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1、第四讲蛋白质的化学修饰第1页，此课件共96页哦一、概述一、概述n指在指在温和温和条件下，蛋白质条件下，蛋白质侧链侧链基团与化学试剂形成基团与化学试剂形成专一性共价键专一性共价键的反应。的反应。n涉及蛋白质侧链及修饰剂的反应性两个方面涉及蛋白质侧链及修饰剂的反应性两个方面化学修饰的意义化学修饰的意义改造蛋白质，改善其功能性质，使适用于更广泛领域；科学改造蛋白质，改善其功能性质，使适用于更广泛领域；科学研究，例如酶的活性中心，致病性，药物生物大分子相互作研究，例如酶的活性中心，致病性，药物生物大分子相互作用、药物设计等。用、药物设计等。第2页，此课件共96页哦蛋白质功能基的反应性蛋白质功能基的反应
2、性通过通过X射线分析蛋白质所得的数据显示，多数非极性侧链射线分析蛋白质所得的数据显示，多数非极性侧链位于蛋白质分子的内部，而大部分极性侧链则位于其表面。位于蛋白质分子的内部，而大部分极性侧链则位于其表面。蛋白质分子表面不规则，极性也不相同。蛋白质分子表面不规则，极性也不相同。蛋白质功能基所处的微环境强烈影响它的物理和化学蛋白质功能基所处的微环境强烈影响它的物理和化学性质，同时也影响参与修饰的化学试剂接近，从而显性质，同时也影响参与修饰的化学试剂接近，从而显著影响对该功能基的化学修饰。著影响对该功能基的化学修饰。第3页，此课件共96页哦就目前的研究成果来看，蛋白质的修饰反应都是就目前的研究成果来
3、看，蛋白质的修饰反应都是就目前的研究成果来看，蛋白质的修饰反应都是就目前的研究成果来看，蛋白质的修饰反应都是亲核反应。即与参与修饰的化学试剂是富电子的，亲核反应。即与参与修饰的化学试剂是富电子的，亲核反应。即与参与修饰的化学试剂是富电子的，亲核反应。即与参与修饰的化学试剂是富电子的，进攻蛋白质侧链基团的缺电子部分，反之亦然。进攻蛋白质侧链基团的缺电子部分，反之亦然。进攻蛋白质侧链基团的缺电子部分，反之亦然。进攻蛋白质侧链基团的缺电子部分，反之亦然。第4页，此课件共96页哦n n特别注意：被修饰蛋白质侧链基团的亲核性与其特别注意：被修饰蛋白质侧链基团的亲核性与其特别注意：被修饰蛋白质侧链基团的亲
4、核性与其特别注意：被修饰蛋白质侧链基团的亲核性与其pKpK值相关。值相关。值相关。值相关。影响蛋白质侧链基团影响蛋白质侧链基团影响蛋白质侧链基团影响蛋白质侧链基团pKpK值的因素有：值的因素有：值的因素有：值的因素有：n微区极性微区极性n决定基团解离状态的关键因素之一。例如，溶菌酶中第决定基团解离状态的关键因素之一。例如，溶菌酶中第Glu35的的-羧基在水溶液中的羧基在水溶液中的pKa=5.9；当其与抑制剂三；当其与抑制剂三-N-乙酰乙酰氨基葡萄糖结合后，此时氨基葡萄糖结合后，此时Glu35的的-羧基羧基pKa=6.4，上升了，上升了0.5。可能是由于抑制剂的加入，改变了该酶的构象，使该残基。
5、可能是由于抑制剂的加入，改变了该酶的构象，使该残基微区极性降低之故。微区极性降低之故。第5页，此课件共96页哦第6页，此课件共96页哦第7页，此课件共96页哦n蛋白质构象改变会导致微区极性的局部改变，这蛋白质构象改变会导致微区极性的局部改变，这种改变对种改变对nTrp，Met和和Cys的反应性影响最小的反应性影响最小;n对氨基和咪唑基的反应性影响较大对氨基和咪唑基的反应性影响较大;n而对而对Tyr，Hcys和和COOH的反应性影响最大。此的反应性影响最大。此外，极性的变化也影响到反应类型。外，极性的变化也影响到反应类型。第8页，此课件共96页哦氢键效应氢键效应n氢键对维持天然蛋白质及其离子稳定
6、性有重要影响，氢键的氢键对维持天然蛋白质及其离子稳定性有重要影响，氢键的变化也可能导致变化也可能导致pK发生改变。发生改变。n例如例如2-氯酚氯酚pK比比2-溴酚溴酚pK值高值高0.7pH单位，这是由于氯单位，这是由于氯与酚基形成氢键的能力比溴强。水杨酸的羧基可与其酚与酚基形成氢键的能力比溴强。水杨酸的羧基可与其酚基形成氢键，结果使其羧基的基形成氢键，结果使其羧基的pK值比正常值小值比正常值小1个个pH单单位，同时使酚基的正常位，同时使酚基的正常pK10改变到改变到pK13，因此，在蛋白，因此，在蛋白质的酚基质的酚基-羧基相互作用中，羧基的羧基相互作用中，羧基的pK值应比正常值低，值应比正常值
