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1、 流流式式细细胞胞术术(flow(flow cytometry cytometry FCM)FCM)是是利利用用流流式式细细胞胞仪仪对对单单个个生生物物颗颗粒粒(红红细细胞胞、白白细细胞胞、各各类类组组织织细细胞胞、血血小小板板、微微生生物物等等)以以及及人人工工合合成成微微球球的的物物理理和和生生物物学学特特性性进进行行多多参参数数定定量量分分析析，并并能能对对特特定定细细胞胞群体加以分选的分析技术。群体加以分选的分析技术。流式细胞术的概念第1页/共45页FCM的工作原理流式细胞仪组成：1.液流系统2.光学系统3.数据处理系统第2页/共45页1.液流系统：液流系统：由样本和鞘液组成。由样本和
2、鞘液组成。由样本和鞘液组成。由样本和鞘液组成。待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的料标记的料标记的料标记的McAbMcAb染色后置入样品管中，在清洁染色后置入样品管中，在清洁染色后置入样品管中，在清洁染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流。在鞘液气体压力下进入流动室形成样本流。在鞘液气体压力下进入流动室形成样本流。在鞘液气体压力下进入流动室形成样本流。在鞘液 (sheath)(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成的约束下，通过喷嘴，使其形成
3、的约束下，通过喷嘴，使其形成的约束下，通过喷嘴，使其形成单细单细单细单细胞液柱胞液柱胞液柱胞液柱。第3页/共45页Flow CellInjector TipFluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeamSheath fluid第4页/共45页鞘液：辅助样本流能被正常检测的基质液作用：1.包裹在样本流的周围，使其处于喷嘴中心，以保证检测的精确性；2.防止样本流中的细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。第5页/共45页2.光学系统：由激发光源、分光镜、光束成形器等由激发光源、分光镜、光束成形器等组成。组成。激光是
4、较常用的光源激光是较常用的光源,稳定性好、单色性好。稳定性好、单色性好。检测信号：检测信号：散射光和荧光信号散射光和荧光信号被收集、处理、转化为数字信号。被收集、处理、转化为数字信号。第6页/共45页Injector TipFluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeamSheath fluid第7页/共45页FCM检测信号散射光信号 前向散射光（foword scatter,FS）：在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。反映细胞颗粒的大小。侧向散射光（sid
5、e scatter，SS）：与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。反映颗粒的内部结构复杂程度、表面的光滑程度。荧光信号 (反映被染上荧光的细胞数量多少）第8页/共45页第9页/共45页第10页/共45页第11页/共45页第12页/共45页荧光信号每种荧光染料都有特定的激发波长，受激光激发后会产生特定波长的荧光和颜色，如绿色、红色、黄色等。流式细胞仪就是利用不同波长的光学滤片来检测这些特定发射波长的光学信号。荧光信号反映被染上荧光的细胞数量多少。第13页/共45页第14页/共45页3.数据处理系统：主要由计算机及其软件组成。主要
6、由计算机及其软件组成。通过通过检测散射光及荧光信号检测散射光及荧光信号对实验数据进行分析对实验数据进行分析存储、显示。存储、显示。具有智能化、自动化特点。具有智能化、自动化特点。第15页/共45页第16页/共45页免疫荧光标记直接免疫荧光染色法：选用荧光标记的McAb是直接针对细胞表面抗原特异性标志的单一抗体,如抗CD3-FITC抗体、抗CD4-PE抗体、抗CD8-PeCy5抗体。间接免疫荧光染色法：选用特异性McAb与相应抗原结合后，再用荧光素标记的第二抗体进行染色。双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信号。检测时需注意荧光补偿。第17页/共45页常
