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1、第五章氨基酸蛋白质提取工艺特性现在学习的是第1页，共29页一、氨基酸的特性l因氨基酸分子较小，且有羧基、氨基，同时具有碱性因氨基酸分子较小，且有羧基、氨基，同时具有碱性和酸性极性基团较多，所以和酸性极性基团较多，所以它的极性较大，能溶于水，它的极性较大，能溶于水，不溶于有机溶剂。不溶于有机溶剂。因同时具有羧基和氨基，有酸碱两性的性因同时具有羧基和氨基，有酸碱两性的性质，能与酸和碱形成不同的盐。当溶液的质，能与酸和碱形成不同的盐。当溶液的pH发生变化时，发生变化时，溶液中的离子状态也发生了变化。在电场中酸性溶液溶液中的离子状态也发生了变化。在电场中酸性溶液的氨基酸则向阴极电泳，而在碱性溶液中则向
2、阳极电的氨基酸则向阴极电泳，而在碱性溶液中则向阳极电泳，当溶液的泳，当溶液的pH值达一定时，氨基酸不向任何电极移动，值达一定时，氨基酸不向任何电极移动，此时溶液的此时溶液的pH值就是该氨基酸的等电点。不同的氨基酸有值就是该氨基酸的等电点。不同的氨基酸有不同的等电点，不同的等电点，在等电点时氨基酸的溶解度最低在等电点时氨基酸的溶解度最低，根据这根据这种性质可以用电泳法分离氨基酸。种性质可以用电泳法分离氨基酸。现在学习的是第2页，共29页l氨基酸在适当的条件下，能进行有机胺或有机酸的几乎氨基酸在适当的条件下，能进行有机胺或有机酸的几乎全部反应。与一般的酸和碱可生成稳定的盐，大部分均全部反应。与一般
3、的酸和碱可生成稳定的盐，大部分均能溶于水，但与重金属如铜、银、汞等制成的络合物不能溶于水，但与重金属如铜、银、汞等制成的络合物不溶于水，也可利用这种性质来分离氨基酸。溶于水，也可利用这种性质来分离氨基酸。现在学习的是第3页，共29页二、氨基酸的浸出二、氨基酸的浸出l水浸出法：水浸出法：将中草药以粉碎机粉碎，装入逆流将中草药以粉碎机粉碎，装入逆流浸出罐组的每一个浸出罐中。用水做浸出溶剂，浸出罐组的每一个浸出罐中。用水做浸出溶剂，最好在有搅拌的条件下，加热进行逆流浸出。最好在有搅拌的条件下，加热进行逆流浸出。l稀乙醇浸出法：稀乙醇浸出法：将生药粉末装入逆流渗滤浸出将生药粉末装入逆流渗滤浸出罐组的每
4、一个浸出罐中。以罐组的每一个浸出罐中。以70%乙醇进行渗滤乙醇进行渗滤浸出，先浸出的溶液浓度较大，后浸出的溶液浸出，先浸出的溶液浓度较大，后浸出的溶液浓度较低。最好采用逆流渗漉浸出法，把出液浓度较低。最好采用逆流渗漉浸出法，把出液系数控制在系数控制在5，可以得到较好的浸出效果。，可以得到较好的浸出效果。现在学习的是第4页，共29页三、氨基酸的分离三、氨基酸的分离l水浸出液或稀乙醇减压浓缩后的水溶液往往含有几种水浸出液或稀乙醇减压浓缩后的水溶液往往含有几种或十几种氨基酸，因此所得的是总氨基酸，必须进行或十几种氨基酸，因此所得的是总氨基酸，必须进行分离纯化。一般采用以下的纯化方法：分离纯化。一般采
5、用以下的纯化方法：l离子交换法离子交换法:这是分离氨基酸的常用方法。可直接将这是分离氨基酸的常用方法。可直接将水或稀乙醇提取物通过装有离子交换树脂的交换柱，水或稀乙醇提取物通过装有离子交换树脂的交换柱，带正荷的氨基酸与树脂上的带正荷的氨基酸与树脂上的-SO基吸附。由于氨基酸基吸附。由于氨基酸带的正电荷随溶液带的正电荷随溶液pH发生变化，同一氨基酸在不同发生变化，同一氨基酸在不同pH的缓冲溶液中，以及不同氨基酸在同一的缓冲溶液中，以及不同氨基酸在同一pH的环境中，的环境中，所带的正电荷各不相同，与磺酸基吸附的强弱也相应不所带的正电荷各不相同，与磺酸基吸附的强弱也相应不同。可以借助这种差别，使氨基
6、酸互相分离。同。可以借助这种差别，使氨基酸互相分离。现在学习的是第5页，共29页l成盐分离法成盐分离法:利用某些酸性氨基酸与某些金属化合利用某些酸性氨基酸与某些金属化合物，如氢氧化钡、氢氧化钙生成难溶性盐，或某碱物，如氢氧化钡、氢氧化钙生成难溶性盐，或某碱性氨基酸与一般酸生性氨基酸与一般酸生 成盐，从而与其他未成盐的成盐，从而与其他未成盐的氨基酸分离。如南瓜子中的南瓜子氨基酸是通过与氨基酸分离。如南瓜子中的南瓜子氨基酸是通过与过氯酸生成结晶性盐而分出的。过氯酸生成结晶性盐而分出的。l晶析法晶析法:利用不同氨基酸等电点不同，进行晶析结利用不同氨基酸等电点不同，进行晶析结晶分离。例如在含有亮氨酸、