7、低，而酚基的而酚基的pK值高于正常值。值高于正常值。第9页，此课件共96页哦第10页，此课件共96页哦静电效应静电效应n蛋白质中组氨酸残基的蛋白质中组氨酸残基的pK值是不同的。例如，碳酸酐值是不同的。例如，碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基，个组氨酸残基，pK值分别是：值分别是：n碳酸酐酶：碳酸酐酶：5.91 6.04 7.00 7.23n葡萄球菌核酸酶：葡萄球菌核酸酶：5.37 5.71 5.74 6.50n组氨酸在这两个蛋白质中的组氨酸在这两个蛋白质中的pK值范围是值范围是5.377.23，几，几乎相差乎相差2个个pH单位，可能是邻近带电基团相互影响所致。单位
8、，可能是邻近带电基团相互影响所致。第11页，此课件共96页哦n总之总之n影响蛋白质可解离氨基酸侧链影响蛋白质可解离氨基酸侧链pKa值、可影响值、可影响这些侧链基团的反应性。这些侧链基团的反应性。n蛋白质功能基的微区状态不同，反应性不同。蛋白质功能基的微区状态不同，反应性不同。n功能基反应性差异可通过竞争标记法来测定。功能基反应性差异可通过竞争标记法来测定。第12页，此课件共96页哦位阻效应位阻效应n蛋白质表面的侧链基团旁有烷基等较大基团时，有基团空间蛋白质表面的侧链基团旁有烷基等较大基团时，有基团空间位阻，影响与修饰剂接近及反应。位阻，影响与修饰剂接近及反应。n例如，枯草杆菌蛋白酶的所有例如，
9、枯草杆菌蛋白酶的所有10个个Tyr残基均在分子表面，而残基均在分子表面，而且其酚羟基几乎都不形成氢键。对它进行彻底硝化和碘化，且其酚羟基几乎都不形成氢键。对它进行彻底硝化和碘化，10个个Tyr中也只有中也只有8个被修饰，这很可能是空间障碍所引起的。个被修饰，这很可能是空间障碍所引起的。n此外，电荷转移，共价键形成，金属鳌合等都会改变蛋白质此外，电荷转移，共价键形成，金属鳌合等都会改变蛋白质功能基的反应性。功能基的反应性。第13页，此课件共96页哦蛋白质功能基的超反应性蛋白质功能基的超反应性n超反应性是指蛋白质中的某侧链基团与某试剂发生反应超反应性是指蛋白质中的某侧链基团与某试剂发生反应的能力。
10、的能力。n超反应性基团一般与蛋白质的某种功能性有关。超反应性基团一般与蛋白质的某种功能性有关。n超反应基团并不一定在酶的活性中心。超反应基团并不一定在酶的活性中心。n例如，木瓜蛋白酶中的例如，木瓜蛋白酶中的19个个Tyr残基中只有一个能与二残基中只有一个能与二异丙基氟磷酸反应，该残基被修饰后并不一定使酶活性异丙基氟磷酸反应，该残基被修饰后并不一定使酶活性发生改变。发生改变。第14页，此课件共96页哦影响超反应性的因素很复杂影响超反应性的因素很复杂包括；包括；功能基的功能基的pKa；功能基的亲核性；功能基的亲核性；吸引试剂吸引试剂并使其适当取向的能力；并使其适当取向的能力；功能基所在区域与修饰剂
11、的立体功能基所在区域与修饰剂的立体化学适应性。化学适应性。修饰剂的反应性修饰剂的反应性蛋白质的构象和表面特性既影响氨基酸侧链的反应性，也蛋白质的构象和表面特性既影响氨基酸侧链的反应性，也可能对接近功能基的修饰剂产生影响。可能对接近功能基的修饰剂产生影响。第15页，此课件共96页哦n修饰剂修饰蛋白质反应的活性由以下因素所决定：修饰剂修饰蛋白质反应的活性由以下因素所决定：n选择吸附选择吸附n修饰剂与蛋白质功能基之间的选择性吸附越强，反应性越修饰剂与蛋白质功能基之间的选择性吸附越强，反应性越大。大。n静电相互作用静电相互作用n带电荷的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的某带电荷的修饰剂能被
12、选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的某一残基定位。一残基定位。第16页，此课件共96页哦例如，用碘乙酸和碘乙酰胺对例如，用碘乙酸和碘乙酰胺对His咪唑基烷基化的速度和咪唑基烷基化的速度和烷基化部位的差异就是由于静电作用造成的。（烷基化部位的差异就是由于静电作用造成的。（His的的N-1或或N-3的烷基化）的烷基化）第17页，此课件共96页哦位阻因素位阻因素n蛋白质表面的位阻，或底物、辅助因子、抑制剂产生的位蛋白质表面的位阻，或底物、辅助因子、抑制剂产生的位阻都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。阻都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。n例如，例如，-溴代丁酸可烷化核糖核酸酶溴代丁酸可烷化核糖核酸酶
