病毒抗原与抗体检测技术讲稿.ppt

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1、关于病毒抗原与抗体检测技术第一页，讲稿共七十九页哦一、抗原抗体反应特异性高特异性高可逆可逆氢键、范德华力、静电吸引力氢键、范德华力、静电吸引力可见可见抗原抗原-抗体比例适宜，复合物相成团抗体比例适宜，复合物相成团第二页，讲稿共七十九页哦二、影响反应的因素电解质电解质pHpH7 7时，适当电解质使其结合可见凝集团或沉淀时，适当电解质使其结合可见凝集团或沉淀温度温度 3737温度升高，反应加快温度升高，反应加快 5656酸碱度酸碱度 pH68pH68接近等电点时易出现假阳性接近等电点时易出现假阳性第三页，讲稿共七十九页哦第一节 免疫荧光技术Immunofluorescence assay Immu

2、nofluorescence assay IFAIFA能解决：能解决：是什么是什么 在哪里在哪里 有多少有多少荧光荧光激发光谱激发光谱发射光谱发射光谱荧光效率荧光效率荧光寿命荧光寿命荧光猝灭荧光猝灭荧光偏振荧光偏振第四页，讲稿共七十九页哦第一节 免疫荧光技术荧光物质荧光物质荧光物质荧光物质最大吸收光谱最大吸收光谱最大发射光谱最大发射光谱应用应用异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 (FITC)(FITC)490490495nm495nm520520530nm 530nm（黄绿色）（黄绿色）FATFAT、荧光偏振免疫测定、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明四乙基罗丹明 (RB200)(RB200)570570

3、575nm575nm595595600nm600nm（橙红色）（橙红色）FITCFITC的衬比染色或双标的衬比染色或双标记记FATFAT四甲基异硫氰酸罗丹明四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC)(TRITC)550nm550nm620nm620nm（橙红色）（橙红色）FITCFITC的衬比染色或双标的衬比染色或双标记记FATFAT藻红蛋白（藻红蛋白（PEPE）490-560nm490-560nm595nm595nm（红色）（红色）双标记双标记FATFAT、流式细胞术、流式细胞术7-7-氨基氨基-4-4-甲基香豆素甲基香豆素354nm354nm430nm430nm（蓝色）（蓝色）双标记或多标记双标

4、记或多标记FATFATEuEu3+3+螯合物螯合物340nm340nm613nm613nm时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定第五页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验（一）原理（一）原理用用荧光标记物荧光标记物标记病毒标记病毒抗原或抗体抗原或抗体，作为分子探，作为分子探针，检查针，检查细胞或组织内细胞或组织内相应的病毒相应的病毒抗体或抗原抗体或抗原。荧光标记物受激发光照射后发光，用荧光显微荧光标记物受激发光照射后发光，用荧光显微镜观察，可确定镜观察，可确定病毒种类、定位、定量病毒种类、定位、定量。第六页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验（二）类型（二）类型荧光抗体法荧光抗体法荧光抗原法荧光

5、抗原法免疫细胞（组织）化学技术免疫细胞（组织）化学技术第七页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验（三）方法（三）方法制备标本制备标本制备荧光抗体制备荧光抗体荧光抗体染色荧光抗体染色荧光显微镜检查荧光显微镜检查第八页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验1.1.制作病毒染色标本制作病毒染色标本培养敏感细胞（细胞爬片）培养敏感细胞（细胞爬片）种毒种毒 固定、干燥固定、干燥丙酮丙酮第九页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验1.1.制作病毒染色标本制作病毒染色标本 临床样本（非固型组织）临床样本（非固型组织）涂片涂片 固定、干燥固定、干燥第十页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验1.1.制作病毒染色标本制作病毒

