第三章高效液相色谱法B.ppt

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1、第三章高效液相色谱法B现在学习的是第1页，共47页一一、液液色谱法（或称液液分配色谱法）、液液色谱法（或称液液分配色谱法）分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异(一一)固定相固定相 载体载体+固定液（物理或机械涂渍法）固定液（物理或机械涂渍法）缺点：缺点：系统内部压力大，易流失，不实用系统内部压力大，易流失，不实用现在学习的是第2页，共47页常用的几类载体常用的几类载体 ：（1 1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）由由直直径径为为303040 40 m m的的实实心心玻玻璃璃球球和和厚厚度度约约为为1 12 2 m m 的多

2、孔性外层所组成的多孔性外层所组成 （2 2）全全多多孔孔型型载载体体：由由硅硅胶胶、硅硅藻藻土土等等材材料料制制成成，直直径径30 30 50 50 m m 的多孔型颗粒的多孔型颗粒 （3 3）全全多多孔孔型型微微粒粒载载体体：由由nmnm级级的的硅硅胶胶微微粒粒堆堆积积而而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为5 5 10 10 m m 现在学习的是第3页，共47页 固定液固定液 由由于于液液相相色色谱谱中中，流流动动相相参参与与选选择择作作用用，流流动动相相极极性性的的微微小小变变化化，都都会会使使组组分分的的保保留留值值出出现现较大的差异。较大的差异。液液相相色

3、色谱谱中中，只只需需几几种种不不同同极极性性的的固固定定液液即即可可。如如,氧氧二二丙丙腈腈（ODPNODPN），聚聚乙乙二二醇醇（PEGPEG），十八烷（十八烷（ODSODS）和角鲨烷固定液等和角鲨烷固定液等。现在学习的是第4页，共47页(二二)流动相流动相 要要求求流流动动相相对对固固定定相相的的溶溶解解度度尽尽可可能能小小，因因此此固定液和流动相的性质往往处于固定液和流动相的性质往往处于两个极端两个极端现在学习的是第5页，共47页 正相色谱正相色谱固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分适于分

4、离极性组分 反相色谱反相色谱固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分适于分离非极性组分现在学习的是第6页，共47页二、化学键合相色谱法二、化学键合相色谱法（一）原理（一）原理 化学键合相：利用化学反应，通过共价键将有机化学键合相：利用化学反应，通过共价键将有机基团键合在载体（硅胶）表面，形成均一、牢固基团键合在载体（硅胶）表面，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相的单分子薄层而构成的固定相 分离机制：分配分离机制：分配+吸附（以吸附（以LLC为基础）为基础）特点：特点：不易流失；不易流失；热稳

5、定性好热稳定性好 化学性能好；化学性能好；载样量大载样量大 适于梯度洗脱适于梯度洗脱 现在学习的是第7页，共47页（二）固定相（二）固定相 载体：几乎都用载体：几乎都用硅胶硅胶。一般可分三类：一般可分三类：（1 1）疏疏水水基基团团 如如不不同同链链长长的的烷烷烃烃（C C8 8和和C C1818。）和和苯苯基基等等（2 2）极性基团）极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3 3）离离子子交交换换基基团团 如如作作为为阴阴离离子子交交换换基基团团的的胺胺基基，季季镀盐；作为阳离子交换镀盐；作为阳离子交换 基团的磺酸等基团的磺酸等.现在学习的是第8页，共47页键合固

6、定相的制备键合固定相的制备（l l）硅氧碳键型（硅酸酯型）（硅氧碳键型（硅酸酯型）（Si-O-C Si-O-C）键合相）键合相 最最先先用用于于液液相相色色谱谱的的健健合合固固定定相相,用用醇醇与与硅硅醇醇基基发发生生酯化反应。酯化反应。由由于于这这类类键键合合固固定定相相的的有有机机表表面面是是一一些些单单体体，具具有有良良好好的的传传质质特特性性,但但这这些些酯酯化化过过的的硅硅胶胶填填料料易易水水解解且且受热不稳定，因此仅受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相适用于不含水或醇的流动相现在学习的是第9页，共47页（2 2）硅氮型（）硅氮型（Si-N Si-N）键合相）键合相 将硅胶表面

