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1、关于酶的分离纯化(4)现在学习的是第1页，共48页要点：l酶主要还是蛋白质，能用于蛋白质的分酶主要还是蛋白质，能用于蛋白质的分离纯化方法通常可用于酶。离纯化方法通常可用于酶。l要尽量减少酶活损失。要尽量减少酶活损失。l要分清是胞内酶还是胞外酶要分清是胞内酶还是胞外酶l根据酶的用途采用不同的方法根据酶的用途采用不同的方法现在学习的是第2页，共48页3.1 酶分离纯化流程酶原液否胞内酶细胞破碎提取分离浓缩干燥预处理细胞分离现在学习的是第3页，共48页3.2 酶纯度的评价l总活力的回收率总活力的回收率l比活力提高的倍数比活力提高的倍数l酶的纯度酶的纯度实用价值侧重科研现在学习的是第4页，共48页3.
2、2.1 酶总活力回收率与提纯倍数1 总活力的回收率：反映提纯过程酶活总活力的回收率：反映提纯过程酶活力的损失情况。力的损失情况。总活力的回收率总活力的回收率纯化后总活力纯化后总活力/纯化前总活力纯化前总活力*100%2 提纯倍数：反映纯化方法的效率提纯倍数：反映纯化方法的效率纯化倍数纯化后的比活纯化倍数纯化后的比活/纯化前的比活纯化前的比活现在学习的是第5页，共48页示例：腺苷酸激酶纯化表（6kg猪肉）纯化步骤 总体积 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 抽提 16600 43500 0.0413 0.95 1 100ml mg katal katal/kg%调pH 15700 1120
3、0 3.25层析 1380 1716 13.02凝胶过滤 211 462 43.17 结晶 -344 46.5现在学习的是第6页，共48页3.2.2 酶的纯度检验l注意标明使用何种方法检验的注意标明使用何种方法检验的.l不同方法检验的纯度可能不一致。如电泳纯、层析纯、不同方法检验的纯度可能不一致。如电泳纯、层析纯、HPLC纯。纯。现在学习的是第7页，共48页常用的检验酶纯度的方法方法特点超速离心 检测杂质检测杂质5%时不太满意，不适合络合解离体系时不太满意，不适合络合解离体系电泳 必须在多种必须在多种pH值下进行，单一值下进行，单一pH两种酶可能一两种酶可能一起移动起移动SDS电泳 可测出分子
4、量，多亚基时会出现多条区带可测出分子量，多亚基时会出现多条区带等电聚焦 检测杂的极灵敏方法，有时会出现表观异质现象检测杂的极灵敏方法，有时会出现表观异质现象N末端分析 只适用于一条肽链只适用于一条肽链免疫技术 高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦现在学习的是第8页，共48页3.3分离与纯化l分离（提取）：分离（提取）：在一定条件下，用适当的溶剂在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中。处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中。l纯化：纯化：通常先根据溶解度性质用沉淀的方法（如通常先根据溶解度性质用沉淀的方法（如盐析、有机溶剂沉淀等），制得粗酶，再根
5、据酶盐析、有机溶剂沉淀等），制得粗酶，再根据酶分子的大小、电荷性质、亲和专一性，将酶纯化。分子的大小、电荷性质、亲和专一性，将酶纯化。现在学习的是第9页，共48页3.3.1 细胞破碎的方法l机械破碎法机械破碎法l物理破碎法物理破碎法l化学破碎法化学破碎法l酶促破碎法酶促破碎法P72-73现在学习的是第10页，共48页3.3.2酶提取的方法l盐溶液提取法盐溶液提取法l酸溶液提取法酸溶液提取法l碱溶液提取法碱溶液提取法l有机溶剂提取法有机溶剂提取法p76根据酶的溶解性质，选择适当的溶剂。根据酶的溶解性质，选择适当的溶剂。现在学习的是第11页，共48页3.3.3影响酶提取的主要因素1提取目标提取目标
