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1、第三章基因克隆的载体第1页，此课件共30页哦第三章第三章基因克隆的载体基因克隆的载体引引 言（言（introduction）第一节第一节 质粒载体（质粒载体（plasimid vectors）第二节第二节 噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectors）第三节第三节 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors）第四节第四节 人工染色体载体（人工染色体载体（B/Y/HAC）第2页，此课件共30页哦引引 言言基因克隆的本质基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到是使目的基因在特定的条件下得到扩增和扩增和表达表达，而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于，而目的基因本身无法
2、进行复制，所以就必须借助于“载体载体”及其及其“寄主细胞寄主细胞”来实现。来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：作为基因克隆的载体必须具备以下特性：A.能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；B.具有具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；C.具备多克隆位点（具备多克隆位点（MCS），而且可携带外源），而且可携带外源DNA片段的长度范片段的长度范围较宽。围较宽。D.自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和DNA的制的制备。备。第3页，此课件共30页
3、哦载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能载体的功能载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件第4页，此课件共30页哦载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体应具备的条件载体应
4、具备的条件载体应具备的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较具有较具有较高的外源高的外源高的外源高的外源DNADNA的载装能力的载装能力的载装能力的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特
5、定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 第5页，此课件共30页哦Characteristics of vectors for gene Characteristics of vectors for gene cloningcloningMCSMarkerForeign gene第6页，此课件共30页哦第三章第三章基因克隆的载体基因克隆的载体引引 言（言（introduction）第一节第一节 质粒载体（质粒载体（plasimid vectors）第二节第二节 噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectors
6、）第三节第三节 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors）第四节第四节 人工染色体载体（人工染色体载体（B/Y/HAC）第7页，此课件共30页哦第一节第一节 质粒载体质粒载体（plasimid vectors）1、质粒载体的生物学特性、质粒载体的生物学特性2、质粒载体相关知识介绍、质粒载体相关知识介绍第8页，此课件共30页哦1.1.质粒载体的生物学特性质粒载体的生物学特性（1）质粒质粒是是一种广泛从在于细菌细胞中一种广泛从在于细菌细胞中染色体以染色体以 外外的能的能自主的复制自主的复制的裸露的的裸露的环状双链环状双链DNA分子，比病毒分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝更简单。在霉菌
7、、蓝藻、酵母和一些动植藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质特别是大肠杆菌的质粒。粒。第9页，此课件共30页哦质粒：质粒：是一种裸露的双链闭环是一种裸露的双链闭环DNADNA分子，它们在寄主细胞中能够独分子，它们在寄主细胞中能够独立地自我复制从而得到不断的繁殖。作为基因工程载体，质粒至少应该立地自我复制从而得到不断的繁殖。作为基因工程载体，质粒至少应该具备具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。等部分。第10页，此课件共30页哦多克隆位点
8、多克隆位点：克隆载体中的一段用于插入外源克隆载体中的一段用于插入外源DNADNA片段的特定区片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。选择标记基因：选择标记基因：在基因在基因工程中的一类用于选择转化工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通细胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉素、四环素、比如对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。
9、这样，素等具有抗性的基因。这样，通过在培养基中加入特定的通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选自得到转化抗生素就可以选自得到转化的细胞（菌）。的细胞（菌）。第11页，此课件共30页哦1.1.质粒载体的生物学特性质粒载体的生物学特性（2）质粒的大小质粒的大小差异很大差异很大，最小的只有，最小的只有1kb,只能只能编码中等大小的编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到种蛋白质分子，最大的达到200kb。（3）质质粒粒的的生生存存在在寄寄主主细细胞胞中中“友友好好”地地“借借居居”，离离开开了了寄寄主主它它本本身身无无法法复复制制，它它可可以以赋赋予予寄寄主主一一些些非非染染色色体体控控制制的的
10、遗遗传传性性状状，以以利利于于寄寄主主的的生生存存。比比如如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。第12页，此课件共30页哦1.1.质粒载体的生物学特性质粒载体的生物学特性（4）质粒的存在形式质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，状双螺旋三种，双螺旋共价闭合双螺旋共价闭合环（超螺旋）环（超螺旋）开环双螺旋开环双螺旋（一个裂口）（一个裂口）线状双螺旋线状双螺旋（两个裂口）（两个裂口）第13页，此课件共30页哦1.1.质粒载体的生物学特性质粒载体的生物学特性（5）质质粒粒的的复复制制类类型型一一种种质质粒粒在在宿宿主主细细胞胞中
11、中存存在在的的数数目目称称为为该该质质粒粒的的拷拷贝贝数数。据据拷拷贝贝数数将将质质粒粒分分为为两两种种复复制制型型：“严严紧紧型型”质质粒粒（stigent plasmid）,拷拷贝贝数数为为1-3；“松松弛弛型型”质质粒粒（relaxed plasmid）,拷拷贝贝数数为为10-60。不不过过，即即使使是是同同一一质质粒粒，其其拷拷贝贝数数在在不不同同的的寄寄主主细细胞胞间间也也可可能能有有很很大的变化。大的变化。（6）质粒的不亲和性质粒的不亲和性两种亲缘关系密切的不同质粒两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。已鉴别出不能在同一宿主细胞中稳定共存。已鉴别出25个以上大肠杆
12、个以上大肠杆菌质粒的不亲和群，它们之间是相容的。菌质粒的不亲和群，它们之间是相容的。第14页，此课件共30页哦质粒的不相容性质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群以大肠杆菌容性，不相容性的质粒组成不相容性群以大肠杆菌的质粒为例：的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相拥有相似的复制子结构，彼此不相容容p1
13、5A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容相容第15页，此课件共30页哦质粒的不相容性分子机制：质粒的不相容性分子机制：两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复内两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰
