《气体成分分析高效液相色谱法讲稿.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《气体成分分析高效液相色谱法讲稿.ppt（79页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、关于气体成分分析高效液相色谱法第一页，讲稿共七十九页哦概述（一）高效液相色谱的发展液相色谱法（liquidchromatography，LC）是最早（1903年）发明的，此之前纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。20世纪60年代后期，液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。液相色谱法于1969年商品化。这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。第二页，讲稿共七十九页哦气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适
2、合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，例如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。第三页，讲稿共七十九页哦高效色谱的类型HPLC分配色普法离子色谱法吸附色谱法凝胶色谱法第四页，讲稿共七十九页哦HPLC按分离机理的分类第五页，讲稿共七十九页哦液相色谱仪器高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据系统最基本组件线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等配置组件第六页，讲稿共七十九页哦输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中
3、各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。图8-1液相色谱仪的工作过程第七页，讲稿共七十九页哦输液泵输液泵流量准确可调。对于一般的分析工作而言，流动相的流 速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量一般为5-10mL/min。输液泵的流量控制精度通常要求小于0.5%。耐高压。通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。液流稳定。输液泵输出的液流应无脉动，或配套脉冲抑制器。1.对输液泵的基本要求第八页，讲稿共七十九页哦泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于0.5mL。泵的结构材料
4、应耐化学腐蚀。第九页，讲稿共七十九页哦输出液恒定的因素恒压泵恒流泵工作方式气动泵机械泵螺旋传动注射泵单活塞往复泵双活塞往复泵往复式隔膜泵2.输液泵第十页，讲稿共七十九页哦第十一页，讲稿共七十九页哦单活塞往复泵：在活塞柱的一端有一偏心轮，偏心轮连在电动机上，电动机带动偏心轮转动时，活塞柱则随之左右移动。在活塞的另一端有上下两个单向阀，各有1-2个蓝宝石或陶瓷球，由其起阀门的作用。下面的单向阀与流动相连通，为活塞的溶液入口；上面的单向阀与色谱柱相连，为活塞的溶液出口。活塞向外移动时，出口单向阀关闭，入口单向阀打开，溶液（流动相）抽入活塞缸。活塞向里移动时，入口单向阀关闭，出口单向阀打开，流动相被压
5、出活塞缸，流向色谱柱。图8-2(1)活塞型往复泵第十二页，讲稿共七十九页哦有一个精心设计的偏心凸轮，用同步电机或变速直流电机驱动偏心凸轮，偏心凸轮再推动两活塞作往复运动。偏心凸轮短半径端对应的活塞向外伸，使该活塞的下单向阀打开吸入流动相，同时，半径端所对应的另一活塞被推入，使其上单向阀打开，并将流动相送至色谱柱。两活塞交替伸缩，往复运动，这样避免单活塞泵液流脉冲的问题。不必使用消除脉冲的阻尼器，避免了阻尼器的压力消耗，但缺点是设备成本较高，流量调节也比单活塞泵复杂。图8-3优点：优点：构造：构造：双活塞往复泵第十三页，讲稿共七十九页哦隔膜型往复泵也是一种恒流泵，一块隔膜将泵缸分为两部分，一部分
6、充满了油，另一部分充满了流动相。活塞与油接触，当活塞往复运动时，隔膜受到油压的作用，对流动相部分产生“吸引”或“推压”，使流动相部分的单向阀吸液或排液，从而获得稳定的液流。通过调节泵活塞的冲程即可进行流量调节。隔膜泵的活塞不直接与流动相接触，故不存在活塞密封垫磨损对流动相的污染。隔膜泵的死体积小（约0.1mL），因此，更换流动相后平衡快，有利于梯度洗脱。隔膜泵的缺点是结构比较复杂，价格较贵，和单活塞机械往复泵一样，也产生脉冲，也需要配置阻尼装置来消除脉冲。图8-4(2)隔膜型往复泵第十四页，讲稿共七十九页哦泡沫为什么要脱气噪音峰基线起伏排气费时荧光淬灭pH变化。第十五页，讲稿共七十九页哦图8-
