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1、细胞工程单克隆抗体细胞工程单克隆抗体第1页，此课件共34页哦一、何谓单克隆抗体？一、何谓单克隆抗体？第2页，此课件共34页哦第3页，此课件共34页哦第4页，此课件共34页哦第5页，此课件共34页哦只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。第6页，此课件共34页哦 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特与经特定抗源免疫刺激的定抗源免疫刺激的B淋巴细胞淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞融合得到杂交瘤细胞(hybridoma ce
2、ll)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology）。）。第7页，此课件共34页哦Niels K.Jerne G.Kohler C.Milstein 第8页，此课件共34页哦 1975年，英国剑桥大学学者Kohler 和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫后的小鼠脾细胞进行融合，形成既能产生抗绵羊红细胞抗体、又能进行分裂繁殖的杂交瘤细胞，创立了
3、杂交瘤抗体技术，获1984年Nobel奖。1984年通过基因工程技术，初次建立了人-鼠杂交瘤。1987年单抗制剂开始用于临床试验。单抗技术，解决了抗体不纯的问题，标志着抗体制备从机体水平进入了细胞水平。由此而建立的单链抗体库技术和噬菌体抗体库技术等，则使抗体制备技术迈进分子水平。一、原理与概念一、原理与概念第9页，此课件共34页哦杂交瘤技术基本原理哺乳动物的免疫系统包括体液免疫和细胞免疫，参与这两种免疫反应的细胞有：B淋巴细胞和T淋巴细胞。B淋巴细胞，进一步发育成浆细胞，浆细胞能产生抗体，抗体参与体液免疫。T淋巴细胞，进一步发育成吞噬细胞，直接参与细胞免疫。T细胞不能产生抗体，但可以帮助B细胞
4、产生抗体。正常的B淋巴细胞不能在体外培养条件下长期生存，因而不能在体外持续产生抗体。而骨髓瘤细胞可以在体外快速生长，但不能分泌抗体。第10页，此课件共34页哦克隆选择学说作为抗体生成理论的克隆选择学说是杂交瘤技术产生的理论依据，细胞融合技术和杂交细胞的选择方法是杂交瘤技术产生的技术基础。克隆选择学说1957年Burnet提出的克隆选择学说认为：每一个B淋巴细胞有一个独特的受体(现在认为一个B淋巴细胞有结构相同的10万个受体)，抗原进入机体后只刺激具有相应受体的B淋巴细胞，产生与受体特异性相同的抗体分子。一个淋巴细胞只产生一种抗体分子。因此，根据克隆选择学说，一个B淋巴细胞克隆只能产生一种抗体分
5、子。这就是生产单克隆抗体的理论依据。第11页，此课件共34页哦单克隆抗体与多克隆抗体单克隆抗体与多克隆抗体的本质区别单克隆抗体是源于一个B淋巴细胞的杂交瘤细胞系所分泌的针对抗原的同一表位的抗体；而多克隆抗体(简称多抗)是由免疫动物的无数不同的B淋巴细胞分泌的针对抗原不同表位的性质各异的混合抗体。单抗是同质的，多抗是异质的。第12页，此课件共34页哦二、杂交瘤技术的基本原理二、杂交瘤技术的基本原理第13页，此课件共34页哦三、杂交瘤细胞的制备三、杂交瘤细胞的制备（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择次黄嘌呤鸟嘌
6、呤转磷酸核糖激酶缺陷型（选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第14页，此课件共34页哦HAT培养基培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第15页，此课件共34页哦（二）免疫小鼠（二）免疫小鼠 免疫程序是：取68周龄BalbC雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，35天后用于融合。免疫时是否采用
7、佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为l00g，第二次为50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1l06一1107。第16页，此课件共34页哦（三）脾细胞的制备（三）脾细胞的制备(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；(2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5mL无血清培养液无血清培养液 冲洗一次；冲洗一次；(3)把脾脏置于已消毒的把脾脏置于已消毒的90100目不锈钢网或尼龙纱网中；目不锈钢网或尼龙
8、纱网中；(4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养 液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入 3mL无血清培养液，反复抽吸数次获取细胞，再制成细胞悬液亦可；无血清培养液，反复抽吸数次获取细胞，再制成细胞悬液亦可；(5)把细胞悬液注入把细胞悬液注入50mL离心管中，加离心管中，加l020mL培养液：轻轻吹打数次，培养液：轻轻吹打数次，室温中置室温中置5分钟；分钟；(6)离心离心(8001000转分转分)计数、备用。计数、备用。第17页