6、染色标本 尸检样品（尸检样品（35mm35mm）脱水脱色脱水脱色 冰冻切片冰冻切片 印片印片 石蜡石蜡固定、脱蜡固定、脱蜡 丙酮丙酮固定、干燥固定、干燥第十一页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验2.2.荧光抗体制备荧光抗体制备制备抗体制备抗体用高纯度病毒免疫用高纯度病毒免疫动物动物获取血清，分离获取血清，分离IgGIgG，提纯，提纯 家兔、绵羊、山羊家兔、绵羊、山羊 高特异性高特异性 高亲和力高亲和力第十二页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验2.2.荧光抗体制备荧光抗体制备标记荧光素标记荧光素 共价键结合共价键结合抗体抗体+荧光素荧光素 4 4持续搅拌数小时持续搅拌数小时纯化（离心、透析、过滤

7、）纯化（离心、透析、过滤）第十三页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验3.3.鉴定制成的荧光抗体鉴定制成的荧光抗体 以以FITCFITC为例为例荧光（荧光（F F）蛋白（）蛋白（P P）结合率）结合率调整制备液至调整制备液至A A280mm280mm=1=1 2.87A 2.87A495mm495mm A A280mm280mm-0.35A-0.35A495mm495mm比值越大，抗体结合荧光素越多比值越大，抗体结合荧光素越多F/P=F/P=第十四页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验3.3.鉴定制成的荧光抗体鉴定制成的荧光抗体测定抗体效价：双向免疫扩散试验测定抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性

8、：吸收试验、抑制试验抗体特异性：吸收试验、抑制试验抗体特异性染色滴度：倍比稀释抗体特异性染色滴度：倍比稀释第十五页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验4.4.荧光抗体染色荧光抗体染色直接法直接法第十六页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验4.4.荧光抗体染色荧光抗体染色间接法间接法第十七页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验4.4.荧光抗体染色荧光抗体染色补体法补体法荧光标记抗补体抗体荧光标记抗补体抗体 双标记法双标记法两种荧光素抗体检测两种抗原两种荧光素抗体检测两种抗原第十八页，讲稿共七十九页哦二、免疫荧光试验5.5.设立对照设立对照 区分特异性和非特异性染色区分特异性和非特异性染色标本自发荧光对

9、照标本自发荧光对照荧光抗体对照荧光抗体对照阳性抗原对照阳性抗原对照阻断试验阻断试验第十九页，讲稿共七十九页哦三、免疫荧光显微镜技术荧光显微镜荧光显微镜利用一定波长的激发利用一定波长的激发光对样品进行激发，光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分对样品结构或其组分进行定性、定位、定进行定性、定位、定量观察检测。量观察检测。第二十页，讲稿共七十九页哦三、免疫荧光显微镜技术l光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 l滤光片：隔热、激发和吸收滤光片滤光片：隔热、激发和吸收滤光片l光路：透射光、落射光光路：透射光、落射光l聚光器：明视野、暗视野和相差

10、荧光聚光器聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器l镜头：消色差镜头镜头：消色差镜头 第二十一页，讲稿共七十九页哦三、免疫荧光显微镜技术透射光：透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。进入物镜。落射光：落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。射到标本，经标本反射进入物镜。第二十二页，讲稿共七十九页哦四、时间分辩免疫荧光技术Time-resolved fluoroimmunoassay Time-resolved fluoroimmunoassay TR-FIATR-FIA（一）原理（一）原理自发荧

11、光寿命短自发荧光寿命短:1ns1ns10ns10ns镧系元素寿命长镧系元素寿命长:10s10s1000s1000s短寿命荧光完全衰变后再测短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光定镧系元素特异荧光铕铕EdEd3+3+锝锝TbTb3+3+钐钐SmSm3+3+镝镝DyDy3+3+第二十三页，讲稿共七十九页哦四、时间分辩免疫荧光技术（二）方法类型（二）方法类型双抗体夹心法双抗体夹心法固相抗体和固相抗体和EuEu3+3+标记标记抗体与待检抗原结合，抗体与待检抗原结合，形成形成固相抗体固相抗体-待检待检抗原抗原-Eu-Eu3+3+标记抗体标记抗体复合物复合物，酸性增强，酸性增强液下，液下，EuEu3+

