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1、艾滋病的脂质筏结构课件展示现在学习的是第1页，共22页背景介绍n n薄膜病毒的脂类在病毒形态发生和传染性上起到关键角色。他们来自病毒出芽的宿主细胞膜,但是明确的脂质成分没有被确定为任何病毒。采用质谱法,本研究提供了一个定量分析脂质成分的艾滋病毒和一个全面的与宿主细胞膜比较的方案。现在学习的是第2页，共22页简介：n n脂质成分的艾滋病病毒膜，像洗涤剂耐药,是明显不同于宿主细胞膜。这个成分,为艾滋病毒脂质体关于在活细胞存在脂质筏提供了强有力的证据。现在学习的是第3页，共22页1、LBPA是一种圆锥形的磷脂，这已被证明。在晚期核内体，不能被大量的分光术测定。因为它不能与其同分异构体磷脂酰甘油明确的
2、区分开来。2、鞘磷脂类和胆固醇的富集是DRM的特征。DRM的另一个标志是像酰胆碱之类的饱和脂类的富集。3、饱和的酰胆碱由在细胞膜中占18%增加到在病毒中占41%.4、在SM中未观察到饱和脂HIV肪酸链的增长有明显变化。5、在HIV-1细胞中有大量的DHSM（双氢链霉菌）富集。现在学习的是第4页，共22页6、在HIV-1中，我们发现有一种不同寻常的鞘脂类DHSM富集，和SM相反，在DHSM的鞘氨醇链上没有4.5反式双链。现在学习的是第5页，共22页7、在病毒和细胞膜中主要的SM和DHSM是SM d18:1/16:0和DHSM d18:0/16:0,它们都包含氢胺化合物连接的十六酰基。现在学习的是
3、第6页，共22页SM和DHSM样品的定量是利用灵敏+PREC184扫描进行试验的n n脂质产生的乙酰胆碱片段离子在相对丰度上没有差异，这种脂质包含鞘氨醇或鞘氨醇骨架，胁迫SM样本因此可用来对脂质定量。现在学习的是第7页，共22页n n与细胞膜相比，SM和DHSM的主要样本都高度富含病毒。在HIV-1(0.12 比 0.95)中，16:0_PC 的摩尔比率增加了近8倍，而DHSM 16:0_PC的摩尔比率由于一个因素增加了15倍（0.028比 0.41），因此，HIV-1中SM的二氢样品平均值比SM高，而Npalmitoyl-DHSM分子单独包含约10%HIV-1磷脂总量，我们同时确定二氢氨基化
4、合物作为一个DHSM潜在的前体，和dihydromonohexosylceramide一样，但由于相对片段离子产量低，不能进行定量。现在学习的是第8页，共22页n nDHSM尚未作为HIV-1的元件被报道，因此，HIV-1膜中的鞘氨醇类的数据不可用并不奇怪。至今，DHSM被描述为一个仅在人晶体 抽提物中的主要连续生物细胞膜，它包含了全部磷脂的50%。DHSM的功能目前还不知道。眼晶体富含胆固醇的细胞膜中的DHSM被认为在阻遏氧化和形成胆固醇晶体中起作用。对脂质体和酰基链匹配SM和DHSM比较的生物物理研究已经发现DHSM导致在较高的溶解温度下更多有序膜形成，这是由于它极性小的特性。基于这些结果
5、，DHSM被认为在侧方浓缩有序液体膜区域具有膜组织者的功能，例如脂筏。现在学习的是第9页，共22页n n所以，在SM和富含胆固醇的HIV-1膜的量高可能影响到胞外病毒膜的有序和物理稳定，也可能对阻遏氧化起作用。可以确定的是，富含HIV-1的pl-PE，可能对这种阻碍起作用，如已经讨论了的缩醛磷脂抗氧化作用。现在学习的是第10页，共22页抑制鞘磷脂的生物合成可减小HIV-1的感染性n n之前的研究已经报道了在产HIV-1细胞或从细胞或病毒膜的胆固醇抽提物中对胆固醇的生化合成的抑制可导致病毒复制和感染的降低。为了测试鞘磷脂是否在HIV-1形成和感染有决定性作用，我们用烟曲霉毒素B1处理感染的MT-
6、4细胞。FB1阻断了鞘磷脂的重新合成，(阻碍dihydroceramide的合成,它是所有鞘磷脂的前体)，还有回收途径。FB1处理的细胞中纯化的HIV-1和PC相比表现出明显的减小率，和预期的抑制剂效果一致。减小了19%(Cer)，30%(SMs)和 54%(HC)，不同鞘氨醇被分别观察到。现在学习的是第11页，共22页鞘氨醇的减少（在细胞膜也观察到了，没有显示数据）对病毒的释放没有明显影响在HIV-1感染中一个很强的影响被观察到，无论如何，F相比未处理的细胞，B1处理的细胞释放的HIV-1感染性是可再生的4倍。现在学习的是第12页，共22页n所以，HIV-1膜中鞘氨醇的浓度对维持病毒感染表现
