存在，静电荷为零，既不向正极、也不向负极泳动；存在，静电荷为零，既不向正极、也不向负极泳动；l等电聚焦电
29、泳分辨率高、可大规模使用，用于分析等电聚焦电泳分辨率高、可大规模使用，用于分析和工业制备。和工业制备。l现在已经有规模化生产的两性电解质销售。现在已经有规模化生产的两性电解质销售。第五十六页，讲稿共一百二十八页哦第三节第三节 蛋白质的盐溶与盐析蛋白质的盐溶与盐析l盐溶：盐溶：中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响，中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响，在低浓度时，可以增加蛋白质的溶解度，称盐溶。在低浓度时，可以增加蛋白质的溶解度，称盐溶。l盐溶是蛋白质吸附盐离子后，带电层使蛋白质分子彼盐溶是蛋白质吸附盐离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水之间的作用加强，溶解度增高。此排斥，而蛋白质与
30、水之间的作用加强，溶解度增高。第五十七页，讲稿共一百二十八页哦第五十八页，讲稿共一百二十八页哦l盐析：盐析：指蛋白质在高浓度中性盐存在时从溶液中指蛋白质在高浓度中性盐存在时从溶液中l沉淀析出的现象沉淀析出的现象 盐析时，同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响，要盐析时，同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响，要比单价大。比单价大。中性盐影响蛋白质溶解度的能力是其离子强度的函数。离子强中性盐影响蛋白质溶解度的能力是其离子强度的函数。离子强度定义为：度定义为：I=1/2CI=1/2Ci iZ Zi i2 2 C Ci i为离子的浓度，为离子的浓度，ZiZi为离子的净电荷为离子的净电荷第五十九页，讲稿共
31、一百二十八页哦l计算溶液的离子强度，可将各种离子的浓度分计算溶液的离子强度，可将各种离子的浓度分别乘以各种离子所带的净电荷的平方，然后将别乘以各种离子所带的净电荷的平方，然后将所有乘积相加并除以所有乘积相加并除以2 2。例如，。例如，2mol/L2mol/L硫酸铵溶硫酸铵溶液的离子强度为：液的离子强度为：l（4141）+（2222）/2=6/2=6第六十页，讲稿共一百二十八页哦l在盐析时，要加入的硫酸铵可用下式表示：在盐析时，要加入的硫酸铵可用下式表示：l00，硫酸铵，硫酸铵浓度浓度由饱和度由饱和度S S1 1增至增至S S2 2，应向，应向1 1升溶液中添加的升溶液中添加的固体硫固体硫酸铵克
32、数酸铵克数：lW=505W=505（S S2 2-S-S1 1）/（1-0.285S1-0.285S2 2）lS S1 1和和S S2 2分别表示起始和终了饱和度分别表示起始和终了饱和度.饱和度是在给定条件下某中性饱和度是在给定条件下某中性盐达到的最大百分浓度；盐达到的最大百分浓度；l505505是是00时时1000mL1000mL饱和硫酸铵饱和硫酸铵(100%(100%或或1.001.00饱和度饱和度)溶液中所含的溶液中所含的硫酸铵克数硫酸铵克数(505g/1000(505g/1000毫升溶液毫升溶液););l将将100mL100mL硫酸铵溶液硫酸铵溶液,由饱和度由饱和度S S1 1 变为变
33、为S S2 2,应向其中加入饱和硫酸应向其中加入饱和硫酸铵的毫升数铵的毫升数V:V:lV=100(SV=100(S2 2-S-S1 1)/(1-S)/(1-S2 2)第六十一页，讲稿共一百二十八页哦第四节第四节 蛋白质的性质蛋白质的性质l一、蛋白质的可解离基团一、蛋白质的可解离基团l蛋白质分子中可解离基团的蛋白质分子中可解离基团的pKpKa a值值第六十二页，讲稿共一百二十八页哦二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质l蛋白质分子达到胶体质点的范围，具有胶体所有的性质，特别是蛋白质分子达到胶体质点的范围，具有胶体所有的性质，特别是不能通过半透膜。不能通过半透膜。l半透膜：能让水和小分子物质自由