12、3+解离，解离，340nm340nm激发光下发射激发光下发射613nm613nm荧光。荧光。第二十四页，讲稿共七十九页哦四、时间分辩免疫荧光技术（二）方法类型（二）方法类型固相抗体竞争法固相抗体竞争法 待检抗原和待检抗原和EuEu3+3+标记抗原与固相抗体竞争结合标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在温育洗涤后在固相中加入荧光增强液固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。量成反比。固相抗原竞争法固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的待检抗原和固相抗原竞争结合定量的EuEu3+3+标记抗体，温育洗标记抗体，温育洗涤后在固相中

13、加入荧光增强液涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。检抗原含量成反比。第二十五页，讲稿共七十九页哦第二节 酶免疫技术Enzyme immunoassayEnzyme immunoassay抗原抗体反应特异性抗原抗体反应特异性酶高效催化反应专一性酶高效催化反应专一性 第二十六页，讲稿共七十九页哦第二节 酶免疫技术酶酶 底底 物物显色反应显色反应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HRPHRP 邻苯二胺邻苯二胺OPDOPD四甲替联苯胺四甲替联苯胺TMBTMB氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,22,2-连胺基连胺基-2

14、(3-2(3-乙基乙基-并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 APAP4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405405420 420-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(

15、4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)荧光荧光黄色黄色 360,450360,450420 420 第二十七页，讲稿共七十九页哦第二节 酶免疫技术酶标记酶标记戊二醛交联法戊二醛交联法过碘酸氧化法过碘酸氧化法醛基醛基酶酶蛋白质蛋白质HRPHRP过碘酸盐过碘酸盐HRPHRP醛基醛基第二十八页，讲稿共七十九页哦第二节 酶免疫技术固相载体固相载体塑料制品塑料制品微粒微粒膜载体膜载体 NCNC膜、尼龙膜膜、尼龙膜第二十九页，讲稿共七十九页哦第二节 酶免疫技术包被与封闭包被与封闭包被包被适宜浓度蛋白质适宜浓度蛋白质封闭封闭二次包被填补空隙二次包被填补空隙 小牛血清小牛血

16、清第三十页，讲稿共七十九页哦二、酶联免疫吸附试验Enzyme-linked immunosorbent assay Enzyme-linked immunosorbent assay ELISAELISA酶标记抗体（抗原）与待测抗原（抗体）发生特异酶标记抗体（抗原）与待测抗原（抗体）发生特异性反应，加入酶底物，通过酶对底物的显色反应，性反应，加入酶底物，通过酶对底物的显色反应，对待测抗原（抗体）进行定位、定性或定量分析。对待测抗原（抗体）进行定位、定性或定量分析。第三十一页，讲稿共七十九页哦第三十二页，讲稿共七十九页哦间接法检测抗体检测抗体+固相抗原固相抗原 标本标本 酶标抗体酶标抗体 底物底

17、物 显色显色第三十三页，讲稿共七十九页哦双抗体夹心法检测抗原检测抗原+固相抗体固相抗体 标本标本 酶标抗体酶标抗体 底物底物 显色显色第三十四页，讲稿共七十九页哦竞争法可检测抗原、抗体可检测抗原、抗体YYY+YYY+YYY参参考考管管酶标抗原酶标抗原YYY+YYY+YYY待待测测管管酶标抗原酶标抗原抗原抗原第三十五页，讲稿共七十九页哦捕获法检测检测IgMIgM抗体抗体+抗抗IgMIgM 标本标本 抗原抗原 酶标抗体酶标抗体 显色显色 （含（含IgMIgM）+第三十六页，讲稿共七十九页哦三、免疫酶染色试验Immunoenzymatic staining test Immunoenzymatic

18、staining test IESTIEST酶酶标标抗体（抗原）抗体（抗原）抗原（抗体）抗原（抗体）复合物复合物 底物底物 有色底物有色底物第三十七页，讲稿共七十九页哦三、免疫酶染色试验细胞免疫酶染色细胞免疫酶染色均相酶免疫测定均相酶免疫测定无需分离无需分离游离与结合的酶游离与结合的酶标记物标记物酶标记物结合后改变酶活性酶标记物结合后改变酶活性非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定需分离需分离游离与结合的酶标游离与结合的酶标记物记物液相：用二抗或沉淀去除游离酶标记物液相：用二抗或沉淀去除游离酶标记物固相：固相：ELISAELISA第三十八页，讲稿共七十九页哦第三节 放射免疫技术Radioimmuno

