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1、1生物亲和作用 由于不是整个分子或物质参与亲和结合，亲和作用的分子(物质)对可以是：大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞-细胞。亲和作用的作用力具有“钥匙和锁孔”的关系是产生亲和结合作用的必要条件，但并不充分。除此之外，还需要分子或原子水平的各种相互作用.1第1页/共41页2亲和作用的影响因素 1)离子强度如Affinity主要源于静电引力或氢键，则提高I无疑会减弱或完全破坏Affinity。疏水性作用随I提高而增大,因此，当Affinity作用主要源于疏水性相互作用时，增大I则可提高Affinity。许多亲和吸附的目标蛋白质可用高浓度盐溶液洗脱，说明静电引力在Affinity中
2、占有重要地位。2)pH 在亲和分离操作中,溶液pH值的选择是非常重要的.3).抑制氢键形成的物质脲和盐酸胍的存在可抑制氢键配基配体的形成.因此,如果Affinity中存在氢键,则加入脲或盐酸胍可减弱Affinity。但它们为强烈变性剂。4)温度TT 使分子和原子的热运动，结合中心的静电作用、氢键及金属配位键，但可使疏水性作用。5)大半径的阴离子SCN-，I-和ClO-4等半径较大的阴离子能降低疏水相互作用。故，则这此离子会降低Affinity。6).表面活性剂/乙二醇7)鳌合剂如果Affinity源于亲和分子对与金属离子形成的配位键，则加入乙二胺四乙酸EDTA等鳌合剂除去金属离子，可使Affi
3、nity消失。结合中心2第2页/共41页3一般操作 关键:?3第3页/共41页4亲和吸附介质 商品化的亲和吸附介质亚胺二乙酸4第4页/共41页4亲和吸附介质Home-made亲和吸附介质Home-made所需材料1st 亲和配基2nd 载体Home-made基本方法亲和配基+载体 =载体-亲和配基天然吸附介质 如植物凝集素与糖具有亲和结合作用，因此，天然琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶可直接用做外源凝集素的亲和吸附介质。例如:1st Sephadex凝胶是葡萄糖通过a-1.6结合与交联制备的葡萄糖凝胶,可亲和吸附伴刀豆球蛋白A(一种植物凝集素);2nd Sepharose 凝胶中含有半乳糖,在Ca2+离
4、子存在下可亲和吸附蛇毒凝集素.已介绍?5第5页/共41页5亲和配基A 蛋白(protein A or A抗原)分子量约42kD，存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁中，占细胞壁构成成分的约5%。A蛋白与动物IgG具有很强的亲和结合作用，每个A蛋白含有5个Fc片段结合部位。除IgG外，还与人IgG和人IgA也具有亲和结合作用，但较弱。凝集素lectin与糖特异性结合的蛋白质的总称(酶和抗体除外)，大部分凝集素为多聚体。如。常用做亲和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalin A,con A)与葡萄糖和甘露糖的亲和结合作用较强,麦芽凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)与N-乙酰
5、葡萄糖胺亲和结合作用较强。抗体抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数一般为107 1012mol/L。因此，利用以单抗为配基的免疫和色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子物质的有效手段。酶抑制剂可与酶的活性部位结合,但结合后抑制酶的活性。如1st 大分子抑制剂：如胰蛋白酶有胰脏蛋 白 酶 抑 制 剂 PTI、卵 粘 蛋 白(ovomucoid)和大豆胰蛋白酶抑制剂,STI)等,2nd 小分子抑制剂：如有苄脒、精氨酸和赖氨酸均可抑制胰蛋白酶的活性，并可作为亲和纯化胰蛋白酶的配基。6第6页/共41页5亲和配基辅酶和磷酸腺苷脱氢酶和激酶需要在辅酶co-enzyme的存在下表现其生物催化活性，即脱
6、氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。辅酶主要有辅酶I(NAD)、辅酶II(NADP)和ATP等。此外，AMP,ADP 的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，与脱氢和激酶同样具有Affinity。三嗪类色素三嗪类色素(triazine dyes)是一类分子内含有三嗪环的合成活性染料，与各种需要在NAD的存在下表现其生物活性的脱氢酶和激酶具有结合作用。这类结合具有抑制酶活性的作用。三嗪类色素还与白蛋白、INF、核酸酶和糖解酶等具有很高的亲和结合能力的.Cibacron Blue 3GA(又称Reactive Blue 2)是最常用的活性色素 过渡金属离子Cu2+、Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属