34、通过的膜。半透膜：能让水和小分子物质自由通过的膜。l蛋白质分子表面分布大量亲水侧链，水溶液中蛋白质分子表面形蛋白质分子表面分布大量亲水侧链，水溶液中蛋白质分子表面形成一层水膜，吸水量为成一层水膜，吸水量为0.30.30.50.5克克/克蛋白。克蛋白。l许多可解离的基团，与周围相反电荷的离子形成盐键许多可解离的基团，与周围相反电荷的离子形成盐键,即双电即双电层。层。第六十三页，讲稿共一百二十八页哦第六十四页，讲稿共一百二十八页哦三、蛋白质的两性性质和等电点三、蛋白质的两性性质和等电点l蛋白质分子中的可解离侧链基团，有的与酸作用，有的蛋白质分子中的可解离侧链基团，有的与酸作用，有的与碱作用，是两性
35、电解质。与碱作用，是两性电解质。l等电点：某一等电点：某一pHpH值时，蛋白质所带正电荷和负电荷相等，值时，蛋白质所带正电荷和负电荷相等，即净电荷为零，此时溶液即净电荷为零，此时溶液pHpH值称该蛋白质的等电点。值称该蛋白质的等电点。第六十五页，讲稿共一百二十八页哦第六十六页，讲稿共一百二十八页哦l等电点时蛋白质分子中可解离侧链基团的净电荷为零，双电等电点时蛋白质分子中可解离侧链基团的净电荷为零，双电层几乎消失，溶解度最小。层几乎消失，溶解度最小。l等离子点：等电点与介质的离子组成、等离子点：等电点与介质的离子组成、pHpH变化有关，故测变化有关，故测定等电点要在定等电点要在确定的确定的pHp
36、H、离子强度的缓冲液、离子强度的缓冲液中进行。中进行。纯水中纯水中测测得的等电点称等离子点。得的等电点称等离子点。第六十七页，讲稿共一百二十八页哦几种蛋白质的等电点几种蛋白质的等电点 第六十八页，讲稿共一百二十八页哦蛋白质酸性氨基酸和碱性氨基酸含量蛋白质酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系与等电点的关系第六十九页，讲稿共一百二十八页哦四、蛋白质变性和复性四、蛋白质变性和复性l变性作用：蛋白质受某些物理化学因素的影响，空间构象破变性作用：蛋白质受某些物理化学因素的影响，空间构象破坏导致的理化性质，生物学活性改变的现象。坏导致的理化性质，生物学活性改变的现象。l变性是蛋白质二级结构以上的高级结
37、构的破坏而导致生变性是蛋白质二级结构以上的高级结构的破坏而导致生物活性丧失的过程。物活性丧失的过程。l变性因素：强酸、强碱、剧烈搅拌、重金属盐、有机溶剂、脲、变性因素：强酸、强碱、剧烈搅拌、重金属盐、有机溶剂、脲、胍类、超声波、加热等。胍类、超声波、加热等。第七十页，讲稿共一百二十八页哦l变性结果：溶解度降低，不对称性增加，结晶能力丧失，易被变性结果：溶解度降低，不对称性增加，结晶能力丧失，易被蛋白酶水解。蛋白酶水解。l可逆变性：指除去变性因素后，变性蛋白质的空间结构恢复，可逆变性：指除去变性因素后，变性蛋白质的空间结构恢复，使生物学活性恢复。使生物学活性恢复。l不可逆变性：指除去变性因素后，
38、变性蛋白质的空间结构及不可逆变性：指除去变性因素后，变性蛋白质的空间结构及生物学活性不能恢复。生物学活性不能恢复。l复性：变性蛋白质恢复空间结构及生物学活性的过程。复性：变性蛋白质恢复空间结构及生物学活性的过程。第七十一页，讲稿共一百二十八页哦五、蛋白质的沉淀五、蛋白质的沉淀l水化层和双电层是蛋白质溶液稳定的两个主要因素，水化层和双电层是蛋白质溶液稳定的两个主要因素，破坏其中的一个或两个都可使蛋白质变性而沉淀析破坏其中的一个或两个都可使蛋白质变性而沉淀析出。出。l这种变性蛋白质从溶液中析出的现象称为蛋白质的这种变性蛋白质从溶液中析出的现象称为蛋白质的沉淀作用。沉淀作用。第七十二页，讲稿共一百二
39、十八页哦l1.1.可逆沉淀：可逆沉淀：l指除去沉淀剂后，使蛋白质恢复溶解状态。指除去沉淀剂后，使蛋白质恢复溶解状态。l盐析盐析；盐析作用破坏双电层并夺去蛋白质水分。；盐析作用破坏双电层并夺去蛋白质水分。l盐溶盐溶；形成双电层；形成双电层2.2.不可逆沉淀不可逆沉淀 重金属盐、有机溶剂、生物碱试剂等都能使蛋白质生成重金属盐、有机溶剂、生物碱试剂等都能使蛋白质生成不可逆沉淀，不能用透析等方法除去沉淀剂，使蛋白质重新不可逆沉淀，不能用透析等方法除去沉淀剂，使蛋白质重新溶解。溶解。第七十三页，讲稿共一百二十八页哦l.重金属盐重金属盐l在碱性条件下蛋白质带负电荷，可与在碱性条件下蛋白质带负电荷，可与Hg