19、assay Radioimmunoassay RIARIA利用放射性核素灵敏精确性与抗原抗体反应特异利用放射性核素灵敏精确性与抗原抗体反应特异性相结合进行定量分析性相结合进行定量分析放射免疫放射免疫核素标记抗原与未标记抗原核素标记抗原与未标记抗原竞争性竞争性结合特异性抗体结合特异性抗体免疫放射免疫放射核素标记抗体结合待测抗原核素标记抗体结合待测抗原R.S.Yalow第三十九页，讲稿共七十九页哦第三节 放射免疫技术125125I I、131131I I、3 3H H、1414C C标记标记纯化纯化鉴定鉴定放射性放射性免疫活性免疫活性第四十页，讲稿共七十九页哦第三节 放射免疫技术第四十一页，讲稿共

20、七十九页哦第三节 放射免疫技术放射免疫放射免疫竞争法竞争法第四十二页，讲稿共七十九页哦+BoundFreeAgAb6/8=0.756/8=0.754/8=0.54/8=0.52/8=0.252/8=0.251/8=0.1251/8=0.125B/B+F第四十三页，讲稿共七十九页哦第三节 放射免疫技术放射免疫放射免疫以未结合的以未结合的Ag*Ag*为为F F，Ag*AbAg*Ab复合物为复合物为B B，则，则B/FB/F或或B/(BB/(BF)F)与与AgAg的量变存在着的量变存在着函数关系剂量反应函数关系剂量反应曲线曲线 第四十四页，讲稿共七十九页哦第四节 血清学试验中和试验中和试验血凝血凝/

21、血凝抑制试验血凝抑制试验补体结合试验补体结合试验第四十五页，讲稿共七十九页哦一、中和试验neutralization testneutralization test 体外将体外将病毒病毒与与特异性抗体特异性抗体混合混合并发生反应，再并发生反应，再将混合物接种至敏感的宿主体内，然后测定将混合物接种至敏感的宿主体内，然后测定残存病残存病毒感染力毒感染力的方法。的方法。中和抗体中和抗体第四十六页，讲稿共七十九页哦一、中和试验（一）原理（一）原理中和抗体存在使病毒不能吸附和穿入宿主细胞，中和抗体存在使病毒不能吸附和穿入宿主细胞，使病毒失去感染力。使病毒失去感染力。当病毒与抗体混合后，接种敏感宿主细胞再

22、观当病毒与抗体混合后，接种敏感宿主细胞再观察敏感宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主察敏感宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主的感染力。的感染力。第四十七页，讲稿共七十九页哦一、中和试验（二）方法步骤（二）方法步骤病毒病毒-已知滴度，并有感染力已知滴度，并有感染力测滴度：细胞培养，将病毒测滴度：细胞培养，将病毒1010倍稀释倍稀释接种敏感接种敏感细胞或动物，观察细胞或动物，观察CPECPE或动物感染情况，确定滴定或动物感染情况，确定滴定终点以终点以CCIDCCID5050或或LDLD5050表示表示标准病毒试验浓度标准病毒试验浓度：100 CCID100 CCID5050/单位体积或单位体积或10

23、0 100 LDLD5050/单位体积单位体积第四十八页，讲稿共七十九页哦一、中和试验抗体抗体用细胞培养法测病毒抗体的滴度：将用细胞培养法测病毒抗体的滴度：将倍比稀释倍比稀释的的病毒抗血清液与等量的标准病毒液混合，接种敏病毒抗血清液与等量的标准病毒液混合，接种敏感细胞，观察感细胞，观察CPECPE。病毒抗体滴度的确定：抗血清保护细胞免受病毒感病毒抗体滴度的确定：抗血清保护细胞免受病毒感染的最高稀释倍数的倒数。染的最高稀释倍数的倒数。抗体滴度的含义：抑制抗体滴度的含义：抑制CPECPE的的最高稀释倍数最高稀释倍数的抗血的抗血清中，清中，每单位体积含一个抗体单位每单位体积含一个抗体单位。第四十九页