7、异亮氨酸和缬氨酸的晶分离。例如在含有亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的溶液，其溶液，其pH值为值为1.52.0时，浓缩先晶析出亮氨酸，时，浓缩先晶析出亮氨酸，它的母液加盐酸后再浓缩晶析出异亮氨酸，最后母它的母液加盐酸后再浓缩晶析出异亮氨酸，最后母液中回收缬氨酸。液中回收缬氨酸。现在学习的是第6页，共29页l四、氨基酸、肽的鉴别反应四、氨基酸、肽的鉴别反应l茚三酮茚三酮(Ninhydrin)反应：反应：所有的所有的a-氨基酸及含有氨基酸及含有a-氨氨基酸的肽类和蛋白质都能和该试剂反应呈现兰色或兰基酸的肽类和蛋白质都能和该试剂反应呈现兰色或兰紫色。必要时加热，反应可在滤纸上进行。紫色。必要时加热，反应可在
8、滤纸上进行。l(2)吲哚醌吲哚醌(Isatin）试剂反应：）试剂反应：不同的氨基酸与吲哚醌试不同的氨基酸与吲哚醌试剂反应，能显示不同的颜色。由于试剂的配制方法不同，剂反应，能显示不同的颜色。由于试剂的配制方法不同，对同一种氨基酸所显示的颜色也往往有差异。吲哚醌不对同一种氨基酸所显示的颜色也往往有差异。吲哚醌不仅可用于氨基酸的显色，而且从其颜色的区别，可以帮仅可用于氨基酸的显色，而且从其颜色的区别，可以帮助辨认氨基酸。显色不稳是其特点，氨对显色无干扰。助辨认氨基酸。显色不稳是其特点，氨对显色无干扰。现在学习的是第7页，共29页第二节第二节 蛋白质提取工艺特性蛋白质提取工艺特性 l一、不同结构的蛋
9、白质及其溶解性质一、不同结构的蛋白质及其溶解性质l蛋白质按蛋白质按其功能其功能可分为可分为活性蛋白和非活性蛋白活性蛋白和非活性蛋白二类；二类；l按按结构结构又可分为又可分为简单蛋白和结合蛋白简单蛋白和结合蛋白二类：二类：l再一种分类是根据蛋白质的再一种分类是根据蛋白质的溶解度差别溶解度差别而分为水溶性而分为水溶性蛋白、醇溶性蛋白等，还有一类硬蛋白，不溶于水、蛋白、醇溶性蛋白等，还有一类硬蛋白，不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂，遇强酸、强碱水解。稀酸、稀碱和有机溶剂，遇强酸、强碱水解。现在学习的是第8页，共29页蛋蛋 白白 质质 类类 别别溶溶 解解 性性 质质简单蛋白质简单蛋白质1.白蛋白白蛋白
10、2.球蛋白球蛋白 a.真球蛋白真球蛋白 b.拟球蛋白拟球蛋白3.醇溶蛋白醇溶蛋白4.谷蛋白谷蛋白5.精蛋白精蛋白6.组蛋白组蛋白1、溶溶于于水水及及稀稀盐盐、稀稀酸酸、稀稀碱碱溶溶液液，可可被被50%饱饱和和度度硫硫酸酸铵铵析析出出。2、a.一一般般在在等等电电点点不不溶溶于于水水，但但加加入少量的盐、碱则可溶解。入少量的盐、碱则可溶解。b.溶于水，可为溶于水，可为50%的饱和度硫酸铵析出。的饱和度硫酸铵析出。3、溶于、溶于7080%乙醇中，但不溶于水及无水乙醇。乙醇中，但不溶于水及无水乙醇。4、在在等等电电点点不不溶溶于于水水，也也不不溶溶于于稀稀盐盐酸酸，易易溶溶于于稀稀酸，稀酸，稀 碱溶
11、液。碱溶液。5、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。6、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。硬蛋白质硬蛋白质不溶于水、盐、稀酸、稀碱不溶于水、盐、稀酸、稀碱结结合合蛋蛋白白质质(包包括括磷磷蛋蛋白白、粘粘蛋蛋白白、糖糖蛋蛋白白、核核蛋蛋白白、脂脂蛋蛋白白、血血红红蛋蛋白白、金金属属蛋蛋白白、黄黄素素蛋蛋白白等等)此此类类蛋蛋白白质质溶溶解解度度性性质质随随蛋蛋白白质质与与非非蛋蛋白白结结合合部部分分的的不不同同而而异异，除除脂脂蛋蛋白白外外，一一般般可可溶溶于于稀稀酸酸，稀稀碱碱及及盐盐溶溶液液中中，脂脂蛋蛋白白如如脂脂质质部部分分露