13、His12，而且反应很快；，而且反应很快；若用若用-溴代戊酸修饰，则很难进行反应；溴代戊酸修饰，则很难进行反应；-溴代己酸则不能溴代己酸则不能发生反应，这显然与位阻有关。发生反应，这显然与位阻有关。第18页，此课件共96页哦催化因素催化因素n修饰部位附近的其它功能基，若有酸碱催化作用，也能影响修饰部位附近的其它功能基，若有酸碱催化作用，也能影响修饰反应。修饰反应。n例如，对硝基苯乙酸盐和苯乙酸盐以同一机理对胰凝乳蛋白酶的例如，对硝基苯乙酸盐和苯乙酸盐以同一机理对胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸进行乙酰化，但苯乙酸盐反应性差，这与酶的酸碱催活性丝氨酸进行乙酰化，但苯乙酸盐反应性差，这与酶的酸碱催化有关。
14、硝基苯乙酸盐对丝氨酸酶的反应性较高，这与化有关。硝基苯乙酸盐对丝氨酸酶的反应性较高，这与Ser附近附近的路易斯碱与羧酸羟基氢作用，削弱该氧原子对羧基碳的吸电子的路易斯碱与羧酸羟基氢作用，削弱该氧原子对羧基碳的吸电子相互作用有关。相互作用有关。第19页，此课件共96页哦第20页，此课件共96页哦第21页，此课件共96页哦局部环境的极性局部环境的极性n溶剂极性可能与反应速度有关，如下表：溶剂极性可能与反应速度有关，如下表：n反应类型反应类型降低极性对速度的影响降低极性对速度的影响nRSR+ICH2CONH2 R2S+CH2CONH2I-适当或大大降低适当或大大降低nRSR+H2O2 R2SO+H2
15、O 没有影响没有影响nRS-+ICH2CONH2 R2SCH2CONH2+I-没有影响没有影响nRN+H3+OCN-RNHCONH2 适当或大大增加适当或大大增加第22页，此课件共96页哦n疏水环境能阻止产物电荷分离的反应（反应疏水环境能阻止产物电荷分离的反应（反应1），并能加），并能加速电荷中和的反应（反应速电荷中和的反应（反应4）；）；n对于反应对于反应2（没有电荷分离）和反应（没有电荷分离）和反应3，电荷只是从一个，电荷只是从一个离子转移到另一个离子，则介质是的极性是不重要的。离子转移到另一个离子，则介质是的极性是不重要的。第23页，此课件共96页哦二、化学修饰的方法学二、化学修饰的方法
16、学n进行蛋白质修饰时，首先是选择修饰剂和修饰条件，以进行蛋白质修饰时，首先是选择修饰剂和修饰条件，以期提高修饰反应的专一性，获得满意的修饰结果。其次，期提高修饰反应的专一性，获得满意的修饰结果。其次，在修饰反应过程中，要建立适当的方法追踪反应进程，在修饰反应过程中，要建立适当的方法追踪反应进程，以获得与修饰有关的数据。以获得与修饰有关的数据。n然后分析获得的数据，确定修饰部位和修饰程度，提出对修然后分析获得的数据，确定修饰部位和修饰程度，提出对修饰结果的合理解释。饰结果的合理解释。第24页，此课件共96页哦一、控制修饰反应的专一性一、控制修饰反应的专一性n探索性研究时，对修饰对象的了解不多，所
17、以选择修饰剂和探索性研究时，对修饰对象的了解不多，所以选择修饰剂和修饰条件至关重要，选择的正确性直接影响到修饰反应的专修饰条件至关重要，选择的正确性直接影响到修饰反应的专一性和有效性。一性和有效性。n试剂选择试剂选择n不同实验，对修饰的专一性要求也不同，因此选择试剂在很大程度不同实验，对修饰的专一性要求也不同，因此选择试剂在很大程度上要依赖修饰目的。上要依赖修饰目的。n例如，对氨基的修饰，仅修饰氨基；仅修饰例如，对氨基的修饰，仅修饰氨基；仅修饰-氨基；修饰暴氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基。露的或反应性高的氨基。n一般通过选择试剂和反应条件来控制修饰的部位和程度一般通过选择试剂和反应条件来控制
18、修饰的部位和程度第25页，此课件共96页哦 如果希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，应该选择能引入最大电荷量的如果希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，应该选择能引入最大电荷量的如果希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，应该选择能引入最大电荷量的如果希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，应该选择能引入最大电荷量的试剂。试剂。试剂。试剂。例如用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性条件下带正电荷的氨基转例如用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性条件下带正电荷的氨基转例如用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性条件下带正电荷的氨基转例如用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性条件下带正电荷的氨基转变成在中性变成在中性变成在中性变成在