7、用免疫荧光染料组合第18页/共45页第19页/共45页荧光补偿：每两种荧光信号间不可避免会出现重叠现象，重叠区越大，信号检测的准确性就越差，因此需计算机工作软件进行自动跟踪调节补偿。第20页/共45页 流式细胞仪的基本功能流式细胞仪的基本功能细胞表型分析细胞表型分析细胞表型分析细胞表型分析(包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析分析分析分析DNADNA含量及细胞周期分析：含量及细胞周期分析：含量及细胞周期分析：含量及细胞周期分析：DNA content analysisDNA cont
8、ent analysis，如，如，如，如细胞凋亡检测细胞凋亡检测细胞凋亡检测细胞凋亡检测细胞分选细胞分选细胞分选细胞分选 cell sortingcell sorting自自自自身身身身免免免免疫疫疫疫性性性性疾疾疾疾病病病病相相相相关关关关HLAHLA抗抗抗抗原原原原分分分分析析析析、自自自自身身身身抗抗抗抗体体体体的的的的检检检检测测测测：如用如用如用如用Hep-2Hep-2细胞检测抗核抗体。细胞检测抗核抗体。细胞检测抗核抗体。细胞检测抗核抗体。第21页/共45页 临床免疫学临床免疫学临床免疫学临床免疫学 临床血液学临床血液学临床血液学临床血液学 临床肿瘤学临床肿瘤学临床肿瘤学临床肿瘤学
9、血栓与止血血栓与止血血栓与止血血栓与止血 骨髓和器官移植骨髓和器官移植骨髓和器官移植骨髓和器官移植 基础医学研究基础医学研究基础医学研究基础医学研究流式细胞术的临床应用第22页/共45页 FCMFCM在临床免疫学中的应用在临床免疫学中的应用(1)(1)淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 T T T T细胞：细胞：细胞：细胞：CD3CD3+CD4 CD4+(Th)(Th)CD8 CD8+(Ts/Tc)(Ts/Tc)B B B B细胞：细胞：细胞：细胞：CD19CD19+NK NK NK NK细胞：细胞：细胞：细胞：CD3CD3-CD16CD16+CD56CD56+第
10、23页/共45页(2)(2)淋巴细胞亚群细分淋巴细胞亚群细分淋巴细胞亚群细分淋巴细胞亚群细分 T T T T细胞：细胞：细胞：细胞：TsTs：CD8CD8+CD28 CD28-Tc Tc：CD8CD8+CD28 CD28+Th Th：CD4CD4+CD29 CD29+B B B B细胞：细胞：细胞：细胞：B1B1：CD5CD5+CD19 CD19-B2 B2：CD5 CD5+CD19 CD19+第24页/共45页根据根据T T淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将CD4+CD4+、CD8+CD8+分为分为 CD4+:Th1:CD4+IFN-r+Th2:CD4+IL4+
11、Th0:CD4+IFN-r+IL4+CD8+:Tc1:CD8+IFN-r+Tc2:CD8+IL4+Tc0:CD8+IFN-r+IL4+第25页/共45页辅助性辅助性T T细胞亚群的生物学功能及临床意义细胞亚群的生物学功能及临床意义Th1Th1细胞：细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。Th2Th2细胞细胞 ：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞
12、增多症。第26页/共45页(3)(3)活化淋巴细胞亚群活化淋巴细胞亚群活化淋巴细胞亚群活化淋巴细胞亚群 活活活活化化化化总总总总T T细细细细胞胞胞胞：CD3CD3+/HLA/HLADRDR+静静静静止止止止总总总总T T细细细细胞胞胞胞：CD3CD3+/HLA/HLADRDR-活活活活 化化化化 CD4+CD4+细细细细 胞胞胞胞：CD4CD4+/HLA/HLADRDR+活活活活 化化化化 CD8+CD8+细细细细 胞胞胞胞：CD8CD8+/HLA/HLADRDR+活化诱导分子：活化诱导分子：活化诱导分子：活化诱导分子：CD69CD69 白白白白 细细细细 胞胞胞胞 介介介介 素素素素 2