12、露于于外外，则则脂脂溶溶性性占占优优势势，如如脂脂质质部部分分被被包包围围于于分分子子之之中中，则则水水溶溶性性占优势。占优势。表表6-1 6-1 不同结构的蛋白质及其溶解性质不同结构的蛋白质及其溶解性质不同结构的蛋白质及其溶解性质不同结构的蛋白质及其溶解性质现在学习的是第9页，共29页二、蛋白质及酶的一般提取方法二、蛋白质及酶的一般提取方法l1.水溶液提取水溶液提取 凡能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱的蛋白凡能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱的蛋白质或酶，一般都可用稀盐溶液或缓冲溶液进行提取。质或酶，一般都可用稀盐溶液或缓冲溶液进行提取。稀盐溶液有利于稳定蛋白质结构和增加蛋白质溶解稀盐溶液有利于稳定蛋白质
13、结构和增加蛋白质溶解度。加入的提取液的量要适当，加入量太少提取不度。加入的提取液的量要适当，加入量太少提取不完全，加的量太多，则不利于浓缩，一般用量为原完全，加的量太多，则不利于浓缩，一般用量为原材料材料36倍体积左右，可一次提取或分次提取。提取倍体积左右，可一次提取或分次提取。提取时常缓慢搅拌，以提高提取效率。以盐溶液或缓冲时常缓慢搅拌，以提高提取效率。以盐溶液或缓冲液提取蛋白质和酶时，常综合考虑下列因素：液提取蛋白质和酶时，常综合考虑下列因素：现在学习的是第10页，共29页l(1)盐浓度：盐浓度：提取蛋白质的盐的浓度，一般提取蛋白质的盐的浓度，一般在在0.020.2M的范围内。常用稀溶液和
14、缓的范围内。常用稀溶液和缓冲液有冲液有0.020.05M磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，0.090.15M氯化钠溶液。氯化钠溶液。l(2)pH值：值：蛋白质和酶所用的提取液蛋白质和酶所用的提取液pH值值一般选择在被提取的蛋白质等电点两侧的一般选择在被提取的蛋白质等电点两侧的稳定区内。稳定区内。l(3)温度：温度：蛋白质和酶一般都不耐热，所以蛋白质和酶一般都不耐热，所以提取时通常要求低温操作。提取时通常要求低温操作。现在学习的是第11页，共29页2.有机溶剂提取有机溶剂提取l一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，蛋白质和酶，难溶于水、稀盐
15、、稀酸和稀碱，常用有机难溶于水、稀盐、稀酸和稀碱，常用有机溶剂提取。如丙酮、异丙醇、乙醇、正丁醇等，均可溶溶剂提取。如丙酮、异丙醇、乙醇、正丁醇等，均可溶于水或部分溶于水，这些溶剂都同时有亲脂性和亲水性。于水或部分溶于水，这些溶剂都同时有亲脂性和亲水性。其中正丁醇有较强的亲脂性，也有一定亲水性，在其中正丁醇有较强的亲脂性，也有一定亲水性，在0时时于水中有于水中有10.5的溶解度。它在水和脂分子间起着类似的溶解度。它在水和脂分子间起着类似去污剂的作用，取代蛋白质与脂质重新与蛋白质结合，去污剂的作用，取代蛋白质与脂质重新与蛋白质结合，使原来蛋白质在水中溶解度大大增加。丁醇在水溶液及使原来蛋白质在水
16、中溶解度大大增加。丁醇在水溶液及各种生物材料中解离脂蛋白的能力极强，是其他有机溶各种生物材料中解离脂蛋白的能力极强，是其他有机溶剂所不及的。我国生化工作者曾用此法成功地提取了琉剂所不及的。我国生化工作者曾用此法成功地提取了琉拍酸脱氢酶，对于碱性磷酸醋酶的提取效果也十分显著。拍酸脱氢酶，对于碱性磷酸醋酶的提取效果也十分显著。现在学习的是第12页，共29页l有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于一定比例的有机溶剂。在这样的能溶于一定比例的有机溶剂。在这样的情况下，采用稀的有机溶剂提取常常是情况下，采用稀的有机溶剂提取常常是为防止水解酶的破坏，并兼有除杂和提为防止
17、水解酶的破坏，并兼有除杂和提高纯化效果的作用。高纯化效果的作用。现在学习的是第13页，共29页3 3、从细胞膜上提取水溶性蛋白质的方法、从细胞膜上提取水溶性蛋白质的方法l膜上的蛋白质或酶一般有两种存在状态，一是在膜表膜上的蛋白质或酶一般有两种存在状态，一是在膜表面上，与膜成分联系比较松；第二是膜的内在成分之面上，与膜成分联系比较松；第二是膜的内在成分之一，或与膜成分结合较紧。蛋白质与膜成分的结合可一，或与膜成分结合较紧。蛋白质与膜成分的结合可通过脂质形成复合物，也可以通过金属离子与膜成分通过脂质形成复合物，也可以通过金属离子与膜成分结合，或与膜其他蛋白质形成复合物。与膜成分结合结合，或与膜其他