24、，讲稿共七十九页哦一、中和试验举例举例如观察结果是如观察结果是1 1：1010至至1 1：320320抗血清均能抑制病抗血清均能抑制病毒的毒的CPECPE，也就是当抗血清稀释到，也就是当抗血清稀释到320320倍时，倍时，0.1ml0.1ml抗血清含有抗血清含有1 1个抗体单位。个抗体单位。请问：请问：1 1：160160及及1 1：4040含有几个抗体单位？含有几个抗体单位？标准抗体浓度标准抗体浓度为为2020个抗体单位个抗体单位/0.1ml/0.1ml第五十页，讲稿共七十九页哦一、中和试验宿主宿主l细胞培养细胞培养:观察观察CPECPE和空斑和空斑（最理想和常用）（最理想和常用）l鸡胚：观

25、察鸡胚的死亡（流感）、绒毛尿囊腔鸡胚：观察鸡胚的死亡（流感）、绒毛尿囊腔上痘疮及血凝现象（天花、牛痘、上痘疮及血凝现象（天花、牛痘、HSVHSV）l动物（小白鼠）动物（小白鼠）:成年和幼鼠易感，如乙脑病毒、成年和幼鼠易感，如乙脑病毒、森林脑炎病毒森林脑炎病毒第五十一页，讲稿共七十九页哦一、中和试验（二）方法步骤（二）方法步骤固定血清固定血清稀释抗病毒法稀释抗病毒法检测病毒及其滴度检测病毒及其滴度固定病毒固定病毒稀释抗血清法稀释抗血清法检测血清效价检测血清效价第五十二页，讲稿共七十九页哦一、中和试验（二）方法步骤（二）方法步骤固定血清固定血清稀释病毒法稀释病毒法 用中和试验方法鉴定病毒时，将不同

26、稀释倍数的病毒与用中和试验方法鉴定病毒时，将不同稀释倍数的病毒与标准的抗血清标准的抗血清(20(20个抗体单位个抗体单位/单位体积单位体积)混合、孵育，使二混合、孵育，使二者充分反应，然后将混合液接种到敏感宿主体内，观察试验者充分反应，然后将混合液接种到敏感宿主体内，观察试验结果。结果。第五十三页，讲稿共七十九页哦固定血清稀释病毒法试验材料试验材料宿主宿主:敏感细胞和动物、鸡胚敏感细胞和动物、鸡胚标准抗病毒血清标准抗病毒血清(20(20个抗体单位个抗体单位/0.1ml)/0.1ml)病毒分离物病毒分离物试验步骤试验步骤不同浓度病毒液与等量的抗病毒血清混合细胞培养液倍比稀释病不同浓度病毒液与等量

27、的抗病毒血清混合细胞培养液倍比稀释病毒毒不同浓度病毒液与等量阴性血清混合不同浓度病毒液与等量阴性血清混合接种细胞接种细胞,设正常细胞对照，设正常细胞对照，COCO2 2孵箱观察孵箱观察CPECPE中和试验病毒中和试验病毒CCIDCCID5050：当抗血清组的当抗血清组的CCIDCCID5050与阴性组之差的对数与阴性组之差的对数大于大于2 2,才说明中和试验阳性。才说明中和试验阳性。第五十四页，讲稿共七十九页哦固定血清稀释病毒法 阴性血清病毒阴性血清病毒CCID50CCID50的计算的计算病毒病毒稀释度稀释度CPECPE孔数孔数/接种孔数接种孔数 累计数累计数CPECPE数数 存活数存活数CP