40、Hg、PbPb等重金属离子等重金属离子结合，形成不溶性的盐沉淀。结合，形成不溶性的盐沉淀。NH2 NH2Pr +Hg2+Pr COO-COO-:Hg2+第七十四页，讲稿共一百二十八页哦.生物碱试剂生物碱试剂l生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。如单宁性物质。能沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等酸、苦味酸、三氯乙酸等 第七十五页，讲稿共一百二十八页哦.有机溶剂有机溶剂l乙醇、丙酮等可破坏蛋白质的水膜，降低溶液乙醇、丙酮等可破坏蛋白质的水膜，降低溶液的介电常数，使蛋白质分
41、子间的静电作用增加，的介电常数，使蛋白质分子间的静电作用增加，而聚集沉淀。而聚集沉淀。l介电常数：电荷被真空隔绝时的电势与被介质介电常数：电荷被真空隔绝时的电势与被介质隔绝时的电势之比值。隔绝时的电势之比值。第七十六页，讲稿共一百二十八页哦第七十七页，讲稿共一百二十八页哦六、蛋白质的沉降作用六、蛋白质的沉降作用l溶液中的蛋白质在离心力作用下会发生沉降运动，沉降速度与蛋白质分子的大小溶液中的蛋白质在离心力作用下会发生沉降运动，沉降速度与蛋白质分子的大小和密度有关，也与蛋白质分子的形状、溶剂的密度和粘度有关。和密度有关，也与蛋白质分子的形状、溶剂的密度和粘度有关。l在离心场中蛋白质分子受到的净离心
42、力（离心力在离心场中蛋白质分子受到的净离心力（离心力浮力）与摩擦阻力平衡时，单浮力）与摩擦阻力平衡时，单位离心场强度的沉降速度是定值，称为沉降系数（位离心场强度的沉降速度是定值，称为沉降系数（S S表示）。表示）。S=110S=110-13-13s s。l扩散系数：当浓度梯度等于扩散系数：当浓度梯度等于1 1单位时，在单位时，在1 s1 s内通过内通过1cm1cm2 2面积而扩散的溶质量。面积而扩散的溶质量。（g/cmg/cm2 2 s s）l以蛋白质的以蛋白质的S S及扩散系数，可按下式计算蛋白质的相对分子量及扩散系数，可按下式计算蛋白质的相对分子量第七十八页，讲稿共一百二十八页哦l M=R
43、TS/DM=RTS/D（1-1-）lRR气体常数，气体常数，R=8.314J/mol KR=8.314J/mol KlTT绝对温度，绝对温度，K KlSS沉降系数，沉降系数，S SlDD扩散系数扩散系数l蛋白质的微分比体积（当加入蛋白质的微分比体积（当加入1 1克干物质于无克干物质于无限大体积的溶剂中，溶液体积的增量）限大体积的溶剂中，溶液体积的增量）l溶剂的密度，溶剂的密度，g/cmg/cm3 3第七十九页，讲稿共一百二十八页哦七、蛋白质颜色反应七、蛋白质颜色反应第八十页，讲稿共一百二十八页哦第第五五节节 蛋白质分离纯化和测定蛋白质分离纯化和测定l一、蛋白质分离纯化的一般原则一、蛋白质分离纯
44、化的一般原则l大多数蛋白质在细胞中都和核酸等生物大分子结合在一起；大多数蛋白质在细胞中都和核酸等生物大分子结合在一起；l许多蛋白质在性质、结构上有许多相似，目前，还许多蛋白质在性质、结构上有许多相似，目前，还没有一种方法能适应多种蛋白质的提取、分离和纯没有一种方法能适应多种蛋白质的提取、分离和纯化。化。l蛋白质分离纯化的基本原则如下：蛋白质分离纯化的基本原则如下：l材料：目标物浓度高、新鲜；采用温和方法处理；尽材料：目标物浓度高、新鲜；采用温和方法处理；尽量避免活性损失。量避免活性损失。第八十一页，讲稿共一百二十八页哦1.1.材料预处理及细胞破碎材料预处理及细胞破碎l材料选择：选择目标蛋白含量