19、中性pHpH下带负电荷的衍生物。下带负电荷的衍生物。下带负电荷的衍生物。下带负电荷的衍生物。第26页，此课件共96页哦n修饰对有机溶剂不稳定的蛋白质，必须在水介质中进行，应选修饰对有机溶剂不稳定的蛋白质，必须在水介质中进行，应选择在水中有一定溶解度的试剂。择在水中有一定溶解度的试剂。n在选择试剂时，应考虑反应生成物容易进行定量测定，即有在选择试剂时，应考虑反应生成物容易进行定量测定，即有特殊的光吸收或同位素标记等。特殊的光吸收或同位素标记等。n选择试剂时，应注意其体积，体积过大，引起的空间障碍大选择试剂时，应注意其体积，体积过大，引起的空间障碍大,而而不能或不易与作用的基团接近。一般而言，试剂
20、体积较小为宜。不能或不易与作用的基团接近。一般而言，试剂体积较小为宜。n选择试剂时，应该考虑选择试剂时，应该考虑修饰反应要达到的程度；修饰后蛋白修饰反应要达到的程度；修饰后蛋白质构象是否基本保持不变；是否需要分离修饰后的衍生物，质构象是否基本保持不变；是否需要分离修饰后的衍生物，反应是否需要可逆等因素。反应是否需要可逆等因素。第27页，此课件共96页哦n总之总之理想的修饰酶活性部位氨基酸残基的试剂应该具备理想的修饰酶活性部位氨基酸残基的试剂应该具备以下特征以下特征:n即选择性地与一个氨基酸残基反应；即选择性地与一个氨基酸残基反应；n反应须在酶蛋白不变性的条件下进行；反应须在酶蛋白不变性的条件下
21、进行；n标记的残基在肽中稳定，易通过降解分离并进行鉴定；标记的残基在肽中稳定，易通过降解分离并进行鉴定；n反应程度可用简单的技术测定。反应程度可用简单的技术测定。n但是，一种试剂往往不能同时满足上述所有条件，所但是，一种试剂往往不能同时满足上述所有条件，所以必须根据具体实验要求进行取舍。以必须根据具体实验要求进行取舍。第28页，此课件共96页哦选择反应条件选择反应条件n修饰蛋白质的反应条件，除允许修饰反应能顺利进行外，还修饰蛋白质的反应条件，除允许修饰反应能顺利进行外，还必须满足：必须满足：n不造成蛋白质的不可逆变性不造成蛋白质的不可逆变性;n有利于专一性修饰蛋白质。有利于专一性修饰蛋白质。n
22、为此，应尽量控制反应的温度、为此，应尽量控制反应的温度、pH值、反应介质和缓冲液等，以值、反应介质和缓冲液等，以保证蛋白质特定空间构象尽量不变。保证蛋白质特定空间构象尽量不变。第29页，此课件共96页哦反应的专一性反应的专一性n专一性对蛋白质的化学修饰至关重要，用以下途径可以保证专一性对蛋白质的化学修饰至关重要，用以下途径可以保证修饰的专一性：修饰的专一性：n选择专一性试剂选择专一性试剂n蛋白质分子的特殊空间结构能影响其某些基团的活性。例如蛋白质分子的特殊空间结构能影响其某些基团的活性。例如DFP能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用，导致酶迅速失能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用，导致酶迅速失活。活
23、。第30页，此课件共96页哦第31页，此课件共96页哦选择不同的反应选择不同的反应pHn均受均受pH的影响，控制反应的影响，控制反应pH值，可调控蛋白质分子各功能基值，可调控蛋白质分子各功能基的解离程度，从而控制修饰反应的专一性。的解离程度，从而控制修饰反应的专一性。n例如，用碘乙酸或其酰胺可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的例如，用碘乙酸或其酰胺可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的侧链及侧链及-氨基、氨基、-氨基发生作用；氨基发生作用；pH6时，它只专一的与组时，它只专一的与组氨酸的咪唑基作用；氨酸的咪唑基作用；pH值为值为3时，专一与时，专一与Met作用（在酸性作用（在酸性下，巯基和氨基都呈正离子
24、，不活泼）。下，巯基和氨基都呈正离子，不活泼）。第32页，此课件共96页哦nICH2COOH+蛋白质蛋白质-SH 蛋白质蛋白质-S-CH2COO-+H+I-(pH7)nICH2COOH+蛋白质蛋白质-S-CH3 蛋白质蛋白质-S（-CH3）-CH2COO-+I-(pH3)nICH2COOH+蛋白质蛋白质-NH2 蛋白质蛋白质-NH-CH2COO-+H+I-(pH8)nICH2COOH+蛋白质蛋白质-His 蛋白质蛋白质-His（N-CH2COO-）+H+I-(pH6)第33页，此课件共96页哦利用某些产物的不稳定性利用某些产物的不稳定性n高高pH下，用氰酸、二硫化碳、下，用氰酸、二硫化碳、O-