28、ECPE阳性比阳性比例例CPECPE阳性率阳性率（）（）10-45/510 010/10100.010-54/5 5 1 5/683.010-61/5 1 5 1/617.010-70/5 0 100/10 0第五十五页，讲稿共七十九页哦固定血清稀释病毒法距离比例（大于距离比例（大于50%50%的的CPECPE阳性率阳性率50%50%）/（大于（大于50%50%的的CPECPE阳性率小于阳性率小于50%50%的的CPECPE阳性率）（阳性率）（83835050）/（83831717）0.50.5lgCCIDlgCCID5050=大于大于50%50%的的CPECPE阳性率血清稀释度的对数阳性率血

29、清稀释度的对数+距离比例距离比例稀释系数的对数稀释系数的对数=lg10=lg10-5-5+0.5 lg0.1=-5.5,+0.5 lg0.1=-5.5,其反对数是其反对数是1010-5.55.5.阴性血清组的病毒阴性血清组的病毒CCIDCCID5050为为1010-5.5-5.5/0.1ml/0.1ml。第五十六页，讲稿共七十九页哦固定血清稀释病毒法 阳性血清病毒阳性血清病毒CCID50CCID50的计算的计算病毒病毒稀释度稀释度CPE孔数孔数/接种孔数接种孔数 累计数累计数CPE数数 存活数存活数CPE阳性阳性比例比例CPE阳性率阳性率（）（）10-25/510 010/10100.010-

30、33/55 25/771.010-42/52 52/729.010-50/5 0 100/10 0第五十七页，讲稿共七十九页哦固定血清稀释病毒法距离比例（大于距离比例（大于50%50%的的CPECPE阳性率阳性率50%50%）/（大于（大于50%50%的的CPECPE阳性率小于阳性率小于50%50%的的CPECPE阳性率）阳性率）（71715050）/（71712929）0.50.5大于大于50%50%的的CPECPE阳性率血清稀释度的对数阳性率血清稀释度的对数+距离比例距离比例稀释系数的对数稀释系数的对数=lg10=lg10-3-3+0.5 lg0.1=-3.5,+0.5 lg0.1=-3.

31、5,其反对数是其反对数是1010-3.5-3.5。阳性血清组的病毒阳性血清组的病毒CCIDCCID5050为为1010-3.5-3.5/0.1ml/0.1ml。因抗血清组的因抗血清组的CCIDCCID5050为为1010-3.5-3.5，阴性血清组的病毒，阴性血清组的病毒CCIDCCID5050为为1010-5.5-5.5,所以所以1010-3.5-3.5-10-10-5.5-5.5=2,=2,表明分离的病毒是与中和抗体相表明分离的病毒是与中和抗体相对应的病毒。对应的病毒。第五十八页，讲稿共七十九页哦一、中和试验（二）方法步骤（二）方法步骤固定病毒固定病毒稀释血清法稀释血清法 用于血清抗体滴度

32、的测量。用已知病毒检测位置抗体用于血清抗体滴度的测量。用已知病毒检测位置抗体滴度。滴度。100 CCID 100 CCID5050/单位体积的病毒单位体积的病毒+连续倍比稀释血清连续倍比稀释血清孵育孵育1h1h接种敏感宿主接种敏感宿主观察不同稀释度的血清保护宿主感染病毒的情况观察不同稀释度的血清保护宿主感染病毒的情况第五十九页，讲稿共七十九页哦固定病毒稀释血清法试验材料试验材料:敏感宿主敏感宿主标准滴定的病毒标准滴定的病毒100CCID100CCID5050/0.1ml/0.1ml急性期或恢复期血清急性期或恢复期血清试验步骤试验步骤细胞培养液倍比稀释急性或恢复期血清细胞培养液倍比稀释急性或恢复