18、蛋白质形成复合物。与膜成分结合较松的蛋白质或酶，经过充分破碎细胞，在一定较松的蛋白质或酶，经过充分破碎细胞，在一定pHpH范范围用稀盐溶液即可提取分离。但一些与膜成分结合较围用稀盐溶液即可提取分离。但一些与膜成分结合较牢或属于膜组成的蛋白质，提取则比较困难，须用超牢或属于膜组成的蛋白质，提取则比较困难，须用超声波、去污剂或其他比较强烈的化学处理，才能从膜声波、去污剂或其他比较强烈的化学处理，才能从膜上分离出来。主要方法有：上分离出来。主要方法有：现在学习的是第14页，共29页l(1)(1)浓盐或尿素等溶液提取浓盐或尿素等溶液提取 如如NaClONaClO4 4、尿素、肌盐酸等、尿素、肌盐酸等溶
19、液均有人应用于提取膜蛋白，当以上溶液浓度达到溶液均有人应用于提取膜蛋白，当以上溶液浓度达到2mol/L2mol/L时，可提取时，可提取2727以上的膜蛋白，但使用这样条件以上的膜蛋白，但使用这样条件易引起蛋白质和酶的变性。易引起蛋白质和酶的变性。l(2)(2)碱溶液提取碱溶液提取 碱性条件也可以解离与膜上成分结碱性条件也可以解离与膜上成分结合的蛋白质。在合的蛋白质。在pH8-10pH8-10范围内，某些膜蛋白随着范围内，某些膜蛋白随着pHpH的提的提高而溶解度大大增加，至高而溶解度大大增加，至pHllpHll时，有时，有40%-5040%-50的膜蛋白的膜蛋白被抽出，但碱提取法也容易引起蛋白质
20、和酶的失活，应被抽出，但碱提取法也容易引起蛋白质和酶的失活，应用上不广。用上不广。l(3)(3)加人金属鳌合剂加人金属鳌合剂 蛋白质通过金属离子与膜成分蛋白质通过金属离子与膜成分结合时，加人金属鳌合剂如结合时，加人金属鳌合剂如EDTAEDTA可使蛋白质释放出来。可使蛋白质释放出来。用此法曾成功地提取了膜上用此法曾成功地提取了膜上ATPATP酶的偶联因子酶的偶联因子I I。EDTAEDTA与超声波联合处理抽提膜上的磷酰转移酶效果更好。与超声波联合处理抽提膜上的磷酰转移酶效果更好。现在学习的是第15页，共29页l(4）有机溶剂抽提）有机溶剂抽提 使用乙醇、吡啶、叔戊醇、正丁使用乙醇、吡啶、叔戊醇、
21、正丁醇等溶剂抽提及用冷丙酮做成丙酮粉，是提取膜上醇等溶剂抽提及用冷丙酮做成丙酮粉，是提取膜上与脂质结合的脂蛋白或膜内脂蛋白组分最常用也较与脂质结合的脂蛋白或膜内脂蛋白组分最常用也较有效的方法，其中叔戊醇及正丁醇用于膜内脂蛋白有效的方法，其中叔戊醇及正丁醇用于膜内脂蛋白效果尤佳。前已提到正丁醇可在广泛的效果尤佳。前已提到正丁醇可在广泛的pH(pH3-10)和温度范围（和温度范围（-240）内使用。用有机溶剂结合）内使用。用有机溶剂结合其他方法已成功地提取了多种膜上蛋白质和酶，如其他方法已成功地提取了多种膜上蛋白质和酶，如NPDH脱氢酶、唬珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、脱氢酶、唬珀酸脱氢酶、细胞色素
22、氧化酶、碱性磷酸酯酶、胆碱酯酶等。碱性磷酸酯酶、胆碱酯酶等。现在学习的是第16页，共29页l(5)(5)去垢剂处理去垢剂处理 去垢剂处理是目前广泛应用去垢剂处理是目前广泛应用于提取膜上水溶性蛋白和脂蛋白的方法，常用的于提取膜上水溶性蛋白和脂蛋白的方法，常用的去垢剂有弱离子去垢剂脱氧胆酸盐、胆酸盐，强去垢剂有弱离子去垢剂脱氧胆酸盐、胆酸盐，强离子型去垢剂十二烷基磺酸钠离子型去垢剂十二烷基磺酸钠(SDS(SDS）和非离子型去）和非离子型去垢剂垢剂Triton X-100Triton X-100和和Tween,LubrolTween,Lubrol和和BrijBrij等。等。l去垢剂处理膜蛋白时的浓度