6、:提高提取率减少酶活损失。提高提取率减少酶活损失。1)温度：温度过高易导至酶失活，应控制在温度：温度过高易导至酶失活，应控制在010，对于稳定性高的酶提高温度有利于提取。，对于稳定性高的酶提高温度有利于提取。2）pH:pH应远离等电点以提高溶解度，但应远离等电点以提高溶解度，但pH不宜不宜过高或过低，防止酶失活。过高或过低，防止酶失活。3)提取液用量：用量增加，提取率增加但分离成本提取液用量：用量增加，提取率增加但分离成本提高。一般为原液的提高。一般为原液的3-5倍倍4)添加保护剂：加入适量的酶作用底物、辅酶或添加保护剂：加入适量的酶作用底物、辅酶或抗氧化剂可以提高酶稳定性，减少酶活损失。抗氧
7、化剂可以提高酶稳定性，减少酶活损失。现在学习的是第12页，共48页1分离过程中新设备、新技术的应用会取得事半功分离过程中新设备、新技术的应用会取得事半功倍的效果。如离心机、过滤机的选择。采用膜分倍的效果。如离心机、过滤机的选择。采用膜分离技术等。离技术等。2.浓缩与干燥过程尽量使用低温过程减少酶失活，浓缩与干燥过程尽量使用低温过程减少酶失活，同时可添加一些保护剂以减少酶失活。同时可添加一些保护剂以减少酶失活。提取时的注意事项提取时的注意事项现在学习的是第13页，共48页3.4 沉淀分离沉淀分离方法：沉淀分离方法：l盐析沉淀盐析沉淀l等电点沉淀等电点沉淀l有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀l复合沉淀复合沉
8、淀l选择性变性剂沉淀选择性变性剂沉淀现在学习的是第14页，共48页3.5 离心分离l借助于离心机旋转所产生的离心力，使借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小密度的物质分离的技术。不同大小密度的物质分离的技术。常用于：细胞收集、细胞碎片和沉淀的常用于：细胞收集、细胞碎片和沉淀的分离及酶的纯化。分离及酶的纯化。选择离心分离注意选择适当的离心机、选择离心分离注意选择适当的离心机、离心方法离心条件。离心方法离心条件。现在学习的是第15页，共48页3.5.1 离心机的种类和用途常速离心机常速离心机：转速在8000r/min内高速离心机高速离心机：转速在1x1042.5x104r/min内,高速离心会
9、导致温度升高因为防止酶等失活，有的装有冷冻装置。超速离心机超速离心机：转速在2.5x1048x104 r/min内，都装有冷冻装置，和其它一些控制系统。现在学习的是第16页，共48页常速离心机现在学习的是第17页，共48页高速离心机现在学习的是第18页，共48页超速离心机现在学习的是第19页，共48页l超速离心机又可分为制备用超速离心机，超速离心机又可分为制备用超速离心机，分析用超速离心机，分析制备两用超速分析用超速离心机，分析制备两用超速离心机。离心机。分析用超速离心机可用于样品纯度的检分析用超速离心机可用于样品纯度的检测、沉降系数和分子量的测定。分析用测、沉降系数和分子量的测定。分析用超速
10、离心机一般都装有光学检测系统，超速离心机一般都装有光学检测系统，自动记录仪和数据处理系统等自动记录仪和数据处理系统等。现在学习的是第20页，共48页沉降系数l单位离心力作用下，粒子的沉降速度。单位离心力作用下，粒子的沉降速度。Svedberg,S=1x10-13s角速度，t2-t1离心时间，X1,X2粒子距中心轴的距离现在学习的是第21页，共48页3.5.2 离心方法的选择p82l常速和高速离心机只要选择合适的速度常速和高速离心机只要选择合适的速度和时间就可以了而对于超速离心机离心和时间就可以了而对于超速离心机离心方法可分为方法可分为差速离心差速离心、密度梯度离心密度梯度离心和和等密度梯度离心
11、等密度梯度离心。现在学习的是第22页，共48页1、差速离心l采用不同的采用不同的离心速度离心速度和和离心时间离心时间，使沉，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。降速度不同的颗粒分批分离的方法。主要用于分离大小和密度差异较大的颗主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。操作简单方便，但分离效果较差，粒。操作简单方便，但分离效果较差，并使沉降的颗粒受到挤压。并使沉降的颗粒受到挤压。现在学习的是第23页，共48页2、密度梯度离心p82l是样品在密度梯度介质中进行离心的方是样品在密度梯度介质中进行离心的方法。能使沉降系数比较接近的物质得以法。能使沉降系数比较接近的物质得以分离。分离。01n01。n线性梯度