7、离子可与N，S和O等供电子原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸(His)的咪唑基、半胱氨酸(Cys)的巯基和色氨酸(Trp)的吲哚基发生亲和作用，其中以His的咪唑基发生亲和作用最强。过渡金属离子与 咪 唑 基 的 结 合 强 弱 顺 序 是Cu2+Ni2+Zn2+Co2+。肝素heparin是存在于哺乳动物脏器中的酸性多糖类物质，M为5-30kD，具有抗凝血作用。肝素与脂肪酶、甾体受体，限制性核酸内切酶、抗凝酶、凝血蛋白质等具有亲和作用.配基连接？配基连接？7第7页/共41页6配基连接溴化氰活化法固定配基：R-NH2应用：多糖凝胶的活化，适用于R-NH2型配基的修饰，如蛋白质配基IgG
8、方法：反应在碳酸盐buffer下进行，注意：CNBr剧毒药品，且具有挥发性，上述操作要在通风橱中进行至少二人在场急救药品 二价铁盐活化交连连接8第8页/共41页6配基连接环氧基活化法 应用对象：用于多糖凝胶和表面为氨基的载体的活化，固定分子结构为R-NH2、R-OH和R-SH的配基。步骤：1st 活化2nd 直接固化法反应速度很慢，所需固定化时间较长(24h以上)2nd 间接固定化法 环氧氯丙烷 活性环氧基 直接固化 活化：间接固定EDC9第9页/共41页6配基连接硅胶上连接活化-氨丙基三甲氧基硅烷 环氧丙基三甲氧基硅烷 活性氨基 活性环氧基 在酸溶液中环氧基发生二醇化反应 配基连接配基连接1
9、0第10页/共41页6配基连接金属配位 亚胺二乙酸iminodiacetic acid,IDA配基His性质独特:具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此His可与pro发生亲和合作用。在盐浓度较低的pH约等于目标pro的pI溶液中，固定化His亲和作用最强，随盐浓度，亲和作用。因此利用His为配基可分离pI相差较大的pro。空间位阻11第11页/共41页6 6配基连接间隔臂空间位阻：当较小的配基直接固定在载体下，会由于载体的空间位阴，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。办法：在配基与载体之间连接一个“间隔臂”(spacer)。间隔臂长度有一定限制，当间隔臂含有68个亚甲基(-CH2-)时亲
10、和力最大，亚甲基数超过8(长度1.0nm)时，亲和力下降。12第12页/共41页7亲和作用体系 高度特异性亲和体系抗原与其单克隆抗体的结合基本上是一对一的关系，即该单克隆抗体不能与其他抗原结合。群特异性亲和体系外源凝素可与任何含有糖基的蛋白质结合。13第13页/共41页148.亲和膜(AM)概述随着生物工程和生命科学的迅速发展，对生物大分子纯化分离的要求越来越迫切。近年来，膜分离技术的快速发展，对生物大分子的纯化分离是一个极大的推动。亲和膜将亲和色谱与膜分离技术结合起来的现货膜新成员。亲和膜分离的基本原理：u其原理与亲和色谱基本相同，主要是基于欲分离物质(或称配合物ligate)和键合在膜上的
11、亲和配位基(ligand)之间的生物特异相互作用，具有高度的选择性和专一性。这种相互作用可比喻为锁和钥匙之间的对应关系。u一个完整的亲和膜包括三种具有一定联系的物种：合适的基材、间隔臂(Spacer)和配位基。第14页/共41页158.亲和膜分离活化后的膜材料1与间隔臂分子2产生化学结合，生成带间隔臂的膜3；间隔臂膜3与具有生物特异性的亲和配位基4共价结合，生成带配位基的亲和膜5；多组分生物大分子混合物6通过亲和膜时，混合物中与亲和配基具有特异性相互作用的物质7与膜上的配位基产生相互作用，生成配合物质8而在膜上吸附，没有相互作用的物质9则通过膜；选用一种能与膜上的亲和配基产生相互作用的试剂10
12、通过膜或调节体系的pH、离子强度、温度等使形成的配合物解离而洗脱得到纯化好的物质11，膜上亲和配基则被顶替物质12占有；选用合适的洗涤试剂洗脱试剂分子12，使膜再生。第15页/共41页16生物大分生物大分子在亲和子在亲和膜上的分膜上的分离原理离原理洗脱膜亲和配位基间隔臂分子带配位基的亲和膜生物大分子混合物试剂纯化的产物顶替试剂分子第16页/共41页17 8.亲和膜分离 亲和膜的基质材料基质材料除了达到一般膜材料的要求即容易成膜，具有良好的化学和机械稳定性外，还要求与生物活性物质具有良好的相容性和耐细菌性，更主要的要有良好的化学反应性能，以便进行活化。基质材料 要求聚合物分子上含有-OH、NH2
13、、SH、COOH等。即纤维素、聚酰胺等的聚合物。基材活化方法：溴化氰法、双环氧烷法、高碘酸盐法等。第17页/共41页18 8.亲和膜分离亲和膜的间隔臂在分离相对分子质量很大的生物大分子时，为了克服几何位阻障碍，往往在介质和配位基之间插入一个具有一定几何长度的有机基团，即间隔臂（或空间臂），以使欲分离的物质方便地接近配位基上的亲和位点。理想的间隔臂应有一定的长度（至少含3个原子以上），且自身不带任何电荷，疏水性也不能太强，不带任何附加的活性中心。常用的间隔臂是含两个活泼氨基的二胺类物质，如乙二胺、丙二胺、己二胺、对苯二胺等；许多氨基酸和肽类物质也可作间隔臂。第18页/共41页19 8.亲和膜分离