25、甲基异脲和亚氨基酸等可转变甲基异脲和亚氨基酸等可转变氨基成脲和胍的衍生物。虽然巯基也能与上述试剂作用，但因氨基成脲和胍的衍生物。虽然巯基也能与上述试剂作用，但因pH高，形成的产物迅速被分解。高，形成的产物迅速被分解。n亲和标记亲和标记n亲和试剂先以非共价键结合到蛋白质的活性部位，再发生化学作用。亲和试剂先以非共价键结合到蛋白质的活性部位，再发生化学作用。因此亲和标记试剂必须与蛋白质作用的底物或抑制剂相似，可顺利因此亲和标记试剂必须与蛋白质作用的底物或抑制剂相似，可顺利到达修饰位点，而且还能与特定活性基团反应。例如，利用对甲基到达修饰位点，而且还能与特定活性基团反应。例如，利用对甲基苯磺酸氯（苯
26、磺酸氯（CH3-C6H4-SO2Cl），就能作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝），就能作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上。氨酸上。第34页，此课件共96页哦第35页，此课件共96页哦差别标记差别标记n以底物或抑制剂保护蛋白质的活性部位基团，使其不能与修饰以底物或抑制剂保护蛋白质的活性部位基团，使其不能与修饰试剂作用，可修饰非必需基团。然后将过量的底物或抑制剂除试剂作用，可修饰非必需基团。然后将过量的底物或抑制剂除去，获得部分修饰的蛋白质。将其与同位素标记的同样试剂作去，获得部分修饰的蛋白质。将其与同位素标记的同样试剂作用，则获得带有放射性同位素标记的蛋白质活性中心基团。用，则获得带有放射性同位素标记的蛋
27、白质活性中心基团。第36页，此课件共96页哦利用蛋白质状态的差异利用蛋白质状态的差异n在不同状态下，蛋白质的构象有差异，暴露的基团也不同，因此在不同状态下，蛋白质的构象有差异，暴露的基团也不同，因此在不同状态下修饰，可获得相关信息。在不同状态下修饰，可获得相关信息。n例如，在结晶状态下修饰，可提高修饰的专一性。核糖核酸酶在例如，在结晶状态下修饰，可提高修饰的专一性。核糖核酸酶在晶体状态下进行羧甲基化时，反应主要集中在晶体状态下进行羧甲基化时，反应主要集中在His119，而对，而对His12的修饰则很少，两者之比为的修饰则很少，两者之比为60 1；在溶液中该反应的比例为；在溶液中该反应的比例为1
28、5 1。第37页，此课件共96页哦二、确定修饰程度和修饰部位二、确定修饰程度和修饰部位n通过对被修饰蛋白质的降解和氨基酸分析后鉴定修饰部位。通过对被修饰蛋白质的降解和氨基酸分析后鉴定修饰部位。n通过纯化被修饰蛋白质的氨基酸及其衍生物，测定其同位素标通过纯化被修饰蛋白质的氨基酸及其衍生物，测定其同位素标记量或光谱强度或顺磁共振谱或荧光标记量等来确定反应程度。记量或光谱强度或顺磁共振谱或荧光标记量等来确定反应程度。n一般认为：测定被修饰的氨基酸，要比测定氨基酸的减一般认为：测定被修饰的氨基酸，要比测定氨基酸的减少量更准确。少量更准确。第38页，此课件共96页哦三、化学修饰数据的分析三、化学修饰数据
29、的分析n化学修饰的时间进程曲线化学修饰的时间进程曲线n以修饰时间对蛋白质活性作图以修饰时间对蛋白质活性作图n可以了解修饰残基的性质和数目，修饰残基与蛋白质活性的关可以了解修饰残基的性质和数目，修饰残基与蛋白质活性的关系，实际上是蛋白质失活速度常数的测定系，实际上是蛋白质失活速度常数的测定n若蛋白质活性仅与某个残基有关，则可用公式（后面）表示若蛋白质活性仅与某个残基有关，则可用公式（后面）表示nLog E1/E0=-K失活失活tnE1为时间为时间t时的活力，时的活力，E0为初始活力，为初始活力，E1/E0为时间为时间t时的残余活力时的残余活力第39页，此课件共96页哦用残余活力的对数对时间作图，
30、即可求出失活的速度常数用残余活力的对数对时间作图，即可求出失活的速度常数用残余活力的对数对时间作图，即可求出失活的速度常数用残余活力的对数对时间作图，即可求出失活的速度常数第40页，此课件共96页哦n若蛋白质活力与两个以上的残基有关，而且与修饰剂反应速度不若蛋白质活力与两个以上的残基有关，而且与修饰剂反应速度不相同，可获得多相修饰半对数图相同，可获得多相修饰半对数图第41页，此课件共96页哦n确定必需基团的性质和数目确定必需基团的性质和数目n蛋白质分子中某些侧链基团在功能上虽有必需和非必蛋白质分子中某些侧链基团在功能上虽有必需和非必需之分，但它们往往都能与某一试剂起反应。需之分，但它们往往都能