12、离心还有凹形梯度和凸形梯度。不同大小和形状的颗粒在密度梯度溶夜中形成若干条界面清楚的区带现在学习的是第24页，共48页密度梯度系统l可在溶剂中加入一定的溶质制成密度梯可在溶剂中加入一定的溶质制成密度梯度系统。要求介质有足够大的溶解度，度系统。要求介质有足够大的溶解度，不与组分反应，且不会引起分离组分的不与组分反应，且不会引起分离组分的凝集、变性或失活。常用的介质有蔗糖凝集、变性或失活。常用的介质有蔗糖和甘油。蔗糖的梯度范围为：浓度和甘油。蔗糖的梯度范围为：浓度5%60%，密度为，密度为1.021.30g/cm3现在学习的是第25页，共48页3、等密度梯度离心p83l当分离组分的密度当分离组分的
13、密度i时下沉，而=i颗粒停留在该处形成区带。使得待分离的物质处于离心介质等密度处i形成区带的离心方法。要求溶液的密度比较大要等于分离组分的密度，因此常用銫盐如CsCl、Cs2SO4、CsBr等l当分离组分的密度已知则可直接用等密度离心而不用梯度。现在学习的是第26页，共48页3.5.3 离心条件的确定l离心力离心力l离心时间离心时间l温度和温度和pH：防止酶凝集、变性和失活。：防止酶凝集、变性和失活。温度通常在低温下进行，高速和超速离温度通常在低温下进行，高速和超速离心必须采用冷冻系统，防止发热。心必须采用冷冻系统，防止发热。pH应控制在酶稳定的范围内，同时要尽量应控制在酶稳定的范围内，同时要
14、尽量不采用过酸或过碱溶液，避免对转子或不采用过酸或过碱溶液，避免对转子或离心机腐蚀。离心机腐蚀。现在学习的是第27页，共48页3.6 电泳l主要用于酶的纯度鉴定、酶分子量测定、主要用于酶的纯度鉴定、酶分子量测定、酶等电点测定及小批量酶的分离纯化。酶等电点测定及小批量酶的分离纯化。常用的是凝胶电泳和等电聚焦电泳。常用的是凝胶电泳和等电聚焦电泳。现在学习的是第28页，共48页电泳仪现在学习的是第29页，共48页3.6.1 凝胶电泳l以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。同时具有电泳和分子持体的电泳技术。同时具有电泳和分子筛的双重作用。筛的双重作用。常用
15、的支持体是聚丙烯酰胺凝胶常用的支持体是聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)连续凝胶电泳连续凝胶电泳不连续凝胶电泳不连续凝胶电泳：具浓缩作用浓度梯度凝胶电泳浓度梯度凝胶电泳:用于测定球蛋白的分子量SDS-凝胶电泳凝胶电泳现在学习的是第30页，共48页1 不连续凝胶电泳l分成三层：样品胶、浓缩胶、分离胶。分成三层：样品胶、浓缩胶、分离胶。特别适用于稀溶液的分离。特别适用于稀溶液的分离。-+样品胶浓缩胶分离胶现在学习的是第31页，共48页2、SDS-凝胶电泳l制备凝胶时加入制备凝胶时加入12%的十二烷基硫酸的十二烷基硫酸钠，制成钠，制成SDS-凝胶。凝胶。现在学习的是第32页，共48页3.6.2 等电聚焦电泳
16、l在电泳系统中加入两性电解质载体在电泳系统中加入两性电解质载体,通通电后在电场中形成一个由阳极到阴极连电后在电场中形成一个由阳极到阴极连续增高的续增高的pH梯度。待分离组分在电场梯度。待分离组分在电场作用下移动到与其等电点相当的作用下移动到与其等电点相当的pH位位置上，使不同等电点的物质分离。置上，使不同等电点的物质分离。现在学习的是第33页，共48页特点l分辨率高：可分开等电点相差分辨率高：可分开等电点相差0.010.02pH的蛋白质。的蛋白质。l克服了电泳的扩散作用：时间越长区带克服了电泳的扩散作用：时间越长区带越窄。越窄。l与点样位置关系不大：不论点在何处都与点样位置关系不大：不论点在何
17、处都可以聚焦到等电点位置。可以聚焦到等电点位置。l重现性好重现性好l可分离很稀的样品可分离很稀的样品l可准确测定蛋白质或多肽的等电点。可准确测定蛋白质或多肽的等电点。对等电点处不溶解或发生变性的蛋白质不适用对等电点处不溶解或发生变性的蛋白质不适用现在学习的是第34页，共48页载体两性电解质要求p107l在等电点状态下有足够的缓冲能力，以便控制好在等电点状态下有足够的缓冲能力，以便控制好pH梯度。梯度。l在等电点状态下有足够的导电能力，以便使一定在等电点状态下有足够的导电能力，以便使一定的电流通过。而且要求各个等电点不同的两性电的电流通过。而且要求各个等电点不同的两性电解质有相同的导电系数，使整