45、高，容易提取的材料；若要制备材料选择：选择目标蛋白含量高，容易提取的材料；若要制备有活性的蛋白质，所用材料须新鲜且含量高。有活性的蛋白质，所用材料须新鲜且含量高。l材料预处理材料预处理l丙酮干粉丙酮干粉：如果要制备的蛋白质对丙酮不敏感，可制成丙酮干：如果要制备的蛋白质对丙酮不敏感，可制成丙酮干粉（反复用粉（反复用4-8倍体积的冷丙酮脱水），以防止蛋白酶的水解倍体积的冷丙酮脱水），以防止蛋白酶的水解及温度变化带来的变性。及温度变化带来的变性。l冰箱及液氮罐保藏冰箱及液氮罐保藏l冰箱冰箱-20，液氮，液氮-193。可长期保藏。可长期保藏。第八十二页，讲稿共一百二十八页哦l破碎细胞破碎细胞l 释放蛋
46、白质释放蛋白质l 破坏细胞的方法有：破坏细胞的方法有：l 机械破碎法机械破碎法；l 利用机械力的搅切作用破坏细胞壁和细胞膜。利用机械力的搅切作用破坏细胞壁和细胞膜。l 高速组织捣碎机，匀浆器，研钵。高速组织捣碎机，匀浆器，研钵。第八十三页，讲稿共一百二十八页哦l渗透破碎：渗透破碎：利用低渗条件使细胞膨胀而破碎。利用低渗条件使细胞膨胀而破碎。l冻融法冻融法：利用细胞内冰晶破坏膜结构，反复进行多次。但：利用细胞内冰晶破坏膜结构，反复进行多次。但温度敏感蛋白不用此法。温度敏感蛋白不用此法。l超声波法超声波法：超声波使细胞膜受张力不均破裂，超声波震荡：超声波使细胞膜受张力不均破裂，超声波震荡器。器。l
47、酶法酶法：溶菌酶破坏微生物细胞膜。：溶菌酶破坏微生物细胞膜。第八十四页，讲稿共一百二十八页哦第八十五页，讲稿共一百二十八页哦第八十六页，讲稿共一百二十八页哦第八十七页，讲稿共一百二十八页哦2.2.蛋白质抽提蛋白质抽提l根据要制备的蛋白质的性质，选择合适的溶剂将蛋白质与其根据要制备的蛋白质的性质，选择合适的溶剂将蛋白质与其它组分分开。它组分分开。l合适溶剂是指选择有适宜的合适溶剂是指选择有适宜的pHpH、离子强度、组成成分等的缓冲液。、离子强度、组成成分等的缓冲液。例如磷酸盐缓冲液柠檬酸缓冲溶液等。例如磷酸盐缓冲液柠檬酸缓冲溶液等。l抽提过程中是在低温下进行的，要注意将温度控制在抽提过程中是在低
48、温下进行的，要注意将温度控制在4 41010；l提取时需要强化传质，往往使用搅拌器，但是要注意避免剧烈提取时需要强化传质，往往使用搅拌器，但是要注意避免剧烈搅拌或使用过大的剪切力，以防止蛋白变性。搅拌或使用过大的剪切力，以防止蛋白变性。第八十八页，讲稿共一百二十八页哦3.3.获得蛋白粗品获得蛋白粗品l即从抽提液中获得初步分离蛋白质，常用的方法有：即从抽提液中获得初步分离蛋白质，常用的方法有：l等电点沉淀法等电点沉淀法；l调节提取液调节提取液pHpH，达到目标蛋白的等电点。，达到目标蛋白的等电点。l盐析法盐析法；l盐析分离的蛋白仍保持天然性质并能再度溶解。盐析分离的蛋白仍保持天然性质并能再度溶解
49、。l一般使用中性盐，例如最常用硫酸铵。但硫酸钠、磷酸钾效果一般使用中性盐，例如最常用硫酸铵。但硫酸钠、磷酸钾效果最好。最好。第八十九页，讲稿共一百二十八页哦l有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法l使用与水可任意互溶的小分子有机溶剂，例如乙醇和丙酮它使用与水可任意互溶的小分子有机溶剂，例如乙醇和丙酮它们从蛋白质分子表面大量夺取水分子，迫使蛋白质通过相反们从蛋白质分子表面大量夺取水分子，迫使蛋白质通过相反电荷间的吸引力聚集，溶解性降低，进而沉淀下来。电荷间的吸引力聚集，溶解性降低，进而沉淀下来。l调节溶液调节溶液pHpH，使其到达蛋白质的等电点附近时再加入有机溶剂，使其到达蛋白质的等电点附近时再加入有机溶
50、剂，则沉淀效果更好。有机溶剂破坏蛋白质表面的水膜时要放热，可则沉淀效果更好。有机溶剂破坏蛋白质表面的水膜时要放热，可能导致蛋白质变性，应尽量在低温下操作并选择合适的有机溶剂能导致蛋白质变性，应尽量在低温下操作并选择合适的有机溶剂浓度。浓度。第九十页，讲稿共一百二十八页哦二、分离纯化的主要方法二、分离纯化的主要方法l用上述方法得到的蛋白质粗品还混有其它蛋白质及非蛋白杂用上述方法得到的蛋白质粗品还混有其它蛋白质及非蛋白杂质，须进一步分离纯化才能得到可用于医药或工业等的产品。质，须进一步分离纯化才能得到可用于医药或工业等的产品。常用的纯化方法有：常用的纯化方法有：l离子交换色谱离子交换色谱l分子排阻