23、通常为去垢剂处理膜蛋白时的浓度通常为1 1左右，用此左右，用此法提取的膜蛋白和酶有细胞色素法提取的膜蛋白和酶有细胞色素BSBS、胆碱醋酶、细、胆碱醋酶、细胞色素氧化酶、胞色素氧化酶、DPNHDPNH氧化酶、氧化酶、ADP/ATPADP/ATP载体蛋白等。载体蛋白等。现在学习的是第17页，共29页l用去垢剂分离膜蛋白时，选择去垢剂首先考虑：用去垢剂分离膜蛋白时，选择去垢剂首先考虑：去去垢剂的溶解能力；垢剂的溶解能力；去垢剂的温和性。强离子型去垢去垢剂的温和性。强离子型去垢剂（如剂（如SDS)一般具有很好的溶解能力，但温和情况不理一般具有很好的溶解能力，但温和情况不理想，容易引起蛋白质变性。弱离子
24、型或非离子型去垢剂对想，容易引起蛋白质变性。弱离子型或非离子型去垢剂对蛋白质变性影响较小，而溶解能力差。去垢剂的溶解能力蛋白质变性影响较小，而溶解能力差。去垢剂的溶解能力与溶液的离子强度大小有关。一般来说，离子强度增加，与溶液的离子强度大小有关。一般来说，离子强度增加，去垢剂的溶解能力也随之增大。所以使用去垢剂溶解膜蛋去垢剂的溶解能力也随之增大。所以使用去垢剂溶解膜蛋白时，须考虑各种条件。根据白时，须考虑各种条件。根据Klingenberg等的经验，等的经验，分离线粒体膜分离线粒体膜DP/ATP载体蛋白，选用载体蛋白，选用Triton X100比比用用Lubrol,Brij和和Aminoxid
25、e等去垢剂效果更好，所得等去垢剂效果更好，所得ADP/ATP载体蛋白具有较高的天然活性。但主要缺点载体蛋白具有较高的天然活性。但主要缺点是是riton X100在在280nm处有强的紫外吸收，干扰用紫外法处有强的紫外吸收，干扰用紫外法测定蛋白质的含量。测定蛋白质的含量。现在学习的是第18页，共29页l(6)(6)加人脂酶或磷酸酯酶水解蛋白质一脂加人脂酶或磷酸酯酶水解蛋白质一脂质复合物质复合物 从蛇毒中提取的磷酸醋酶从蛇毒中提取的磷酸醋酶A A主要作用于磷脂，最适主要作用于磷脂，最适pHpH为为6-86-8。从胰脏。从胰脏中提取的醋酶作用于单、二、三甘油醋，中提取的醋酶作用于单、二、三甘油醋，酶
26、作用最适酶作用最适pHpH为为7-8o7-8o醋酶和磷酸醋酶均需醋酶和磷酸醋酶均需要要Ca Ca 2 2激活。用酶法处理提取的膜蛋白激活。用酶法处理提取的膜蛋白及酶有细胞色素及酶有细胞色素C C、a-a-磷酸甘油脱氢酶、磷酸甘油脱氢酶、TPNH-TPNH-细胞色素细胞色素C C还原酶等。还原酶等。现在学习的是第19页，共29页三、蛋白质的纯化方法三、蛋白质的纯化方法l1.1.根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质 蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质，在一定蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质，在一定pHpH环环境中，某一种蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，或境中，某
27、一种蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，或解离成两性离子，其净电荷为零，此时环境的解离成两性离子，其净电荷为零，此时环境的pHpH值即为该值即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质性质比较稳定，其物蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等皆最小，因此理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等皆最小，因此可以利用蛋白质等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀可以利用蛋白质等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。蛋白质。等电点沉淀等电点沉淀 等电点除杂等电点除杂现在学习的是第20页，共29页2.根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化根据蛋白质分子形状和大小的不