31、与某一试剂起反应。n1961年年Ray等提出用比较一级反应动力学常数来确定必需等提出用比较一级反应动力学常数来确定必需基团的性质和数目的方法，但是该法的局限性大，现基本基团的性质和数目的方法，但是该法的局限性大，现基本被放弃。被放弃。第42页，此课件共96页哦19621962年，邹承鲁提出更具普遍应用意义的统计学方法，即邹氏作图年，邹承鲁提出更具普遍应用意义的统计学方法，即邹氏作图年，邹承鲁提出更具普遍应用意义的统计学方法，即邹氏作图年，邹承鲁提出更具普遍应用意义的统计学方法，即邹氏作图法法法法该法认为：当试剂仅作用于蛋白质分子中一种基团，而且必需基团和非必该法认为：当试剂仅作用于蛋白质分子中
32、一种基团，而且必需基团和非必该法认为：当试剂仅作用于蛋白质分子中一种基团，而且必需基团和非必该法认为：当试剂仅作用于蛋白质分子中一种基团，而且必需基团和非必需基团与试剂作用的速度相同时，活力变化与修饰残基之间有如下关系：需基团与试剂作用的速度相同时，活力变化与修饰残基之间有如下关系：需基团与试剂作用的速度相同时，活力变化与修饰残基之间有如下关系：需基团与试剂作用的速度相同时，活力变化与修饰残基之间有如下关系：1/i/i=X=X；x=x=（n-mn-m）/n/n 为实验测得的平均活力剩余分数，为实验测得的平均活力剩余分数，为实验测得的平均活力剩余分数，为实验测得的平均活力剩余分数，x x是基团的
33、保留分数，是基团的保留分数，是基团的保留分数，是基团的保留分数，n n为蛋白质为蛋白质为蛋白质为蛋白质分子中可被修饰的基团总数，分子中可被修饰的基团总数，分子中可被修饰的基团总数，分子中可被修饰的基团总数，mm为已被修饰的基团数。为已被修饰的基团数。为已被修饰的基团数。为已被修饰的基团数。第43页，此课件共96页哦n当当n为已知时，为已知时，x可由实验测得的可由实验测得的m值计算而得。由上式两边取对数，以值计算而得。由上式两边取对数，以log对对log x作图得直线，其斜率即为必需基团数作图得直线，其斜率即为必需基团数i。当。当n为未知时，为未知时，x无法求得，无法求得，但可根据上式给定一系列
34、的但可根据上式给定一系列的i值（值（1，2，3）。使得）。使得1/i对对m作图为一直作图为一直线的那个线的那个i值。值。第44页，此课件共96页哦n蛋白质分子中的必需基团和非必需基团与修饰剂的作用速度明显蛋白质分子中的必需基团和非必需基团与修饰剂的作用速度明显不同，假定该基团总数为不同，假定该基团总数为n，并将其分为三类；一类是反应速度，并将其分为三类；一类是反应速度最快的必需基团，总数为最快的必需基团，总数为s，二是，二是p个反应速度较慢的基团，其个反应速度较慢的基团，其中中i个必需基团；三是反应最慢的基团，其数目为（个必需基团；三是反应最慢的基团，其数目为（n-p-s）。）。这时，活力的变
35、化与修饰程度间的关系是：这时，活力的变化与修饰程度间的关系是：n1/i=（p+s-m）/p或或1/i=（n/p）x-（n-p-s）/p，其中，其中，m是被修饰的基团数，是被修饰的基团数，x=（n-m）/n为基团剩余分数。以为基团剩余分数。以1/i对对m或或x作图，可以确定必需基团数作图，可以确定必需基团数i，也可由斜率和截距求得，也可由斜率和截距求得p和和s。第45页，此课件共96页哦n邹氏方法为蛋白质化学修饰研究由定性描述转入定邹氏方法为蛋白质化学修饰研究由定性描述转入定量提供了理论依据和计算方法，可用于蛋白质设计。量提供了理论依据和计算方法，可用于蛋白质设计。第46页，此课件共96页哦四、
36、化学修饰结果的解释四、化学修饰结果的解释n蛋白质功能改变蛋白质功能改变n确认试剂已经作用于蛋白质；确认试剂已经作用于蛋白质；n确认修饰蛋白质的构象是否发生显著变化；确认修饰蛋白质的构象是否发生显著变化；n确认修饰发生在何处，常用的方法有：确认修饰发生在何处，常用的方法有：修饰发生在活性部位的必须基团，蛋白质活性的丧失与修饰程度存修饰发生在活性部位的必须基团，蛋白质活性的丧失与修饰程度存修饰发生在活性部位的必须基团，蛋白质活性的丧失与修饰程度存修饰发生在活性部位的必须基团，蛋白质活性的丧失与修饰程度存在一定的化学计量关系。在一定的化学计量关系。在一定的化学计量关系。在一定的化学计量关系。n n底
37、物保护与修饰蛋白失活程度的关系分析。底物保护与修饰蛋白失活程度的关系分析。底物保护与修饰蛋白失活程度的关系分析。底物保护与修饰蛋白失活程度的关系分析。第47页，此课件共96页哦n注意分析修饰残基的稳定性注意分析修饰残基的稳定性n许多反应，如酰基转移、巯基转移、卤素转移及二硫键交换过程可能自许多反应，如酰基转移、巯基转移、卤素转移及二硫键交换过程可能自发地或在纯化、降解过程中发生。发地或在纯化、降解过程中发生。n例如，蛋白质中的碘代酪氨酸除对光和氧敏感外，在层析或在弱酸性介例如，蛋白质中的碘代酪氨酸除对光和氧敏感外，在层析或在弱酸性介质中，有碘离子存在时，能发生脱碘化作用。质中，有碘离子存在时，