18、个体系导电均匀。解质有相同的导电系数，使整个体系导电均匀。l比待分离组分的分子量小，以便在等电聚焦后易于比待分离组分的分子量小，以便在等电聚焦后易于分离。分离。l化学组分与待分离组分不同，且与样品中各组化学组分与待分离组分不同，且与样品中各组分不相互作用分不相互作用。现在学习的是第35页，共48页等电聚焦电泳槽现在学习的是第36页，共48页3.6.3 毛细管电泳现在学习的是第37页，共48页现在学习的是第38页，共48页主要优点分析条件选择简便及分离的高效性。分析条件选择简便及分离的高效性。当改当改变变2或或3个数据时个数据时,(例如缓冲剂的例如缓冲剂的pH值值,或浓度值或浓度值)可以在很可以
19、在很大程度上提高分离的效率和选择性。在强电场的作用大程度上提高分离的效率和选择性。在强电场的作用下下,毛细管内液体分离的效率可达到毛细管内液体分离的效率可达到2,000,000理论的理论的塔板数塔板数(同液相色谱法相比同液相色谱法相比,色谱柱的分离不超过色谱柱的分离不超过60,000-100,000理论的塔板数理论的塔板数)。现在学习的是第39页，共48页可靠性可靠性.由于此方法不使用固体物质由于此方法不使用固体物质,排除了毛细管排除了毛细管老化老化的可能性的可能性,同时不与样品发生任何物理化学反同时不与样品发生任何物理化学反应应,从而避免了毛细管的经常性损耗从而避免了毛细管的经常性损耗,降低
20、了毛细管电降低了毛细管电泳仪的成本。泳仪的成本。时间短时间短,价格低廉。价格低廉。毛细电泳的高效分离毛细电泳的高效分离,使样品使样品的准备工作降到最低程度的准备工作降到最低程度,节省了试剂的消耗。同时节省了试剂的消耗。同时,由于由于在毛细管中直接进行检测在毛细管中直接进行检测,致使分析时间缩短为致使分析时间缩短为10-15分钟。分钟。现在学习的是第40页，共48页3.7 酶的结晶l结晶是溶质以晶体的形式从溶液中解析结晶是溶质以晶体的形式从溶液中解析出的过程出的过程.结晶意义结晶意义:可以提高纯度可以提高纯度,获得较高纯度的获得较高纯度的酶酶;同时有些物理性质的研究需要结晶同时有些物理性质的研究
21、需要结晶的酶。如的酶。如X射线晶体衍射测结构。射线晶体衍射测结构。结晶条件：通常要求酶的纯度足够，且结晶条件：通常要求酶的纯度足够，且不同的酶对纯度的要求不一样；酶的浓不同的酶对纯度的要求不一样；酶的浓度合适，太低不产生结晶、太高晶体小度合适，太低不产生结晶、太高晶体小不易长大。还要控制好温度、不易长大。还要控制好温度、pH、离、离子强度等。子强度等。现在学习的是第41页，共48页常用的结晶方法：盐析结晶法：加盐降低溶解度有机溶剂结晶法：加有机溶剂，含盐少，时间短，加有机溶剂，含盐少，时间短，但要注意防止变性。但要注意防止变性。透析平衡结晶法改变溶解度改变溶解度等电点结晶法:调节调节pH达到达
22、到PI,注意防止局布过注意防止局布过酸或碱常配合透析平衡、扩散法。酸或碱常配合透析平衡、扩散法。温度差法结晶 金属离子复合结晶法 现在学习的是第42页，共48页透析平衡法现在学习的是第43页，共48页3.8浓缩与干燥现在学习的是第44页，共48页一浓缩 l从低浓度酶液中去除部分水或其它有机从低浓度酶液中去除部分水或其它有机溶剂而成为高浓度溶液的过程。溶剂而成为高浓度溶液的过程。为防止酶变性失活要求低温或快速，常为防止酶变性失活要求低温或快速，常用的有真空蒸发器用的有真空蒸发器(低温）和薄膜蒸发低温）和薄膜蒸发器。器。(快速）快速）现在学习的是第45页，共48页真空蒸发器优点是低温，酶不易失活优点是低温，酶不易失活现在学习的是第46页，共48页薄膜蒸发器该蒸发器具有生产能力大、效率高、物料该蒸发器具有生产能力大、效率高、物料受热时间短等特点受热时间短等特点 该蒸发器具有生产能力大、效率高、物料该蒸发器具有生产能力大、效率高、物料受热时间短等特点受热时间短等特点 现在学习的是第47页，共48页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第48页，共48页