7、5第十六页，讲稿共七十九页哦梯度洗脱装置梯度洗脱装置在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。1.为什么要进行梯度洗脱？第十七页，讲稿共七十九页哦在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。2.梯度洗脱操作第十八页，讲稿共七十九页哦线性梯度：线性梯度：在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度线性梯度线性梯度：在某一
8、段时间内连续而均匀增加流动相强度。梯度洗脱时，流动相的输送就是要将几种组成的溶液混合后送到分离系统，因此，梯度洗脱装置就是解决溶液的混合问题，其主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。第十九页，讲稿共七十九页哦高压梯度高压梯度：一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的。只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现
9、二元梯度操作。图8-6主要优点：主要优点：主要缺点：主要缺点：第二十页，讲稿共七十九页哦低压梯度低压梯度：只需一个高压泵，在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。比例阀在泵在常压（低压）下混合，混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后的四种溶液进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。多元梯度泵的流路可以部分空置。图8-7主要装置主要装置第二十一页，讲稿共七十九页哦进样器进样器进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，分手动和自动两种方式。密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很
10、小。现在采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器，其原理与气相色谱中的相同。特点第二十二页，讲稿共七十九页哦色谱柱构成色谱填料色谱柱管色谱柱1.色谱柱的构成图8-8第二十三页，讲稿共七十九页哦在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端打开垂直放在软垫上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直台面墩10-20次。又称淤浆填充法，使用专门的填充装置。图8-92.色谱柱的填充干法填充湿法填充第二十四页，讲稿共七十九页哦常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有硅胶和
11、有机高分子聚合物微球。3.填料的结构基质第二十五页，讲稿共七十九页哦是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。如图8-10是硅胶基质的冠醚大分子固定相的结构示意图，功能层冠醚分子吸附或键合在硅胶基质的表面。功能层第二十六页，讲稿共七十九页哦微孔型（或凝胶型）大孔型（全多孔型）薄壳型表面多孔型图8-113.填料的物理结构第二十七页，讲稿共七十九页哦数据处理系统与自动控制单元数据处理系统与自动控制单元又称色谱工作站。它可对分析全过程（分析条件、仪器状态、分析状态）进行在线显示，自动采集、处理和储存分析数据。一些配置了积分仪或记录仪的老型号液相色谱仪在很多
12、实验室还在使用，但近年新购置的色谱仪，一般都带有数据处理系统，使用非常方便。数据控制系统第二十八页，讲稿共七十九页哦将各部件与控制单元连接起来，在计算机上通过色谱软件将指令传给控制单元，对整个分析实现自动控制，从而使整个分析过程全自动化。也有的色谱仪没有设计专门的控制单元，而是每个单元分别通过控制部件与计算机相连，通过计算机分别控制仪器的各部分。自动控制单元第二十九页，讲稿共七十九页哦液相色谱分离模式液相色谱分离模式原理固定相流动相基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂。