13、2低低低低 亲亲亲亲 和和和和 力力力力 受受受受 体体体体：CD25CD25 CD25 CD25+/CD3/CD3+：活化：活化：活化：活化T T细胞细胞细胞细胞 CD25CD25-/CD3/CD3+：静止：静止：静止：静止T T细胞细胞细胞细胞第27页/共45页(4)(4)(4)(4)淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞功功功功能能能能分分分分析析析析：细细细细胞胞胞胞介介介介导导导导细细细细胞胞胞胞毒毒毒毒试试试试验验验验、细胞内细胞因子的测定细胞内细胞因子的测定细胞内细胞因子的测定细胞内细胞因子的测定 自身免疫性疾病自身免疫性疾病自身免疫性疾病自身免疫性疾病 变态反应性疾病变态反应性疾病变
14、态反应性疾病变态反应性疾病 免疫缺陷性疾病免疫缺陷性疾病免疫缺陷性疾病免疫缺陷性疾病 感染性疾病感染性疾病感染性疾病感染性疾病(病毒、细菌、寄生虫感染病毒、细菌、寄生虫感染病毒、细菌、寄生虫感染病毒、细菌、寄生虫感染)免疫治疗监测免疫治疗监测免疫治疗监测免疫治疗监测 肿瘤免疫监测肿瘤免疫监测肿瘤免疫监测肿瘤免疫监测 移植免疫监测移植免疫监测移植免疫监测移植免疫监测第28页/共45页(二二二二)FCM)FCM)FCM)FCM在临床血液学中的应用在临床血液学中的应用在临床血液学中的应用在临床血液学中的应用1.1.1.1.白血病的白血病的白血病的白血病的MICMICMICMIC分型分型分型分型 Mo
15、rphologyMorphologyMorphologyMorphology（形态学）（形态学）（形态学）（形态学）ImmunologyImmunologyImmunologyImmunology（免疫学）（免疫学）（免疫学）（免疫学）CytogeneticsCytogeneticsCytogeneticsCytogenetics（细胞遗传学）（细胞遗传学）（细胞遗传学）（细胞遗传学）白白白白血血血血病病病病分分分分型型型型是是是是选选选选择择择择化化化化疗疗疗疗方方方方案案案案和和和和判判判判断断断断预预预预后后后后的的的的重重重重要要要要依依依依据据据据。白白白白血血血血病病病病免免免免疫
16、疫疫疫分分分分型型型型是是是是MICMICMICMIC分分分分型型型型的的的的重重重重要要要要组组组组成成成成部部部部分分分分，也也也也是是是是对对对对FABFABFABFAB分分分分型型型型的的的的补补补补充充充充，对对对对白白白白血血血血病病病病的的的的诊诊诊诊断断断断、治治治治疗疗疗疗策策策策略略略略制制制制定定定定、预预预预后后后后判判判判断断断断及及及及对白血病发病机制的研究都具有重要作用。对白血病发病机制的研究都具有重要作用。对白血病发病机制的研究都具有重要作用。对白血病发病机制的研究都具有重要作用。第29页/共45页免疫分型的临床意义 弥补弥补FABFAB分型的不足分型的不足 诊
17、断其他血液系统肿瘤诊断其他血液系统肿瘤 诊诊断断仅仅表表达达个个别别非非本本系系列列相相关关抗抗原原的的急急性性 白白血血病病（LYLY+AMLAML、MYMY+ALLALL）急性双系或双表型白血病的诊断急性双系或双表型白血病的诊断 骨骨髓髓增增生生异异常常综综合合征征（MDSMDS）免免疫疫表表型型分分析析的的临临床床意义意义 免免疫疫分分型型对对鉴鉴别别慢慢性性淋淋巴巴细细胞胞增增生生性性疾疾病病各各亚亚型型亦亦有肯定的诊断价值有肯定的诊断价值第30页/共45页以下为各系列较特别的标志：以下为各系列较特别的标志：AML：MPO、CD33、CDl3、CDl4 CDl5、CDllb、CDllc
18、 T-ALL：cmCD3、CD2、CD5、CD7、CD4CD8、CD38 B-ALL：cCD22、cCD79、CDl9、CDl0、CD24、HLADR、CD20、CD38 造血干祖细胞造血干祖细胞:CD34、CDll7、CD38、HLA-DR、ACl33第31页/共45页在在AMLAML各亚型的免疫分型中有时仍较难分辨，有以各亚型的免疫分型中有时仍较难分辨，有以下特点可供参考：下特点可供参考：CD41CD41、CD61CD61是是巨巨核核细细胞胞的的标标志志，见见于于FABFABM7M7，但但 血血小小板板粘粘附附于于某某细细胞胞上上可造成假阳性。可造成假阳性。CD71CD71与血型糖蛋白是红