7、的羟基先转化成卤素（氯化），再与各种有机将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。可用非极性胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相或强极性的溶剂作为流动相（3 3）硅碳型（）硅碳型（Si-CSi-C）键合相）键合相 将将硅硅胶胶表表面面氯氯化化后后，使使Si-ClSi-Cl键键转转化化为为Si-CSi-C键键。在在这这类类固固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。缺点：缺点：该反应不方便；当使用水溶液时，必须限制该反应不方便；当使用水溶液时，必须限制PH在在48范围内范

8、围内.现在学习的是第10页，共47页（4）硅烷化（）硅烷化（SiOSiC）键合固定相）键合固定相 将将硅硅胶胶与与有有机机氯氯硅硅烷烷或或烷烷氧氧基基硅硅烷烷反反应应制制备备。具具有有相相当当的的耐耐热热性性和和化化学学稳稳定定性性，是是目目前前应应用用最最为为广广泛泛的的键合相。键合相。固固定定相相在在 pH pH=2 28.5 8.5 范范围围内内对对水水稳稳定定，有有机机分分子子与载体间的结合牢固，固定相不易流失稳定性好。与载体间的结合牢固，固定相不易流失稳定性好。例：例：十八烷基硅烷键合相（简称十八烷基硅烷键合相（简称ODSODS或或C C1818）：）：是最常用的是最常用的非极性键合

9、相。它们用于反相色谱法，在非极性键合相。它们用于反相色谱法，在7070以下和以下和 pH 2pH 28 8范围内可正常工作范围内可正常工作现在学习的是第11页，共47页（三）流动相（三）流动相 1 1、正相键合相色谱法、正相键合相色谱法 流流动动相相极极性性小小于于固固定定相相极极性性。常常用用非非极极性性溶溶剂剂如如烷烷烃烃类类溶溶剂剂，样样品品组组分分的的保保留留值值可可用用加加入入适适当当的的有有机机溶溶剂剂（调调节节剂剂）的的办办法法调调节节洗洗脱脱强强度度。常常用用溶溶剂剂有：氯仿、二氯甲烷、已腈、醇类等。有：氯仿、二氯甲烷、已腈、醇类等。适适用用于于分分离离中中等等极极性性化化合合

10、物物，如如脂脂溶溶性性维维生生素素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药现在学习的是第12页，共47页2 2、反相键合相色谱法、反相键合相色谱法 流流动动相相极极性性大大于于固固定定相相极极性性，多多以以水水或或无无机机盐盐缓缓冲冲液液为为主主体体，再再加加入入一一种种能能与与水水相相混混溶溶的的有有机机溶溶剂剂（如甲醇、乙睛、四氢呋喃等）为调节。如甲醇、乙睛、四氢呋喃等）为调节。固定相一般为固定相一般为C C1818、C C8 8 应用最广泛应用最广泛 现在学习的是第13页，共47页正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱的差别：正相色谱和反相色谱的差别：正相

11、色谱正相色谱反相色谱反相色谱固定相极性固定相极性大大小小流动相极性流动相极性小至中等小至中等中至大中至大组分流出顺序组分流出顺序极性小的组分先流出极性小的组分先流出极性大的组分先流出极性大的组分先流出流动相极性增大流动相极性增大保留时间变小保留时间变小保留时间变大保留时间变大分离组分分离组分油溶性或水溶性的极性油溶性或水溶性的极性和强极性化合物和强极性化合物非极性、极性或离子型非极性、极性或离子型化合物化合物现在学习的是第14页，共47页三、三、液固色谱法（或称吸附色谱法）液固色谱法（或称吸附色谱法）流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附

12、剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂（一）原理（一）原理1、分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸、分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异附活性中心能力的差异 分离前提：分离前提：K K不等或不等或k k不等不等现在学习的是第15页，共47页2、固定相：与、固定相：与LC比，固定相粒径不同（比，固定相粒径不同（17%分配色谱分配色谱硅胶失活硅胶失活载体载体吸附的水吸附的水固定液固定液现在学习的是第19页，共47页四、离子交换色谱法（四、离子交换色谱法（IEC IEC）（一）原理（一）原理 利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液

13、中溶液中阳离子和阴离子阳离子和阴离子的一种分离分析方法。利用不同的一种分离分析方法。利用不同待测离子对固定相亲和力的差别待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离来实现分离 适用无适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广现在学习的是第20页，共47页阴离子交换：阴离子交换：一般形式：一般形式：R一一AB RBA阳离子交换：阳离子交换：待待测测离离子子与与离离子子交交换换树树脂脂固固定定相相上上带带电电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应荷基