13、弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物第三十页，讲稿共七十九页哦硅羟基呈微酸性，易与氢结合，是吸附的活性点.。流动相溶剂在吸附剂表面形成单分子或双分子吸附层，当样品分子进入色谱柱，样品主要靠氢键结合力吸附到硅羟基上，与流动相分子竞争吸附点。样品分子反复地被吸附，又反复地被流动相分子顶替解吸，随着流动相的流动而在柱中向前移动。因为不同的样品分子在固定相表面的吸附能力不同，因而吸附-解吸的速度不同，被洗脱的时间也就不同，使得各组分相互分离。吸附色谱在早期的HPLC中应用得最多，现在，很多以前用吸附色谱分离的物质被更方便和更有效的化学键合相反相分配色谱所代替。由于硅羟基活性点在硅胶表面常按一定
14、几何规律排列，因此吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法。如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。第三十一页，讲稿共七十九页哦（一）分配色谱原理原理基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同键合固定相以化学键合将功能分子结合到惰性载体上。极性键合固定相键合在载体表面的功能分子极性基团的有机分子第三十二页，讲稿共七十九页哦非极性键合固定相键合在载体表面的功能分子是非极性有机分子。正相HPLC由极性固定相和非极性流动相所组成的HPLC体系。反相HPLC非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系第三十三页，讲稿共七十九页哦（二）凝胶色谱（gelchromatography）以多孔性
15、物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分离的分离模式。样品分子与固定相之间不存在相互作用力（吸附、分配和离子交换等）。比固定相孔径大的溶质分子不能进入孔内，迅速流出色谱柱，不能被分离。比固定相孔径小的分子进入孔内而产生保留，溶质分子体积越小，进入固定相孔内的机率越大，停留（保留）的时间也就越长图8-12原理第三十四页，讲稿共七十九页哦固定相：化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。流动相：在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。凝胶过滤色谱（gelfiltrationchromatography,GFC）：以水或缓冲溶液作
16、流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的分离。凝胶渗透色谱（gelpermeationchromatography,GPC）：以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定。第三十五页，讲稿共七十九页哦（三）离子色谱（ionchromatography,IC）IEC使用的是低交换容量的离子交换剂，这种交换剂的表面有离子交换基团。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团可以用于阴离子的分离。图8-131离子交换色谱法第三十六页，讲稿共七十九页哦ICE
17、的分离机理是以树脂的Donnan排斥为基础的分配过程。分离阴离子用强酸性高交换容量的阳离子交换树脂，分离阳离子用强碱性高交换容量的阴离子交换树脂。图8-142离子排斥色谱法第三十七页，讲稿共七十九页哦离子对色谱(IPC)也称离子相互作用色谱，是在流动相中加入适当的具有与被测离子相反电荷的离子，即离子对试剂，使之与被测离子形成中性的离子对化合物，此离子对化合物在反相色谱柱上被保留。保留的大小主要取决于离子对化合物的解离平衡常数和离子对试剂的浓度。离子对色谱也可采用正相色谱的模式，即可以用硅胶柱，但不如反相色谱效果好，多数情况下采用反相色谱模式，所以也常称反相离子对色谱。3离子对色谱法第三十八页，
18、讲稿共七十九页哦检测器液相色谱检测技术液相色谱检测技术第三十九页，讲稿共七十九页哦第四十页，讲稿共七十九页哦原理：基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于其对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。紫外紫外-可见光检测器可见光检测器第四十一页，讲稿共七十九页哦用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其它目的也可适当牺