9、，此课件共34页哦（四）细胞准备（四）细胞准备（1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次（次（37），），计数活力细胞（不少于计数活力细胞（不少于90）；）；（2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次（次（37），），并计细胞数和测定活力细胞；并计细胞数和测定活力细胞；（3）按）按1：5或或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心 弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。第18页，此课件共34页哦（五）细胞融合（五）细胞融合(1)将1mL40的PEG液一滴滴加入列细胞
10、团中，在60秒内加完，同时并不断轻微 转动离心管或用手指轻弹离心管；(2)在不断转动离心管中加1mL无血清培养液，60秒钟内加完；(3)于5分钟内慢慢加完20mL无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，(4)离心(800转分，8分钟)，去上清，用完全培养液10mL悬浮，轻轻混匀；(5)取96孔板，每孔加50L；(6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5CO2，温箱中37培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。第19页，此课件共34页哦（六）融合后细胞培养（六）融合后细胞培养1、融合后710天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半 新的)后每隔23天半量换液一次；2、
11、两周后可改用HAT培养液半量换液，或仍用HAT培养液；3、23周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明；4、待集落增殖生长至13孔时，应进行抗体检测。第20页，此课件共34页哦 杂交瘤技术的关键是如何筛选杂交瘤细胞，使用HAT选择性培养基解决了此技术问题。HAT：H (hypoxanthin)次黄嘌呤次黄嘌呤 A (aminopterin)氨基喋呤（正常细胞氨基喋呤（正常细胞DNA合成的阻断剂）合成的阻断剂）T (thymidine)胸腺嘧啶（供旁路途径利用）胸腺嘧啶（供旁路途径利用）第21页，此课件共34页哦细胞融合、筛选和杂交瘤技术的建立细胞融合、筛选和杂交瘤技术的建立肿瘤细胞肿瘤细胞DN
12、A生物合成有两条途径：一条由糖、氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，这是主要途径。这条途径可被叶酸的拮抗物氨基喋呤(A)所阻断。但如果培养基中含核苷酸“前体“次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，即便有A存在，细胞通过另一途径(称替代途径或应急途径)也可合成核苷酸。正常细胞正常细胞嘌呤和嘧啶的生物合成途径可被氨基喋呤阻断。但细胞在提供了胸腺嘧啶和次黄嘌呤的情况下，依赖胸腺激酶(TK)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT)可合成DNA。第22页，此课件共34页哦（七）抗体检测（七）抗体检测免疫荧光试验放射免疫试验(RIA)联免疫吸附试验(ELISA)第23页，此课件共34页哦杂交瘤细胞的筛选 酶联免疫吸附试验
13、(ELISA)该法在杂交瘤细胞的筛检和单抗的鉴定中最为常用。羊抗鼠或兔抗鼠双抗体夹心ELISA能识别所有鼠源抗体。凡是分泌鼠源抗体的杂交瘤细胞均可被筛选出来，然后再通过间接ELISA或捕获ELISA或其它特异性检测方法确定目的杂交瘤细胞。间接ELISA和捕获ELISA能识别与抗原相对应的特异性抗体。一般用于分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的筛选和单抗特异性鉴定。其中捕获ELISA，由于首先用多抗致敏酶标反应板，增强板对抗原的结合能力，因此一般来说它比间接ELISA更稳定和敏感。液相ELISA由于抗原和抗体在液相中反应，抗原保持自然构型，所有表位处于完好状态，并可与抗体进行全方位反应，其结果与中和反应
14、较为一致，适于中和单抗的筛选和病毒抗原表位分析。第24页，此课件共34页哦 (2)免疫酶组化法主要用于检测针对细胞抗原成分的单抗或细胞上病毒抗原成分的单抗。常用间接免疫过氧化物酶试验(IIP)或碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术(APAAP)，镜检判定结果。(3)免疫荧光技术与免疫组化法相似，主要用于各种细胞抗原成分和感染细胞中病毒抗原成分的检测，具有操作简便、敏感，可对抗原成分直观定位等优点，常用于单抗的筛选和鉴定。凡检测针对细胞内成分的单抗，将细胞片经-20冷丙酮固定后作荧光染色；而检测针对细胞内成分的单抗，则用活细胞作膜荧光染色。(4)放射免疫测定在筛选和鉴定单抗时常用固相抗原法，其反