14、亲和膜的配位基由于亲和分离是基于生物大分子和在基质材料上结合的配位基之间所发生的生物特异性相互作用，如酶与抑制剂或其底物，抗原与抗体等，所以，配位基的选择和使用特别重要。通用型配位基 包括外源凝集素、A蛋白、G蛋白、硼酸、辅酶、生物模拟染料、金属螯合物等。特异性配位基 包括酶和其底物或抑制剂，各种特异性免疫试剂（抗原抗体、细胞受体调节剂、单克隆抗体）。第19页/共41页20 8.亲和膜分离亲和膜的应用 医药制剂的生产和纯化。生物大分子的分离和浓缩。临床诊断和治疗 酶反应机理和基因工程研究等。第20页/共41页21 9 9 亲和萃取 （Affinity extraction）定义：利用偶联亲和配
15、基的PEG为成相聚合物进行的双水相萃取，在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。PEG/Dextran,PEG/无机盐第21页/共41页22亲和萃取纯化过程 亲和分配（进料），杂蛋白反萃取（清洗）目标产物反萃取（洗脱）。第22页/共41页239、亲和反胶团萃取、亲和反胶团萃取（Affinity-based reversed micellar extraction）定义：指在反胶团相中除通常的表面活性剂以外，添加另一种亲水头部为亲和配基的助表面活性剂（cosurfactant）；通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的
16、分配。第23页/共41页24亲和反胶团萃取过程亲和反胶团萃取过程第24页/共41页25反萃取反萃取第25页/共41页261010、亲和沉淀（Affinity precipitation）亲和沉淀:是生物亲和相互作用与沉淀分离相结合的生物大分子的分离纯化技术。一次作用亲和沉淀二次作用亲和沉淀第26页/共41页27一次作用亲和沉淀水溶性化合物分子上偶联有两个或两个以上的亲和配基双配基（bis-ligand）；多配基（polyligand）。双配基或多配基与含有两个以上亲和结合部位的多价蛋白质产生亲和交联，增大为较大的交联网络而沉淀。第27页/共41页28二次作用亲和沉淀 制备亲和沉淀介质:利用在物
17、理场改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基。亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。沉淀清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。第28页/共41页29可逆沉淀性聚合物 聚丙烯酰胺第29页/共41页30可逆沉淀性聚合物聚合脂质体（polymerized liposome,PLS）第30页/共41页31亲和沉淀纯化技术优点（1）溶液中进行，无扩散传质阻力，亲和结合速度快；（2）亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高；（3）离心或过滤技术回收沉淀，规模放大；（4）可用于高粘度或含微粒料液中目
18、标产物纯化。第31页/共41页10.4 分子印迹技术-原理介绍第32页/共41页分子印迹技术（MIT）的起源Pauling 锁匙理论（理论基础）Dickey 专一性吸附（萌芽）Wulff 首次合成（形成标志）Mosbach 茶碱分子印迹聚合物（发展）Lund University 成立分子印迹学会（Society for Molecular Imprinting，SMI）33第33页/共41页分子印迹技术的基本原理分子印迹技术是指制备对某一特定的目标分子(模板分子、印迹分子或烙印分子)具特异选择性的聚合物技术。三大特点：构效预订性、特异识别性、广泛适用性 制备过程：(1)印迹分子与功能单体结合
19、-主客体配合物。(2)功能单体与交联剂共聚-固定主客体配合物。(3)脱去印迹分子。34第34页/共41页分子印迹技术的基本原理 PrearrangementPolymerizationExtraction35第35页/共41页分子印迹技术的分类（p208）预组织法（共价法）Wulff 结合方式：可逆共价键 优点：空间精确固定排列自组装法（非共价法）Mosbach 结合方式：非共价键 优点：简单易行 模板容易除去 近似天然牺牲空间法（两者兼备）Vulfson 36第36页/共41页分子印迹聚合物的制备方法(p210)37制备过程：制备过程：1)功能单体的选择功能单体的选择 2）聚合反应）聚合反应
20、 3）印迹分子的去除）印迹分子的去除 4）后处理后处理理想的理想的MIP的特点的特点：1）刚性）刚性 2）柔性）柔性 3）印迹位点的的可接近性）印迹位点的的可接近性 4)机械强度和热稳定性机械强度和热稳定性第37页/共41页MIPs的链引发方式和聚合方法（p211）本体聚合（包埋）：最常用分散聚合：在有机溶剂中沉淀聚合：制备繁琐悬浮聚合：全氟代碳液做悬浮剂表面印记：新方法，乳液界面处结合原位聚合:在色谱柱或管内38第38页/共41页通过非共价键将印迹分子固定。洗脱后留下的空腔有特定选择性。39第39页/共41页分子印迹技术的应用 色谱技术 固相萃取 膜分离 传感器敏感材料 高效毛细管电泳(HPCE)40第40页/共41页41谢谢大家观赏！第41页/共41页