19、牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长，另外，应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相第四十二页，讲稿共七十九页哦以光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。图8-15二极管阵列检测器第四十三页，讲稿共七十九页哦原理：基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折
20、射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。示差折光检测法也称折射指数检测法。对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。在凝胶色谱中是必备检测器。RI检测器根据其设计原理可分为反射型（根据Fresnel定律）、折射型（根据Snell定律）和干涉型三种类型。示差折光检测器示差折光检测器第四十四页，讲稿共七十九页哦原理：许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反应衍生化后
21、检测。荧光检测器荧光检测器特点：有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2-3个数量级。而且所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析。第四十五页，讲稿共七十九页哦原理：基于离子性物质的溶液具有导电性，其电导率与离子的性质和浓度相关。电导检测器是离子色谱中必备的检测器。电导检测器的构成：由电导池、测量电导率所需的电子线路、变换灵敏度的装置和数字显示仪等几部分组成，电导池是其核心。电导池的结构：检测体积可达到微升甚至纳升级。其基本结构是在柱流出液中放置两根电极，然后通过适当的电子线路测量溶液的电导。电导电导检测器检测器第四十六页，讲稿共七十九页哦电导检测器工作原理：电导池工
22、作时，电极间及电极附近溶液中所发生的电化学过程可以用图8-18表示。当向电导池的两个电极施加电压时，溶液中的阴离子向阳极移动，阳离子向阴极移动。在电解质溶液中的离子数目和离子的移动速率决定溶液的电阻大小，离子的迁移率或单位电场中离子的速率取决于离子的电荷及其大小、介质类型、溶液温度和离子浓度。离子的迁移速率取决于施加电压的大小。所施加的电压既可以是直流电压，也可以是正弦波或方波电压。当施加的有效电位确定后，即可测量出电路中的电流值，即能测出电导值。图8-18第四十七页，讲稿共七十九页哦构成：ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器。由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光检测器（光电转换
23、器）等部件构成。流程：色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。蒸发光散射蒸发光散射检测器检测器第四十八页，讲稿共七十九页哦适用范围：适合无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源强度等参数有关。与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。图8-19第四十九页，讲稿共七十九页哦其它色谱方法其它色谱方法超临界流体：指高于临界压力和临界温度时的一种物质状态，它既不是气
24、体，也不是液体，但它兼具气体的低粘度和液体的高密度以及介于气体和液体之间的较高扩散系数等特征。SFC：以超临界流体作流动相，以固体吸附剂（如硅胶）或键合在载体（或毛细管壁）上的有机高分子聚合物作固定相的色谱方法。1.超临界流体色谱超临界流体色谱第五十页，讲稿共七十九页哦常用流动相：超临界状态下的、氧化亚氮、乙烷、三氟甲烷等。最常用，因为它的临界温度低（31）、临界压力适中（7.29MPa）、无毒、便宜，但其缺点是极性太低，对一些极性化合物的溶解能力较差，所以，通常要用另一台输液泵往流动相中添加1-5的甲醇等极性有机改性剂。第五十一页，讲稿共七十九页哦色谱柱：液相色谱的填充柱和气相色谱的毛细管柱