15、应原理与ELISA相似，所不同的是用放射性同位素(如125I)标记的羊或兔抗鼠抗体代替酶标抗体作指示系统。由于同位素半衰期的限制，操作和同位素污染对人的危害以及废物处理的困难，一般实验室很少采用。(5)间接血凝试验(PHA)该法快速、简便、较为敏感、影响因素少，易掌握，也常应用于单抗的筛检。但因敏感性和反应范围的限制，不如ELISA应用广。第25页，此课件共34页哦杂交瘤细胞的克隆化 融合后必须对阳性孔中杂交瘤细胞进行克隆化，其原因是：融合后阳性孔中的杂交瘤细胞不一定都是目的细胞；一些初生杂交瘤细胞是不稳定的，可能丢失染色体，丧 失产生抗体能力，需不断清除变异细胞；在液氮中长期保存的杂交瘤细胞
16、也有丧失分泌抗体的可 能。所有这些情况说明，需对杂交瘤细胞进行连续克隆化，以纯化目的细胞。第26页，此课件共34页哦（八）单克隆抗体的大量制备（八）单克隆抗体的大量制备体内法体内法培养法培养法第27页，此课件共34页哦杂交瘤技术操作中应注意的主要问题 (1)对所用的骨髓瘤细胞的使用历史要清楚，即一定是没有污染的曾获得高融合率的可靠细胞。融合时，骨髓瘤细胞要处于最佳生长状态。(2)用于融合的主要试剂，如聚乙二醇(PEG)、胸腺密啶核苷(T)、次黄嘌呤和小牛血清的质量要可靠、特别是小牛血清和PEG，就是同一厂家不同批次产品的质量差异也影响融合和培养效果。在实验室中一定要贮备经过融合考验的主要试剂。
17、对每批小牛血清都要作细胞生长试验。第28页，此课件共34页哦 (3)配液用的水质好坏也是一个重要问题。一般来说，无离子水再经双蒸或三蒸水用于配制各种液体是没有什么问题的。(4)在进行杂交瘤试验之前，要调好培养箱温、CO2浓度，使其稳定，并保持饱和湿度。(5)严格无菌操作对搞好杂交瘤技术是至关重要的。一切用于培养的液体均需十分可靠。各种培养液的包装尽量要小。同一包装的液体最好一次用完，不能多次重复使用。每次使用的剩余液体要放在30温箱菌检。第29页，此课件共34页哦四、单克隆抗体的应用四、单克隆抗体的应用单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏
18、性，可以广泛地由于临床医学的 疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性。疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性。利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产 成本，同时也增加了疫苗的安全性。成本，同时也增加了疫苗的安全性。单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望 的潜在技术。的潜在技术。单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学 的不断发展。的不断发展。第30页，此课件共34页
19、哦单克隆抗体技术的发展1.在融合技术上除用聚乙二醇融合剂外，发展了电融合、激光融合和定向融合技术 2.发展了异源和非鼠源杂交瘤用小鼠骨髓瘤细胞与其它动物(如兔、牛、猪、绵羊等)脾细胞融合，获得异源杂交瘤。但融合率低，稳定性差。3.发展了双特异性抗体这是两种分泌不同单抗的杂交瘤细胞间融合产生的杂交的杂交瘤。其方法是先研制对HAT敏感的亲本杂交瘤细胞，然后与另一杂交瘤细胞融合，筛选。筛选出的杂交瘤分泌的单抗为双特异性。第31页，此课件共34页哦4.发展了嵌合抗体、重构抗体和小分子抗体嵌合抗体是应用重组DNA技术对抗体基因进行置换，从而改变原来抗体性质。重构抗体是将小鼠单抗中与抗原决定簇互补的结构，
20、即互补性决定区(CDR)基因取代人抗体可变区的CDR基因，表达具有小鼠单抗特异性的人源抗体。抗体基因工程可按人的需要构建新的抗体分子，将从根本上改变依靠免疫获得抗体的状况。第32页，此课件共34页哦 六、单抗研究进展及其应用 单抗制备技术的改进：选择弱免疫原载体，选择弱免疫原载体，采用脾内免疫、腹腔植入、淋巴结注射和足垫注射，采用脾内免疫、腹腔植入、淋巴结注射和足垫注射，使用使用EB病毒、仙台病毒、病毒、仙台病毒、PEG、电和激光等介导细胞融合，、电和激光等介导细胞融合，用细菌、噬菌体等构建组合抗体文库，快速、大量生产抗体，用细菌、噬菌体等构建组合抗体文库，快速、大量生产抗体，在基因水平改造抗体，如在基因水平改造抗体，如嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体等。等。用功能性分子取代抗体的部分片段，获得抗体酶、抗体病毒、抗体超用功能性分子取代抗体的部分片段，获得抗体酶、抗体病毒、抗体超抗原和抗体生物毒素等。抗原和抗体生物毒素等。第33页，此课件共34页哦据不完全统计，国内已成功地研制出300多种单抗，主要是体外诊断试剂，部分已商品化和初步产业化。美国的许多生物技术公司以生产单抗诊断试剂为主，到2001年10月，商品化的单抗诊断试剂盒已有数百种之多，其中用于临床治疗的体内单抗就有11个。第34页，此课件共34页哦