14、团或游离的离子发生可逆交换反应现在学习的是第21页，共47页（二）固定相（二）固定相 种类种类阳离子交换树脂阳离子交换树脂强酸性强酸性弱酸性弱酸性阴离子交换树脂阴离子交换树脂强碱性强碱性弱碱性弱碱性现在学习的是第22页，共47页（三）流动相三）流动相 通常是盐类的缓冲溶液通常是盐类的缓冲溶液 改变改变 流动相的流动相的 pHpH 缓冲剂（平衡离子）的类型缓冲剂（平衡离子）的类型 离子强度离子强度 加入有机溶剂、配位剂等加入有机溶剂、配位剂等 常用的缓冲剂有：常用的缓冲剂有：磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、氨水等盐、甲酸盐、氨水等 现在学习的是第23页，共47页五、五、离

15、子对色谱法离子对色谱法 离离子子对对色色谱谱法法是是将将一一种种（或或数数种种）与与溶溶质质离离子子电电荷荷相相反反的的离离子子（称称对对离离子子或或反反离离子子）加加到到流流动动相相或或固固定定相相中中，使使其其与与溶溶质质离离子子结结合合形形成成离离子子对对，从从而而控控制制溶溶质质离离子保留行为的一种色谱法。子保留行为的一种色谱法。现在学习的是第24页，共47页离子对形成机理离子对形成机理 把把和和被被测测物物离离子子A A电电荷荷相相反反的的离离子子B B（对对离离子子或或反反离离子子）加加入入到到流流动动相相中中，使使待待测测离离子子A A与与反反离离子子B B形形成成中中中中性性性

16、性离离离离子子子子对对对对ABAB，该该ABAB离离子子对对的的性性质质与与A A离离子子或或B B离子离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。现在学习的是第25页，共47页离子对试剂离子对试剂 用用于于阴阴离离子子分分离离的的对对离离子子：烷烷基基铵铵类类，如如氢氢氧氧化化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲基铵等四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲基铵等 用用于于阳阳离离子子分分离离的的对对离离子子：烷烷基基磺磺酸酸类类，如如己己烷烷磺酸钠磺酸钠 固定相和流动相固定相和流动相 性性质质同同键键合合相相色色谱谱，选选择择不不同同的的离离子子对对试试剂剂可可

17、以以分离酸、碱和离子、非离子的混合物分离酸、碱和离子、非离子的混合物 现在学习的是第26页，共47页六、六、离子色谱法离子色谱法 以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，通常以电导检测器为通用检测器。通常以电导检测器为通用检测器。对对离离子子型型化化合合物物的的分分析析，离离子子色色谱谱法法是是目目前前唯唯一一能能获获得得快快速速、灵灵敏敏、准准确确和和多多组组分分效效果果的的方方法法，检检测测手手段段已已扩扩展展到到电电导导检检测测器器之之外外的的其其它它类类型型的的检检测测器器，如如电电化化学学检检测测器器，紫紫外外光光度度检检测测器器。可可

18、分分析析的的离离子子从从无无机机和和有有机机阴阴离离子子到到金金属属阳阳离离子子，从从有有机机阳阳离离子子到到糖糖类类、氨氨基基酸酸等等均均可可用用离离子子色色谱谱法进行分析。法进行分析。现在学习的是第27页，共47页七、七、空间排阻色谱法空间排阻色谱法（一）分离原理（一）分离原理凝胶内具有一定大小的凝胶内具有一定大小的孔穴孔穴小分子可完全渗透入内，最后洗小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱出色谱柱中等体积的分子部中等体积的分子部分渗透分渗透体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来较早地被淋洗出来 固定相为化学惰性多孔物质固定相为化学惰性

19、多孔物质凝胶凝胶,类似于分子筛，但类似于分子筛，但孔径比分子筛大。这样，样品分子基本上按其分子大小，孔径比分子筛大。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。排阻先后由柱中流出。现在学习的是第28页，共47页（二）固定相凝胶（二）固定相凝胶 凝凝胶胶是是含含有有大大量量液液体体（一一般般为为水水）的的柔柔软软而而富富于于弹弹性性的的物物质质，是是一一种种经经过过交交联联而而具具有有立立体体网网状状结结构的多聚体。构的多聚体。软质凝胶软质凝胶分类分类 半硬质凝胶半硬质凝胶 硬质凝胶硬质凝胶现在学习的是第29页，共47页1 1、软质凝胶、软质凝胶种种类类：如如葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、琼琼