38、能发生脱碘化作用。n又如，光敏化的组氨酸经酸水解后，产生许多未知产物，但这些又如，光敏化的组氨酸经酸水解后，产生许多未知产物，但这些未知产物峰的位置与正常氨基酸的峰位重叠。未知产物峰的位置与正常氨基酸的峰位重叠。n应引起特别注意，以区分修饰的真伪。应引起特别注意，以区分修饰的真伪。第48页，此课件共96页哦四、蛋白质侧链的修饰四、蛋白质侧链的修饰n蛋白质侧链上的功能基主要有；氨基、羧基、蛋白质侧链上的功能基主要有；氨基、羧基、巯基、吲哚基、胍基、甲酰基等，修饰上述每巯基、吲哚基、胍基、甲酰基等，修饰上述每一种功能基都有好多种试剂可以利用，这里不一种功能基都有好多种试剂可以利用，这里不再介绍。再
39、介绍。n仅介绍那些应用广泛，又能达到某种特殊目的仅介绍那些应用广泛，又能达到某种特殊目的的试剂，并且以专一性为主。的试剂，并且以专一性为主。第49页，此课件共96页哦氨基的修饰氨基的修饰n氨基的修饰可分为三类：氨基的修饰可分为三类：n引入正电荷的修饰；引入正电荷的修饰；n电荷消失的修饰；电荷消失的修饰；n引入负电荷的修饰。引入负电荷的修饰。n赖氨酸的赖氨酸的-NH2以非质子化形式存在时很活泼，可被选择以非质子化形式存在时很活泼，可被选择性修饰性修饰第50页，此课件共96页哦引入正电荷的修饰引入正电荷的修饰n下列试剂修饰氨基后，在赖氨酸侧链上留下可电离的带正电基团下列试剂修饰氨基后，在赖氨酸侧链
40、上留下可电离的带正电基团n还原烷基化还原烷基化n醛与赖氨酸侧链反应形成席夫碱，再用硼氢化钠还原席夫碱，获得稳定衍生醛与赖氨酸侧链反应形成席夫碱，再用硼氢化钠还原席夫碱，获得稳定衍生物物nE-NH2+RCHO E-NH-CHR E-NH-CH2Rn所用的醛可有不同的所用的醛可有不同的R基团，如甲醛、乙醛、丙醛等，用这些试剂修饰，基团，如甲醛、乙醛、丙醛等，用这些试剂修饰，可获得侧链微环境方面的信息可获得侧链微环境方面的信息第51页，此课件共96页哦n用烃基亚酰胺脒化（例如甲基乙亚酰胺）用烃基亚酰胺脒化（例如甲基乙亚酰胺）n反应所产生的衍生物在酸、中性反应所产生的衍生物在酸、中性pH下稳定，在碱下
41、稳定，在碱性性pH下不稳定下不稳定第52页，此课件共96页哦n消除电荷的修饰消除电荷的修饰n这类试剂可抑制赖氨酸的这类试剂可抑制赖氨酸的-NH2的质子化，使形成的衍生物不带电。的质子化，使形成的衍生物不带电。n乙酰化乙酰化n在微碱性在微碱性pH下，乙酸酐很容易与氨基作用，但是乙酸酐此时也能与巯基和咪下，乙酸酐很容易与氨基作用，但是乙酸酐此时也能与巯基和咪唑基发生反应，应在较低温度下进行。唑基发生反应，应在较低温度下进行。第53页，此课件共96页哦n甲氨酰化作用甲氨酰化作用n氰酸盐与氨基反应形成非常稳定的衍生物，同时能与巯基、酚基、羧基、咪唑基氰酸盐与氨基反应形成非常稳定的衍生物，同时能与巯基、
42、酚基、羧基、咪唑基发生反应，然而，除氨基衍生物外，其余反应产物在微碱性（发生反应，然而，除氨基衍生物外，其余反应产物在微碱性（pH8）条件下不）条件下不稳定，该反应应用广泛，一个明显的优点是氰酸盐离子体积小稳定，该反应应用广泛，一个明显的优点是氰酸盐离子体积小。副反应如下副反应如下第54页，此课件共96页哦第55页，此课件共96页哦引入负电荷的反应引入负电荷的反应n磷酸吡哆醛修饰磷酸吡哆醛修饰n磷酸吡哆醛修饰专一修饰氨基，赖氨酸残基在中性磷酸吡哆醛修饰专一修饰氨基，赖氨酸残基在中性pH下与下与磷酸吡哆醛（磷酸吡哆醛（PLP）反应，形成希夫碱，再用硼氢化钠）反应，形成希夫碱，再用硼氢化钠(NaB
43、H4)还原，得赖氨酸的不可逆修饰物，此产物不仅带负电，还原，得赖氨酸的不可逆修饰物，此产物不仅带负电，而且在而且在325nm处有最大吸收，可用于定量测定。产物还有强处有最大吸收，可用于定量测定。产物还有强烈荧光。烈荧光。第56页，此课件共96页哦第57页，此课件共96页哦酰化反应酰化反应第58页，此课件共96页哦精氨酸胍基的修饰精氨酸胍基的修饰n具有邻位羰基的化合物可与精氨酸的胍基形成稳定的杂环产物，具有邻位羰基的化合物可与精氨酸的胍基形成稳定的杂环产物，常用的试剂有丁二酮，苯甲酰甲醛和乙二醛。虽然胺或巯基也能常用的试剂有丁二酮，苯甲酰甲醛和乙二醛。虽然胺或巯基也能与试剂作用，但在中性与试剂作
44、用，但在中性pH下，其反应速度远比胍基慢。在碳下，其反应速度远比胍基慢。在碳酸氢盐缓冲液中，苯甲酰甲醛与精氨酸反应较快，而酸氢盐缓冲液中，苯甲酰甲醛与精氨酸反应较快，而-NH2在同样条件下不反应。在同样条件下不反应。第59页，此课件共96页哦第60页，此课件共96页哦第61页，此课件共96页哦羧基的修饰羧基的修饰n用水溶性碳二亚胺专一修饰蛋白质中的羧基。在这个修饰中，用水溶性碳二亚胺专一修饰蛋白质中的羧基。在这个修饰中，碳二亚胺先活化羧基，活化的中间体通过碳二亚胺先活化羧基，活化的中间体通过O N酰基转移而酰基转移而重排，或者与加入的亲核物形成相应的酰胺，该法应用重排，或者与加入的亲核物形成相