28、同来纯化蛋白质蛋白质 蛋白质的一个主要特点是：分子大，而蛋白质的一个主要特点是：分子大，而且不同种类的蛋白质分子大小也不相等。且不同种类的蛋白质分子大小也不相等。由此可以用凝胶过滤法、超滤法、离心法由此可以用凝胶过滤法、超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其它小分子物质分及透析法等将蛋白质与其它小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。离，也可将大小不同的蛋白质分离。凝胶过滤层析凝胶过滤层析现在学习的是第21页，共29页3.3.根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质 蛋白质的溶解度受溶液的蛋白质的溶解度受溶液的pHpH、离子强度、溶剂的电、离子强度、溶剂的电解质性
29、质及温度等多种因素的影响。在同一特定条件下解质性质及温度等多种因素的影响。在同一特定条件下，不同的蛋白质有不同的溶解度，达到分离的目的。盐，不同的蛋白质有不同的溶解度，达到分离的目的。盐溶与盐析，结晶，低温有机溶剂沉淀法。如溶与盐析，结晶，低温有机溶剂沉淀法。如:盐析和有盐析和有机溶剂分级分离法。机溶剂分级分离法。4.4.根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质 离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或负离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的负离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力，从而使这些物质分离
30、提纯。亲和力，从而使这些物质分离提纯。蛋白质、多肽蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。或氨基酸具有能够离子化的基团。对蛋白质的对蛋白质的离子交换层析离子交换层析，一般多用离子交换纤，一般多用离子交换纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶为维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶为骨架的离子交换剂。主要是取得其有较大的蛋白质吸骨架的离子交换剂。主要是取得其有较大的蛋白质吸附容量、较高的流速和分辨力。附容量、较高的流速和分辨力。现在学习的是第22页，共29页5.5.根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质。根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质。主要手段是主要手段是亲和层析法亲和层
31、析法，即利用蛋白质分子能与其相，即利用蛋白质分子能与其相应的配体进行特异性的、非共价键的可逆性结合而达到应的配体进行特异性的、非共价键的可逆性结合而达到纯化的目的。纯化的目的。固相化金属亲和层析固相化金属亲和层析IMACIMAC是新发展的一种亲和层析是新发展的一种亲和层析技术。蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些金属元素技术。蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些金属元素（如（如CuCu2+2+,Zn,Zn2+2+)形成配位结合，使蛋白质得到分离纯化。形成配位结合，使蛋白质得到分离纯化。现在学习的是第23页，共29页6.根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结