20、脂脂糖糖凝凝胶胶都都具具有有较较小小的的交交联联结结构构特点：特点：微微孔孔能能吸吸入入大大量量的的溶溶剂剂，并并能能溶溶涨涨到到它它干干体体的的许许多多倍倍 适适用用于于水水溶溶性性溶溶剂剂作作流流动动相相，一一般般用用于于小小分分子质量物质的分析，不适宜在高效液相色谱中。子质量物质的分析，不适宜在高效液相色谱中。现在学习的是第30页，共47页2 2、半硬质凝胶（有机凝胶）、半硬质凝胶（有机凝胶）种类：种类：如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶，如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶，特特点点：能能耐耐较较高高压压力力，适适用用于于有有机机溶溶剂剂作作流流动动相相，有有一一定定可可压压缩缩性性，可可填填得

21、得紧紧密密，柱柱效效较较高高。缺缺点点：在在有有机机溶剂中有轻度膨胀。溶剂中有轻度膨胀。现在学习的是第31页，共47页3 3、硬质凝胶（无机凝胶）、硬质凝胶（无机凝胶）是是具具有有一一定定孔孔径径范范围围的的多多孔孔性性凝凝胶胶，如如多多孔孔硅硅胶、多孔玻璃珠等胶、多孔玻璃珠等 凝凝胶胶化化学学惰惰性性、稳稳定定性性及及机机械械强强度度均均好好，耐耐高高温温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱效较低。使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱效较低。现在学习的是第32页，共47页（三）流动相（三）流动相选择依据（从样品的溶解性考虑）选择依据（从样品的溶解性考虑）流动相应与凝胶本身有相似性流动相

22、应与凝胶本身有相似性 黏度低黏度低 与样品的折光率相差大与样品的折光率相差大 能润湿凝胶，防止吸附作用能润湿凝胶，防止吸附作用 常常用用的的流流动动相相有有四四氢氢呋呋喃喃、甲甲苯苯、N N，N-N-二二甲甲基基甲甲酸酸胺胺、三三氯氯甲甲烷烷（凝凝胶胶渗渗透透色色谱谱）；水水（凝凝胶胶过过滤滤色色谱谱）等。等。现在学习的是第33页，共47页第四节第四节 液相色谱法流动相液相色谱法流动相一、流动相选择的一般要求一、流动相选择的一般要求 1 1、流动相的纯度、流动相的纯度 2 2、流动相与固定相不互溶，不发生化学反、流动相与固定相不互溶，不发生化学反 3 3、对试样要有适宜的溶解度、对试样要有适宜

23、的溶解度 4 4、必须与检测器匹配、必须与检测器匹配 5 5、溶剂的粘度要小，可以降低色谱柱的阻力、溶剂的粘度要小，可以降低色谱柱的阻力 现在学习的是第34页，共47页二、常用溶剂的极性二、常用溶剂的极性 常用溶剂的极性顺序为：常用溶剂的极性顺序为：水（极性最大）水（极性最大）、甲酰胺、甲酰胺、乙睛、甲醇、乙睛、甲醇、丙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃、醋酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯丙酮、四氢呋喃、醋酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、环己烷、己烷、仿、环己烷、己烷、现在学习的是第35页，共47页三、流动相的选择三、流动相的选择 根根据据流流动动相相所所起起的的作作用用，可可以以把把溶溶剂剂分分为为底底剂剂和

24、和洗脱剂洗脱剂两种两种 底剂底剂决定基本的色谱分离情况决定基本的色谱分离情况 洗洗脱脱剂剂则则是是为为了了调调节节试试样样组组分分的的滞滞留留并并对对某某几几个个组分具有选择性的分离作用组分具有选择性的分离作用 现在学习的是第36页，共47页1 1、键合相色谱法、键合相色谱法正相色谱：正相色谱：底剂底剂采用低极性溶剂，如正己烷、苯、氯仿等；采用低极性溶剂，如正己烷、苯、氯仿等；洗洗脱脱剂剂则则根根据据试试样样的的性性质质，有有针针对对性性地地选选择择极极性性较较强强的的溶剂如醚、酯、酮、醇和酸等；溶剂如醚、酯、酮、醇和酸等；反相色谱中：反相色谱中：以以水水为为流流动动相相的的主主体体，以以加加