19、系的标志，见于与血型糖蛋白是红系的标志，见于FABFABM6M6型。型。CDl4CDl4、CD64CD64是单核细胞的标志，见于是单核细胞的标志，见于M4M4或或M5M5。FABFABM3M3，t(15t(15；17)17)者者典典型型的的免免疫疫表表型型是是CDl3+CDl3+、CD33+CD33+、CD9+CD9+、CD38+CD38+、CD34-CD34-、DR-DR-。t(8t(8；21)21)M2M2的表型为的表型为 CDl3+CDl3+、DR+DR+、CD34+CD34+、CD33+CD33+、CDl5+CDl5+、CDl9+CDl9+或或CD56+CD56+。M0M0与与M1M1
20、较较难难区区分分，应应有有髓髓系系标标志志而而无无淋淋系系标标志志，胞胞浆浆MPOMPO应应阴阴性性。CD34CD34及及DRDR在在M0M0较较强强，并可伴有并可伴有CD7CD7与与CD4CD4。第32页/共45页 CDll7+CDll7+多见于多见于AMLAML。CD7CD7常常与与CD34CD34共共表表达达，CD4CD4见见于于M4M4、M5M5。CD2+CD2+见见于于M4EoM4Eo，往往往往伴伴有有1616号号染染色色体体异异常常。M3M3亦亦可可有有 CD56+CD56+表表达达。正正常常粒粒细细跑跑可可表表达达 CDl0CDl0。由由此此可可见见，单单抗抗本本身身有有其其多多
21、向向性，勿轻易判断为杂合型白血病。性，勿轻易判断为杂合型白血病。T TB BALLALL可可分分为为几几个个亚亚型型，然然而而对对临临床床价价值值不不大大。但但若若B BALLALL伴伴有有CD34CD34表表达达时时，应应进进一一步步作作遗遗传传学学与与基基因因检检测测，以以确确定定是是否否是是Ph+ALLPh+ALL，不不论论是是M Mbcl/ablbcl/abl或或m-bcrm-bcrablmRNAablmRNA阳阳性性者者，其其预预后后均均较较差差，应应接接受受大大剂剂量量化化疗疗或或早早期接受异基因骨髓移植。期接受异基因骨髓移植。第33页/共45页FCMFCM检测白血病微小残留病变检
22、测白血病微小残留病变(MRD):(MRD):过过去去认认为为 FCMFCM测测定定残残存存白白血血病病细细胞胞不不可可靠靠，因因为为现现用用的的 McAbMcAb不不能能鉴鉴别别正正常常血血细细胞胞与与白白血血病病细细胞胞。虽虽然然至至今今尚尚未未发发现现白白血血病病细细胞胞特特异异抗抗原原，但但近近来来有有人人提提出出根根据据白白血血病病细细胞胞的的以以下下特特征征，FCMFCM检测的敏感度可明显提高检测的敏感度可明显提高第34页/共45页白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应的正常血细胞的正常血细胞 如小儿如小儿ALLALL，其，其CDl0CDl0+细
23、胞的荧光强度可高细胞的荧光强度可高达达3-43-4个对数值，而其个对数值，而其 CD45CD45则为弱阳性或阴则为弱阳性或阴性。性。相应正常细胞相应正常细胞 CDl0CDl0+的细胞荧光强度约为的细胞荧光强度约为2 2个个对数值，对数值，CD45CD45为阳性。若能定量则更可靠。为阳性。若能定量则更可靠。第35页/共45页 FCM FCM FCM FCM在临床肿瘤学中的应用在临床肿瘤学中的应用在临床肿瘤学中的应用在临床肿瘤学中的应用1.1.1.1.血液标本的检查血液标本的检查血液标本的检查血液标本的检查 肿瘤患者的免疫功能检查肿瘤患者的免疫功能检查肿瘤患者的免疫功能检查肿瘤患者的免疫功能检查
24、肿瘤患者的粘附分子检查肿瘤患者的粘附分子检查肿瘤患者的粘附分子检查肿瘤患者的粘附分子检查ICAM-1 CD54ICAM-1 CD54ICAM-1 CD54ICAM-1 CD54ICAM-2 CD102ICAM-2 CD102ICAM-2 CD102ICAM-2 CD102ICAM-3 CD106ICAM-3 CD106ICAM-3 CD106ICAM-3 CD106CD62CD62CD62CD62、CD63CD63CD63CD63、CD42a/bCD42a/bCD42a/bCD42a/b、CD41/61CD41/61CD41/61CD41/61、TSPTSPTSPTSP第36页/共45页(2)