45、应的酰胺，该法应用广泛。广泛。n丝氨酸、半胱氨酸和酪氨酸在一定条件下也能发生该反丝氨酸、半胱氨酸和酪氨酸在一定条件下也能发生该反应应 第62页，此课件共96页哦第63页，此课件共96页哦巯基的修饰巯基的修饰n半胱氨酸是蛋白质中反应性最强的残基，所以半胱氨酸是蛋白质中反应性最强的残基，所以很多试剂可用来修饰巯基侧链，常用的试剂有很多试剂可用来修饰巯基侧链，常用的试剂有三类，即碘乙酸和碘乙酰胺或环乙烯亚胺；马三类，即碘乙酸和碘乙酰胺或环乙烯亚胺；马来酰亚胺或马来酸酐；有机汞试剂如对氯汞苯来酰亚胺或马来酸酐；有机汞试剂如对氯汞苯甲酸，其反应分别如下甲酸，其反应分别如下第64页，此课件共96页哦副反应
46、副反应第65页，此课件共96页哦第66页，此课件共96页哦组氨酸咪唑基的修饰组氨酸咪唑基的修饰n常用试剂是焦磷酸二乙酯和碘乙酸，用碘乙酸烷化组氨酸残基可获得单取代常用试剂是焦磷酸二乙酯和碘乙酸，用碘乙酸烷化组氨酸残基可获得单取代或双取代的衍生物或双取代的衍生物第67页，此课件共96页哦焦碳酸二乙酯修饰组氨酸特别有用，它在中性焦碳酸二乙酯修饰组氨酸特别有用，它在中性pH下有较好的专一性，能使咪下有较好的专一性，能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化，产物在唑环上的一个氮原子羧乙基化，产物在240nm处有最大吸收，可用来追踪反应处有最大吸收，可用来追踪反应和定量测定。和定量测定。羟胺使上述反应可逆进行，
47、从而回收组氨酸。焦碳酸二乙酯也能使酪羟胺使上述反应可逆进行，从而回收组氨酸。焦碳酸二乙酯也能使酪氨酸、赖氨酸或半胱氨酸的侧链发生相应的反应，但是在氨酸、赖氨酸或半胱氨酸的侧链发生相应的反应，但是在pH6时的反应时的反应速度慢，而且与赖氨酸或半胱氨酸的侧链的反应无可逆性。速度慢，而且与赖氨酸或半胱氨酸的侧链的反应无可逆性。第68页，此课件共96页哦色氨酸吲哚基的修饰色氨酸吲哚基的修饰nN-溴代琥珀酸亚胺（溴代琥珀酸亚胺（NBS）常用来修饰色氨酸，它使吲哚基氧化成为羟基）常用来修饰色氨酸，它使吲哚基氧化成为羟基吲哚衍生物，导致吲哚基在吲哚衍生物，导致吲哚基在280nm处的吸收值降低。该反应必须小心
48、进行，处的吸收值降低。该反应必须小心进行，若浓度过大，可使修饰的色氨酸残基处的肽键断裂。此外，酪氨酸也能与若浓度过大，可使修饰的色氨酸残基处的肽键断裂。此外，酪氨酸也能与NBS作用并干扰吲哚基的测定。作用并干扰吲哚基的测定。n各种苄基卤化物能使吲哚基环烷基化，最常用的是各种苄基卤化物能使吲哚基环烷基化，最常用的是2-羟基羟基-5-硝机基苄基溴及其类硝机基苄基溴及其类似物二甲基（似物二甲基（2-羟基羟基-5-硝基苄基）锍盐。这些试剂在没有半胱氨酸残基时，对色硝基苄基）锍盐。这些试剂在没有半胱氨酸残基时，对色氨酸是很专一的氨酸是很专一的第69页，此课件共96页哦带硝基取代基的硫基卤化物的专一性与锍
49、盐类似，但是能产生单一产物，带硝基取代基的硫基卤化物的专一性与锍盐类似，但是能产生单一产物，避免了锍盐修饰产物的不均匀性，而且产物的光谱性质可用来定量测定色避免了锍盐修饰产物的不均匀性，而且产物的光谱性质可用来定量测定色氨酸氨酸第70页，此课件共96页哦五、化学交联技术在蛋白质研究中的应用五、化学交联技术在蛋白质研究中的应用n定义：用双功能试剂或交联剂将两个分子结合起来的化学反应。定义：用双功能试剂或交联剂将两个分子结合起来的化学反应。n在蛋白质中，其肽链末端基团及侧链亲核基团都是交联的功能基，因此，交联在蛋白质中，其肽链末端基团及侧链亲核基团都是交联的功能基，因此，交联技术广泛用于研究蛋白质
50、的活性基团。目前，交联仍是研究蛋白质活性基团等技术广泛用于研究蛋白质的活性基团。目前，交联仍是研究蛋白质活性基团等的最有效，最多样化的技术之一。的最有效，最多样化的技术之一。n该技术可用于研究蛋白质的相互作用，不但可以确定蛋白质的相邻亚基，还可该技术可用于研究蛋白质的相互作用，不但可以确定蛋白质的相邻亚基，还可以确定相互作用蛋白质间的最大间距等。以确定相互作用蛋白质间的最大间距等。第71页，此课件共96页哦n在交联时要使用交联剂（包括使用酶）在交联时要使用交联剂（包括使用酶）n必须注意两点：必须注意两点：n交联是一个经验过程，无法预测哪种蛋白质在何种条件下与何种交联交联是一个经验过程，无法预测