7、出重要性，但不仅仅是对病毒生长必要的。我们的结果表明生物膜的脂质组分的改变可能不仅局限在一个狭小的范围，因为病毒鞘氨醇的部分减小导致HIV-1感染率明显降低。关于脂质组分细微的改变导致明显功能的变化的结论之前已在囊泡运输过程研究中被提出。接下来的实验将关注于鞘氨醇及其衍生物脂质与HIV-1感染相关损失的特有脂质，和决定他们机制的活动。我们的FB1结果脂质活性药物在膜组成上有敏感的改变作用表明有潜力成为一种抗HIV的有效治疗试剂。现在学习的是第13页，共22页未处理的HIV-1膜和DRM脂质n n我们对HIV-1脂质成分的分析生成一个与先前DRM类似报道的图。因此，我们对MT-4MT-4细胞中的
8、HIV-1 and DRM进行了直接比较。DRM使用洗涤剂 Triton X-100和 Brij 96准备好，与他们的溶解特异蛋白和脂质不同的能力，Triton X-100 更严格。片段经过等差密度梯度离心用来分析有关DRM标记的flotillin和铁转运蛋白受体的贡献，与DRM没有联系(图.4a)。现在学习的是第14页，共22页n n在在Triton X-100Triton X-100抽提物中，抽提物中，FlotillinFlotillin受到受到FlotillinFlotillin限制。而在梯度底部限制。而在梯度底部找到了铁传递蛋白受体找到了铁传递蛋白受体(片段片段7 7 9)9)，因此定
9、义片段，因此定义片段2 2为为DRMDRM片段。片段。Brij96Brij96不是特别严格，对不是特别严格，对flotillinflotillin和铁传递蛋白受体的有一个较和铁传递蛋白受体的有一个较广的贡献。图广的贡献。图4 4显示显示SMs_PCSMs_PC在在DRMDRM中中Triton X-100Triton X-100和和 Brij96Brij96处理处理的细胞显著增加（相比细胞中脂质），并且和未处理的细胞显著增加（相比细胞中脂质），并且和未处理HIV-1HIV-1脂质是相脂质是相似的。似的。现在学习的是第15页，共22页A图：鞘磷脂,二氢鞘磷脂,磷脂酰胆碱（PC）在病毒膜和抗去垢剂膜
10、是由纳米电喷雾电离串联质光谱法而形成的蛋白质免疫印迹。(一)抗去垢剂膜从冷萃取的hiv-1感染带有Tritonx 100（上)或96(低)MT-4的细胞中分析得到有筏(flotillin 1)和无筏(转铁蛋白受体)标记分布。现在学习的是第16页，共22页B图：鞘磷脂比磷脂酰胆碱在所有细胞膜中的比率 C图：SM与dhsm比PC在hiv与drm 里的比率 D图：从感染的MT-4细胞里分离出的（1条带），从受感染细胞分离出的DRM（2-4），纯净HIV（5-7）用蛋白质免疫印迹分析检测flotillin 和gp41。根据细胞编号，所获得的细胞提取的数目是正常的。现在学习的是第17页，共22页HIV-
11、1的脂质成分观察报告 与脂质微观（筏）猜测相似在与脂质微观（筏）猜测相似在五个方面：五个方面：1.PC(1.PC(富含饱和脂肪富含饱和脂肪)2.PS2.PS（聚苯乙烯）（聚苯乙烯）3.PL-PE3.PL-PE（聚乙烯）（聚乙烯）4.SM(4.SM(胆固醇胆固醇)5.DHSM(5.DHSM(鞘脂类鞘脂类)支撑的假设：支撑的假设：HIV-1的病毒芽来自细胞的微薄膜。的病毒芽来自细胞的微薄膜。现在学习的是第18页，共22页表格2：HIV-1病毒的脂质成分n n平均每分子脂质含病毒粒子平均每分子脂质含病毒粒子n nPC(PC(聚碳酸酯聚碳酸酯)26,000)26,000n nSMSM（苯乙烯）（苯乙烯
12、）37,00037,000n nDHSMDHSM（双清链霉素）（双清链霉素）17,00017,000n nPEPE（聚乙烯）（聚乙烯）13,00013,000n npl-PE 44,000pl-PE 44,000n nPSPS（聚苯乙烯）（聚苯乙烯）25,00025,000n nCholChol（胆固醇）（胆固醇）134,000134,000n nCerCer（神经酰胺）（神经酰胺）160160n nHC 600HC 600现在学习的是第19页，共22页材料和方法1.1.FB1（纤维蛋白原）和Brij 96（聚氧乙烯脂肪醇醚96）2.2.溶血神经鞘氨脂 3.3.转移磷脂酰和SM（苯乙烯）4.4
13、.脂肪酸和Triton X-100 现在学习的是第20页，共22页细胞培养和病毒分离纯化细胞培养和病毒分离纯化细胞培养和病毒分离纯化细胞培养和病毒分离纯化 MT-4细胞（31）保持在37和5CO2在RPMI 1640培养基中添加10热灭活的FCS，抗生素4ml谷氨酰胺5mmCO2细胞感染HIV-1毒株NL4-3（32）病毒在受感染的细胞共同培养，并收获前未受感染的细胞病变效应观察现在学习的是第21页，共22页HIV-1释放的定释放的定量分析量分析n n病毒释放通过感染的酶联免疫吸附上清液获得MT-4细胞检测HIV-1衣壳蛋白p24来定量。n n定量的Western blot分析使用Odyssey LI-COR的红外成像系统。现在学习的是第22页，共22页