25、(2)(2)(2)肿瘤实体标本的肿瘤实体标本的肿瘤实体标本的肿瘤实体标本的FCMFCMFCMFCM检查检查检查检查 耐药基因检查耐药基因检查耐药基因检查耐药基因检查 粘附分子检查粘附分子检查粘附分子检查粘附分子检查 细胞凋亡检查细胞凋亡检查细胞凋亡检查细胞凋亡检查 细胞细胞细胞细胞DNADNADNADNA分析分析分析分析 增殖性核抗原增殖性核抗原增殖性核抗原增殖性核抗原 肿瘤细胞耐药性筛选肿瘤细胞耐药性筛选肿瘤细胞耐药性筛选肿瘤细胞耐药性筛选 肿瘤相关抗原肿瘤相关抗原肿瘤相关抗原肿瘤相关抗原 激素受体激素受体激素受体激素受体 与与与与癌癌癌癌细细细细胞胞胞胞生生生生物物物物行行行行为为为为有有
26、有有关关关关的的的的因因因因子子子子，如如如如CD44CD44CD44CD44第37页/共45页组织标本的正确处理：组织标本的正确处理：去除脂肪、结缔组织去除脂肪、结缔组织 洗涤除去红细胞洗涤除去红细胞 用眼科剪剪成肉糜状用眼科剪剪成肉糜状 用用250250至至350350目的铜网过滤目的铜网过滤要求：细胞碎片、细胞连片少，单细胞要多细胞碎片、细胞连片少，单细胞要多第38页/共45页 利利利利用用用用特特特特殊殊殊殊的的的的荧荧荧荧光光光光染染染染料料料料(PI(PI(PI(PI、EBEBEBEB、AOAOAOAO等等等等)与与与与细细细细胞胞胞胞内内内内DNADNADNADNA碱碱碱碱基基基
27、基结结结结合合合合，被被被被这这这这些些些些荧荧荧荧光光光光染染染染料料料料染染染染色色色色的的的的细细细细胞胞胞胞在在在在激激激激光光光光照照照照射射射射下下下下发发发发射射射射出出出出荧荧荧荧光光光光，荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度与与与与DNADNADNADNA含含含含量量量量成成成成正正正正比比比比。流流流流式式式式细细细细胞胞胞胞仪仪仪仪通通通通过过过过测测测测定定定定细细细细胞胞胞胞的的的的荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度推推推推算算算算出出出出细细细细胞胞胞胞的的的的DNADNADNADNA含量。含量。含量。含量。细胞DNA分析原理第39页/共45页细胞周期与DNA的倍体关系第
28、40页/共45页DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指标:良性肿瘤和正常组织良性增生不出现良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNADNA非非2 2倍体细胞倍体细胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；实体瘤以多倍体居多；实体瘤以多倍体居多；实体恶性肿瘤的非实体恶性肿瘤的非2 2倍体出现率倍体出现率70%,70%,淋巴瘤和白血病淋巴瘤和白血病以亚二倍体居多以亚二倍体居多,出现率达出现率达50%50%。交界性肿瘤形态学介于良恶性之间交界性肿瘤形态学介于良恶性之间,难于监别。如果交难于监别。如果交界性肿瘤出现异倍体即已具有恶性特征界性肿瘤出现异倍体即已具有恶性特征,尽管
29、病理形尽管病理形态学尚不能证实态学尚不能证实,也应视为恶性。也应视为恶性。第41页/共45页观察病情演变观察病情演变判断预后判断预后 非整倍体的肿瘤恶性程度高，复发率高，预后差。非整倍体的肿瘤恶性程度高，复发率高，预后差。近二倍体和二倍体肿瘤近二倍体和二倍体肿瘤 :预后好。预后好。但少数肿瘤的但少数肿瘤的DNADNA分析对预后无判断价值。分析对预后无判断价值。S S期期细细胞胞比比例例的的评评估估对对肿肿瘤瘤恶恶性性程程度度和和预预后后有有意意义义,高高S S期期肿瘤一般比低肿瘤一般比低S S期对化疗敏感。期对化疗敏感。第42页/共45页DNA的倍体和DNA指数的关系DI=DI=样品样品样品样品G G G G0/10/10/10/1细胞峰均道值细胞峰均道值细胞峰均道值细胞峰均道值正常二倍体标准细胞正常二倍体标准细胞正常二倍体标准细胞正常二倍体标准细胞G G G G0/10/10/10/1期细胞均道值期细胞均道值期细胞均道值期细胞均道值第43页/共45页 辅助诊断肿瘤辅助诊断肿瘤 估计肿瘤的预后估计肿瘤的预后 监测疗效监测疗效细胞DNA分析的临床意义第44页/共45页感谢您的观看！第45页/共45页