32、合来纯化蛋白质蛋白质 蛋白质上有疏水区，它们主要由酪氨酸、亮蛋白质上有疏水区，它们主要由酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性的氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性的侧链密集在一起，并暴露于分子表面。这些疏水侧链密集在一起，并暴露于分子表面。这些疏水区能够与吸附剂上的疏水性基团结合，在通过降区能够与吸附剂上的疏水性基团结合，在通过降低介质的离子强度和极性等方法将蛋白质洗脱下低介质的离子强度和极性等方法将蛋白质洗脱下来。如来。如疏水相互作用层析疏水相互作用层析7.根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质 逆流分配色谱逆流分配色谱现在
33、学习的是第24页，共29页8.根据蛋白质受物理、化学等作用因素的根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯化蛋白质。影响来纯化蛋白质。蛋白质易受蛋白质易受pH、温度、酸碱、金属、温度、酸碱、金属离子、蛋白质沉淀剂，络合剂等的影响，离子、蛋白质沉淀剂，络合剂等的影响，用于各种蛋白质都存在差异，可利用这用于各种蛋白质都存在差异，可利用这种差异来分离纯化蛋白质。种差异来分离纯化蛋白质。如：电泳法、结晶纯化如：电泳法、结晶纯化现在学习的是第25页，共29页9.9.根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质质 在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附在蛋白质分离中，最广泛使用的吸
34、附剂有结晶磷酸钙，磷酸钙凝胶，硅胶，皂土、剂有结晶磷酸钙，磷酸钙凝胶，硅胶，皂土、沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。如：吸附层析炭等。如：吸附层析10.10.根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质 SODSOD酶抗蛋白水解酶。酶抗蛋白水解酶。亲和层析亲和层析现在学习的是第26页，共29页l总之，蛋白质和酶从细胞内提取出来后，总之，蛋白质和酶从细胞内提取出来后，仍处于十分混杂的体系中，必须进一步纯仍处于十分混杂的体系中，必须进一步纯化。但经过提取除去了大量与制备性质差化。但经过提取除去了大量与制备性质差别较大的杂质，只剩余
35、与制备物理性质大别较大的杂质，只剩余与制备物理性质大致相近或类似的物质。因此，经过有选择致相近或类似的物质。因此，经过有选择性的提取这一步骤，对以后纯化工作创造性的提取这一步骤，对以后纯化工作创造十分有利条件。蛋白质和酶溶剂提取后进十分有利条件。蛋白质和酶溶剂提取后进一步分离纯化常用方法有如下几种：一步分离纯化常用方法有如下几种：现在学习的是第27页，共29页l(1)盐析法；盐析法；l(2)等电点沉淀法；等电点沉淀法；l(3)有机溶剂分级分离法；有机溶剂分级分离法；l(4)层析法（凝胶过滤层析、离子交换层析、层析法（凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析）；吸附层析、亲和层析）；l(5
36、)电泳法（等电聚焦电泳、双向凝胶电泳）电泳法（等电聚焦电泳、双向凝胶电泳）l(6)结晶纯化等。结晶纯化等。现在学习的是第28页，共29页l四、蛋白质的鉴别方法四、蛋白质的鉴别方法l双缩脲双缩脲(Biuret）反应：）反应：本试剂为本试剂为1 CuS04和和40%NaOH溶液等量混合。主要是溶液等量混合。主要是Cu+2与蛋白质或与蛋白质或肽分子中肽键肽分子中肽键-CO-NH-络合呈色。蛋白质水提液和上络合呈色。蛋白质水提液和上述试剂反应，显红紫色。述试剂反应，显红紫色。l这是检验双缩脲以及有两个肽键以上的化合物的这是检验双缩脲以及有两个肽键以上的化合物的一个方法。双缩脲不溶于水，能溶于碱，故反应一个方法。双缩脲不溶于水，能溶于碱，故反应要在碱性条件下进行。要在碱性条件下进行。CuSO4过量有害，含使溶液过量有害，含使溶液生成生成Cu(NH3)4SO4而变兰，遮盖了特有的红紫色。而变兰，遮盖了特有的红紫色。现在学习的是第29页，共29页