33、期血清取不同稀释浓度血清与标准病毒混合并取不同稀释浓度血清与标准病毒混合并3737孵育孵育1h1h取混合液取混合液0.2ml0.2ml接种细胞接种细胞,CO,CO2 2孵箱观察孵箱观察CPECPE5050血清中和终点：血清中和终点：50%50%细胞不产生细胞病变的血清稀释度细胞不产生细胞病变的血清稀释度第六十页，讲稿共七十九页哦固定病毒稀释血清法恢复期血清中和病毒的结果恢复期血清中和病毒的结果血清稀释度CPE孔数/接种孔数 累计数CPE数 无CPE数CPE阳性比例CPE阳性率（）1：16(10-1.2)0/40 80/80.01：32(10-1.5)1/41 41/520.01：64(10-1

34、.8)3/44 14/580.01：128(10-2.1)4/48 08/8100.0第六十一页，讲稿共七十九页哦固定病毒稀释血清法l距离比例（距离比例（50%50%小于小于50%50%的的CPECPE阳性率）阳性率）/（大于（大于50%50%的的CPECPE阳性率小于阳性率小于50%50%的的CPECPE阳性率）阳性率）（50502020）/（80802020）0.50.5l50%50%血清中和终点的范围血清中和终点的范围:1:32:1:32与与1:641:64之间。之间。l中和终点浓度中和终点浓度=小于小于50%50%的的CPECPE阳性率血清稀释度的对数阳性率血清稀释度的对数+距离比例距

35、离比例稀释系数的对数稀释系数的对数=lg10=lg10-1.5-1.5+0.5 lg0.5=-1.65,+0.5 lg0.5=-1.65,其反对数是其反对数是1/451/45l即即50%50%血清中和终点为血清中和终点为1:451:45 含义：含义：1:451:45稀释度的恢复期血清可保护稀释度的恢复期血清可保护50%50%细胞不产生细胞病变效细胞不产生细胞病变效应。应。第六十二页，讲稿共七十九页哦二、血凝/血抑血凝血凝 HAHA第六十三页，讲稿共七十九页哦血凝抑制 HI第六十四页，讲稿共七十九页哦 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121 2 3 4 5 6 7 8 9 10

36、11 12血凝试验 HA试验方法试验方法选择选择9696孔板（孔板（V V型）型）病毒液倍比稀释病毒液倍比稀释稀释好后加鸡红细胞稀释好后加鸡红细胞混匀后混匀后2020室温静置室温静置30min30min+50l PBS吸出一半吸出一半1:21:21:21:22 21:21:23 31:21:24 4+100l 病毒液病毒液+50l 鸡红细胞鸡红细胞吸弃一半吸弃一半第六十五页，讲稿共七十九页哦血凝试验 HA血凝滴度：血凝滴度：以出现以出现+的稀释度的倒数为判定终点的稀释度的倒数为判定终点,为为1 1个血凝单位。个血凝单位。凝集效价：凝集效价：能使血球产生能使血球产生+凝集的病毒最高稀释度凝集的病

37、毒最高稀释度为病毒的凝集效价，即为病毒的凝集效价，即0.5ml0.5ml病毒液含病毒液含1 1个血凝单位。个血凝单位。第六十六页，讲稿共七十九页哦三、补体结合试验补体：正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具补体：正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质，辅助抗体介导免疫溶菌和溶血作用。有酶活性的蛋白质，辅助抗体介导免疫溶菌和溶血作用。对热不稳定。对热不稳定。绵羊红细胞与抗绵羊红细胞抗体（溶血素）作用形成溶绵羊红细胞与抗绵羊红细胞抗体（溶血素）作用形成溶血素致敏的绵羊红细胞。补体可使这种致敏红细胞溶解。血素致敏的绵羊红细胞。补体可使这种致敏红细胞溶解。补体可结合任何病毒抗原

38、抗体复合物补体可结合任何病毒抗原抗体复合物第六十七页，讲稿共七十九页哦三、补体结合试验如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，而体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，而不出不出现溶血现溶血，是为，是为补体结合试验阳性补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会时会出现溶血出现溶血，是为，是为补体结合试验阴性补体结合试验阴性。第六十八页，讲稿共