25、都可以使用，但由于超临界流体的强溶解能力，所使用的毛细管填充柱的固定相必须交联应用：从理论上讲，SFC既可以象液相色谱一样分析高沸点和难挥发样品，也可象气相色谱一样分析挥发性成分。不过，超临界流体色谱更重要的应用是用来作分离和制备，即超临界流体萃取。第五十二页，讲稿共七十九页哦毛细管电泳（capillaryelectrophoresis,CE）：以高压电场为驱动力，以电解质为电泳介质，以毛细管为分离通道，样品组分依据淌度和分配行为的差异而实现分离的一种色谱方法。它有多种分离模式，可以采用液相色谱中的各种检测方法。CE既可以分离带电荷的溶质，也可以通过毛细管胶束电动色谱等分离模式分析中性溶质，C
26、E的高分离效率、高检测灵敏度，样品用量极少等特点使它在生物医药样品的分析中显示出突出的优越性。2.毛细管电泳和毛细管电色谱毛细管电泳和毛细管电色谱第五十三页，讲稿共七十九页哦毛细管电色谱（capillaryelectrochromatography,CEC）：以电渗流（或电渗流结合高压输液泵）为流动相驱动力的微柱色谱法。CEC是液相色谱与毛细管电泳相结合的产物，它的分离机理包含有电泳迁移和色谱固定相的保留机理，一般而言，溶质与固定相间的相互作用对分离起主导作用。所用色谱柱为填充了HPLC填料的填充型毛细管柱和管内壁涂渍了固定相功能分子的开管毛细管柱。CEC还处在发展阶段，目前主要应用在药物、手
27、性化合物和多环芳烃的分离分析。另外CEC与质谱联用既可解决LC/MS的分离效率不高的问题，又可克服CE/MS中质量流量太小的缺陷。第五十四页，讲稿共七十九页哦3亲和色谱亲和色谱定义：利用蛋白质或生物大分子等样品与固定相上生物活性配位体之间的特异亲和力进行分离的液相色谱方法。固定相：将具有生物活性的配位体以共价键结合到不溶性固体基质上制得。生物活性配位体：常用的有酶（如底物及其类似物）、辅酶（如类固醇）、抗体（植物激素）、激素（如糖和多糖）、抗生素（核苷酸）等。第五十五页，讲稿共七十九页哦基质：通常为凝胶，许多无机和有机聚合物都可形成凝胶，如琼脂糖衍生物、多孔玻璃。分离过程：在分离过程中涉及疏水
28、相互作用、静电力、范德华力和立体相互作用。在键合了某类配体的亲和色谱柱上加入含生物活性大分子的样品，只有柱中配位体有明显亲和性的生物大分子才会被吸附，这些生物分子只有在改变流动相的组成时才会被洗脱。应用：亲和色谱主要用于蛋白质和生物活性物质的分离与制备。第五十六页，讲稿共七十九页哦以激光的辐射压力为驱动力，将待分离组分（或物质颗粒）按几何尺寸大小予以分离的一种色谱分离技术。激光色谱是1995年刚刚提出的新的色谱方法，尽管尚无商品仪器，但可预言其在生命科学领域将发挥重要作用，如分离高分子聚合物微球、生物细胞、生物大分子、肽、DNA、线粒体。从理论上讲，可以实现单个蛋白质分子的检测。3激光色谱激光
29、色谱原理应用第五十七页，讲稿共七十九页哦欲分离的粒子随流动相（粒子溶液本身）以一定的流速流经毛细管，将一定功率的激光束聚焦于毛细管的出口，激光束的入射方向与粒子的流动方向相反，但都与毛细管同轴。这时，溶质同时受到流动相的推动力激光束压力的作用。溶质的折光指数大于溶剂的，因此粒子受辐射压力作用而聚焦于激光束的中心线上，当溶质受到压力大于流动相推力时，粒子就会发生反转并获得一定加速度，直至受到的流动相阻力与压力相等时，溶质才会停留。因为不同几何尺寸的溶质粒子受到激光辐射的作用力不同，它们在毛细管中的停留位置也就不同，从而达到分离。可以用配有显微物镜的电视摄像机记录分离结果。检测分离过程第五十八页，
30、讲稿共七十九页哦HPLC在不同领域的主要应用在不同领域的主要应用HPLC几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝大多数物质成分的分离分析，它和气相色谱都是应用最广泛的仪器分析技术，HPLC在部分领域的主要分析对象物质列于表8-4。第五十九页，讲稿共七十九页哦液相色谱分离模式的选择液相色谱分离模式的选择分离方式是按固定相的分离机理分类的，选定了固定相（色谱柱）基本上就确定了分离方式。当然，即使同一根色谱柱，如果所用流动相和其它色谱条件不同，也可能成为不同的分离方式。选择分离方式大体上可以参照图8-20。首页第六十页，讲稿共七十九页哦液相色谱仪流程图液相色谱仪流程图第六十一页，讲稿共七十九页哦第六十二页，讲稿共七十九页哦第六十三页，讲稿共七十九页哦第六十四页，讲稿共七十九页哦第六十五页，讲稿共七十九页哦第六十六页，讲稿共七十九页哦第六十七页，讲稿共七十九页哦第六十八页，讲稿共七十九页哦第六十九页，讲稿共七十九页哦第七十页，讲稿共七十九页哦第七十一页，讲稿共七十九页哦第七十二页，讲稿共七十九页哦第七十三页，讲稿共七十九页哦第七十四页，讲稿共七十九页哦第七十五页，讲稿共七十九页哦第七十六页，讲稿共七十九页哦第七十七页，讲稿共七十九页哦第七十八页，讲稿共七十九页哦感感谢谢大大家家观观看看第七十九页，讲稿共七十九页哦