25、入入不不同同配配比比的的有有机机溶溶剂剂作作调调节节剂剂。常常用用的的有有机机溶溶剂剂是是甲甲醇醇、乙乙腈腈、二二氧氧六六环、四氢呋喃等环、四氢呋喃等现在学习的是第37页，共47页2 2、离子交换色谱法、离子交换色谱法 离子交换色谱法在含水介质中进行离子交换色谱法在含水介质中进行 组组分分的的保保留留值值可可用用流流动动相相中中盐盐的的浓浓度度（或或离离子子强强度度）和和pHpH来来控控制制，增增加加盐盐的浓度导致保留值降低。的浓度导致保留值降低。现在学习的是第38页，共47页3 3、排阻色谱法、排阻色谱法 排排阻阻色色谱谱法法所所用用的的溶溶剂剂必必须须与与凝凝胶胶本本身身非非常常相相似似，

26、这样才能润湿凝胶并防止吸附作用。这样才能润湿凝胶并防止吸附作用。对对分分离离高高分分子子有有机机化化合合物物，采采用用的的溶溶剂剂主主要要是是四四氢氢呋呋喃喃、甲甲苯苯、间间甲甲苯苯酚酚、N,N-N,N-二二甲甲基基甲甲酰酰胺胺等等 生生物物物物质质的的分分离离主主要要用用水水、缓缓冲冲盐盐溶溶液液、乙乙醇醇及及丙酮等丙酮等 现在学习的是第39页，共47页 第五节第五节 色谱分离条件选择色谱分离条件选择现在学习的是第40页，共47页一、一、减小柱内展宽，提高柱效减小柱内展宽，提高柱效l l、固定相、固定相 选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相 首选化学键合相，匀浆法

27、装柱首选化学键合相，匀浆法装柱现在学习的是第41页，共47页2 2、流动相、流动相 选用低粘度的流动相，有利于增大组分在选用低粘度的流动相，有利于增大组分在溶剂中的扩散系数溶剂中的扩散系数DmDm，减少传质阻力，减少传质阻力 例：甲醇、乙腈等例：甲醇、乙腈等3 3、流速流速 约约1ml/min1ml/min4 4、柱温的选择：、柱温的选择：选室温选室温25250 0C C左右左右现在学习的是第42页，共47页二、减少柱外展宽二、减少柱外展宽1 1、柱前展宽：、柱前展宽：主要由进样引起，减小进样器的死体积主要由进样引起，减小进样器的死体积 2 2、柱后展宽：、柱后展宽：主主要要由由接接管管、检检

28、测测器器流流通通池池体体积积及及检检测测器器响响应应时间等因素所引起时间等因素所引起现在学习的是第43页，共47页现在学习的是第44页，共47页三、分离类型的选择三、分离类型的选择1 1、分析的、分析的目的目的是什么是什么 2 2、分析对象、分析对象性质及其结构性质及其结构是什么？是什么？3 3、分析样品的、分析样品的复杂程度复杂程度，大概有，大概有多少种多少种组分组分4 4、样品、样品量量、样品的、样品的形态形态5 5、要求的、要求的检测限、测定限、灵敏度、分析时间检测限、测定限、灵敏度、分析时间6 6、有无分析、有无分析实例和标准样品实例和标准样品以及以及相关分析资料相关分析资料7 7、实

29、验设备实验设备情况情况现在学习的是第45页，共47页 液相色谱分离类型选择参考表液相色谱分离类型选择参考表 溶于水溶于水排阻色谱，水为流动相排阻色谱，水为流动相 相对分子质量相对分子质量 2000 不溶于水不溶于水排阻色谱，非水流动相排阻色谱，非水流动相 同系物同系物分配色谱分配色谱 不溶于水不溶于水 异构体异构体吸附色谱吸附色谱样品样品 分子大小差异分子大小差异排阻色谱排阻色谱 反相液一液色谱反相液一液色谱 相对分子质量相对分子质量 溶于水，溶于水，2000 不离解不离解 排阻色谱，水为流动相排阻色谱，水为流动相 碱碱阳离子交换色谱阳离子交换色谱 溶于水，可离解溶于水，可离解 酸酸阴离子交换色谱阴离子交换色谱 溶于水溶于水,离子与非离子离子与非离子反相离子对色谱反相离子对色谱 现在学习的是第46页，共47页第六节第六节 高效液相色谱法的应用高效液相色谱法的应用现在学习的是第47页，共47页