39、七十九页哦三、补体结合试验有有3 3个系统：个系统：反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；（或抗原）；补体系统；补体系统；指示系统，即指示系统，即SRBCSRBC与相应溶血素，形成致敏红细与相应溶血素，形成致敏红细胞。胞。第六十九页，讲稿共七十九页哦三、补体结合试验病毒抗原l从组织培养、鸡胚和动物试验中获得病毒抗原l应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强l如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应第七十页，讲稿共七十九页哦三、补体结合试验抗体l免疫用的病毒抗原最好不是同一细

40、胞或动物，以免发生交叉反应l血清样品应加热灭活处理，消除补体活性和非特异性抗补体活性l人和豚鼠灭活温度为56；家兔和马灭活温度为65第七十一页，讲稿共七十九页哦三、补体结合试验补体检测人和哺乳动物血清应用豚鼠新鲜血清补体临用前使用1SRBC制备绵羊颈静脉采血，生理盐水洗涤溶血素用绵羊红细胞免疫家兔获得效价达到1:4000可获得5630分钟灭活，加甘油后长期保存稀释液l含钙镁离子的生理盐水，可维持补体的稳定第七十二页，讲稿共七十九页哦三、补体结合试验溶血素的滴定l先将溶血素稀释成1:1001:1000,再依次加入溶血素0.1ml，钙镁盐水0.2ml，1:60补体0.2ml、1绵羊红细胞0.1ml

41、，混匀后再水浴l结果判定：完全溶血的试管液体红色透明，离心后见少许细胞;不溶血的试管液体混浊，放置后见红细胞沉淀，上清无色透明l溶血素效价的测定;以完全溶血的最高稀释倍数确定为1个单位l本例1个单位的溶血素的效价为1：4000；正式使用2个单位第七十三页，讲稿共七十九页哦三、补体结合试验补体的滴定补体的滴定补体不稳定，每次试验前需滴定管号1：60补体钙镁盐水（ml)2U抗原(ml)1致敏SRBC(ml)结果10.040.260.10.2不溶20.060.240.10.2不溶30.080.220.10.2微溶40.100.200.10.2微溶50.120.180.10.2全溶60.140.160

42、.10.2全溶70.140.140.10.2全溶第七十四页，讲稿共七十九页哦三、补体结合试验确实单位（exact unit）l将完全溶血的最小补体量，如上图1：60补体最小量0.12ml可产生完全溶血，为1个确实单位.l正式试验时使用2个确实单位。（20.12):60=0.2:x 得X=50,即实际应用中的2个补体确实单位为1:50的补体0.2ml.抗原和抗体的滴定找出抗原和抗体最佳比例,用方阵滴定法第七十五页，讲稿共七十九页哦抗原稀释度 抗血清稀释度 抗原 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 对照1:8444432101:1644432201:32444

43、31001:64444200001:128210000001:256100000001:51201000000抗血清对照0000000注：4-为完全不溶血；3为25%羊红细胞溶血；2为50羊红细胞 溶血；1为75%羊红细胞溶血；0为完全溶血第七十六页，讲稿共七十九页哦三、补体结合试验将抗原和抗体进行倍比稀释（1：81：512)横向前7排加不同稀释度的抗原0.1ml;纵向前7排加不同稀释度的抗血清溶液0.1ml;各管加含两个确实单位的补体0.2ml;最好4度冰箱过夜;最后加致敏SRBC;结果判定l选择抗原和抗体呈强阳性反应(完全不溶血)的最高稀释度作为抗体的效价;l由图可知1:64的抗原和1:32的抗血清分别为1U;l正式试验中抗原一般用24U(1:321:16)，抗血清用4U(1:8)第七十七页，讲稿共七十九页哦三、补体结合试验按图序加入各种试剂；阴性和阳性对照代表溶血和不溶血；补体对照管中2U应全溶;若不完全溶血表明补体量不够；补体0.5U应不溶,若完全溶血则表明补体含量过多。注意事项抗原和抗体纯度和滴度要够；补体保存应低温保存,不要反复冻溶；补体含量常用0.52U。第七十八页，讲稿共七十九页哦2023/4/6感感谢谢大大家家观观看看第七十九页，讲稿共七十九页哦