14、，致使制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势第16页，此课件共30页哦质粒的可转移性质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等质粒等非接合型质粒非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生不能在天然条件下独立地发生接合作用如接合作用如Col、R的其它成
15、员。值得注意的的其它成员。值得注意的是，某些非接合型质粒（是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个转移，这个过程由过程由 bom 和和mob 基因决定基因决定第17页，此课件共30页哦携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记野生型的质粒野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素
16、、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重重组分子的筛选具有重要意义要意义第18页，此课件共30页哦第一节第一节 质粒载体质粒载体（plasimid vectors）1、质粒载体的生物学特性、质粒载体的生物学特性2、质粒载体相关知识介绍、质粒载体相关知识介绍第19页，此课件共30页哦质粒的构建质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生满足克隆载体
17、的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：个野生型质粒构建的：pSC101:8.8 kb 拷贝数拷贝数 5 四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因 TetrColE1:6.5 kb 拷贝数拷贝数 20-30 大肠杆菌内毒素标大肠杆菌内毒素标记基因记基因 E1PSF2124 ColE1衍生质粒衍生质粒氨苄青霉素抗性标氨苄青霉素抗性标记基因记基因 Apr第20页，此课件共30页哦质粒的分类质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：人工构建的质粒
18、根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒高拷贝质粒:突变拷贝数控制基因，拷贝数突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩增基因，扩增基因低拷贝质粒低拷贝质粒:来自来自pSC101 拷贝数小于拷贝数小于10 表达某些毒性基因表达某些毒性基因温敏质粒温敏质粒:在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒测序质粒:含有测序通用引物互补序列和多酶接含有测序通用引物互补序列和多酶接polylinker整合质粒整合质粒:装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合穿梭质粒穿梭质粒:装有针对两种不同受体的复制子，便于
19、基因克隆装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆表达质粒表达质粒:装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒探针质粒:装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选第21页，此课件共30页哦重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pBR322：松弛型复制松弛型复制 氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数 50-100/cell用于基因克隆用于基因克隆:pMB1Ampr:PSF2124Tetr:pSC101第22页，此课件共30页哦pBR3224363连接加反应液Tet or AmpTet+AmpCK+2
20、.质粒载体相关知识介绍质粒载体相关知识介绍第23页，此课件共30页哦重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：拷贝数拷贝数 2000-3000/cell装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZ用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序 第24页，此课件共30页哦-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的a-a-肽段肽段肽段肽段a a a 重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：正选择标记：正选择标记 lacZ 的显色原理的显色原理MCSlacZPlacpUC18/19IPTG(异丙基硫代半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷
21、)X-gal5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚基吲哚基-D-半乳糖苷半乳糖苷5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝第25页，此课件共30页哦（1）-互补互补(alpha-complementation)大大肠肠杆杆菌菌-半半乳乳糖糖苷苷酶酶 可可以以和和其其底底物物X-Gal 相相互互作作用用并并且且释释放放出出一一种种蓝蓝色色物物质质，当当该该酶酶的的-片片段段和和-片片段段分分开开时时就就失失去去了了这这种种显显色色的的功功能能。通通常常将将编编码码该该酶酶-片片段段的的LacZ 基基因因插插入入到到载载体体的的多多克克隆隆位位点点的的侧侧翼翼序序列列中中，而而在在一一些些人人工工构构建建的的大大肠肠杆杆菌
22、菌株株系系中中却却只只能能编编码码产产生生该该酶酶的的 片片段段。这这样样一一来来，含含有有功功能能性性完完整整的的LacZ 基基因因的的载载体体导导入入到到这这类类寄寄主主细细胞胞中中时时，载载体体编编码码的的 -片片段段就就能能和和寄寄主主编编码码的的 片片段段发发生生互互补补并并具具有有了了对对底底物物X-gal的的作作用用功功能能（发发生生显显色色反反应应），这种现象被成为是这种现象被成为是 alpha-complementation.2.质粒载体相关知识介绍质粒载体相关知识介绍第26页，此课件共30页哦 所所以以含含有有这这类类载载体体的的菌菌落落就就很很容容易易在在含含有有底底物物
23、X-Gal和和诱诱导导物物IPTG(异异丙丙基基硫硫代代半半乳乳糖糖苷苷)的的平平板板上上分分辨辨出出来来。因因为为这这类菌落中类菌落中释放释放出的出的蓝色物质蓝色物质可以将整个菌可以将整个菌落染成蓝色，落染成蓝色，非常容易辨别。非常容易辨别。2.2.质粒载体相关知识介绍质粒载体相关知识介绍第27页，此课件共30页哦重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z：多拷贝多拷贝装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZ装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达 注意：注意：T7和和SP6启动子特异性
24、地由噬启动子特异性地由噬菌体菌体DNA编码的编码的RNA聚合酶所识别，因聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚聚合酶，如：合酶，如：E.coli BL21（DE3）等）等pGEM-3E 2743 bpAprorilacZPT7MCSPSP6第28页，此课件共30页哦质粒质粒DNA的分离纯化的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法:质粒质粒DNA纯度高、周期长、设备纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染要求高、溴乙锭污染沸水浴法沸水浴法:质粒质粒DNA纯度底、快速、操作简便纯度底、快速、操作简便碱溶法碱溶法:质粒质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间法之间第29页，此课件共30页哦质粒质粒DNA的分离纯化的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法：用含有用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加加CsCl和溴乙锭超速离心过夜和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀稀释沉淀cccDNAproteinsRNAscccDNAL-DNAocDNA第30页，此课件共30页哦