植物组织培养的基本技术讲稿.ppt

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1、关于植物组织培养的基本技术第一页，讲稿共七十八页哦第一节第一节 实验室结构、仪器设备及操作技术实验室结构、仪器设备及操作技术第二节第二节 培养基的组成、配制与灭菌培养基的组成、配制与灭菌第三节第三节 植物离体培养体系的建立植物离体培养体系的建立 本章内容本章内容第二页，讲稿共七十八页哦一、植物组织培养实验室的结构及设计要求：一、植物组织培养实验室的结构及设计要求：准备室准备室;无菌操作室无菌操作室;培养室培养室;温室；温室；细胞学实验室细胞学实验室第一节第一节 实验室结构、仪器设备及操作技术实验室结构、仪器设备及操作技术第三页，讲稿共七十八页哦（一）准备室：（一）准备室：1.主要功能：用于培养

2、器皿的清洗、培养基的配制、主要功能：用于培养器皿的清洗、培养基的配制、分装和灭菌、试管苗的出瓶及整理等工作。分装和灭菌、试管苗的出瓶及整理等工作。2.主要仪器设备及用品：主要仪器设备及用品：冰箱、天平、高压灭菌锅、冰箱、天平、高压灭菌锅、pH计、干燥箱、实验台、水计、干燥箱、实验台、水槽、凉干架、药品柜、离心机、水浴锅、微波炉、电炉、磁力槽、凉干架、药品柜、离心机、水浴锅、微波炉、电炉、磁力搅拌器、蠕动泵、移液器、各种玻璃器皿（烧杯、量筒、容量搅拌器、蠕动泵、移液器、各种玻璃器皿（烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶、三角瓶等）及培养基分装用品等。瓶、试剂瓶、三角瓶等）及培养基分装用品等。第四页，讲稿共

3、七十八页哦百分之一天平百分之一天平千分之一天平千分之一天平万分之一天平万分之一天平第五页，讲稿共七十八页哦各种型号的高压灭菌锅各种型号的高压灭菌锅第六页，讲稿共七十八页哦 移液器移液器第七页，讲稿共七十八页哦（二）接种室（无菌操作室）：（二）接种室（无菌操作室）：1、功能：植物材料的灭菌、接种以及培养物的继、功能：植物材料的灭菌、接种以及培养物的继代转接等。代转接等。接种室要求保持洁净，与化学实验室接种室要求保持洁净，与化学实验室之间应设置缓冲室。之间应设置缓冲室。2、仪器设备及用品：、仪器设备及用品：超净工作台、紫外灯、小推车、搁架、磁盘、接种工具超净工作台、紫外灯、小推车、搁架、磁盘、接种

4、工具（各种镊子、解剖刀、手术剪、普通剪刀接种针、酒精灯、（各种镊子、解剖刀、手术剪、普通剪刀接种针、酒精灯、手持喷雾器、细菌过滤器等）等。手持喷雾器、细菌过滤器等）等。第八页，讲稿共七十八页哦超净工作台超净工作台第九页，讲稿共七十八页哦（三）培养室：（三）培养室：1、功能：主要用于植物材料的培养。要求室内洁、功能：主要用于植物材料的培养。要求室内洁净并能保持一定的温度、光照以及湿度以适合植物净并能保持一定的温度、光照以及湿度以适合植物材料的生长和分化。材料的生长和分化。2、仪器设备及用品：、仪器设备及用品：培养架及灯管、摇床（振荡器）、空调、自动培养架及灯管、摇床（振荡器）、空调、自动定时器、

5、加湿及除湿器、光照培养箱、温湿度计定时器、加湿及除湿器、光照培养箱、温湿度计等。等。第十页，讲稿共七十八页哦培养架培养架第十一页，讲稿共七十八页哦光照培养箱光照培养箱第十二页，讲稿共七十八页哦恒温振荡器恒温振荡器 多用振荡器多用振荡器第十三页，讲稿共七十八页哦（四）细胞学实验室：（四）细胞学实验室：1、功能：主要用于培养材料的显微观察及照、功能：主要用于培养材料的显微观察及照相等。相等。2、仪式设备及用品：、仪式设备及用品：体视显微镜、普通显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜、体视显微镜、普通显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜、配套显微照相装置、普通相机或数码相机、切片机及配套配套显微照相装置、普通相机

6、或数码相机、切片机及配套制片及染色用品等制片及染色用品等。第十四页，讲稿共七十八页哦体视显微镜体视显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜倒置显微镜倒置显微镜倒置荧光显微镜倒置荧光显微镜第十五页，讲稿共七十八页哦二、实验室基本操作：二、实验室基本操作：（一）洗涤：（一）洗涤：1、普通器皿：采用洗衣粉、洗洁精等中性洗涤剂、普通器皿：采用洗衣粉、洗洁精等中性洗涤剂洗涤。洗涤。2、难清洗器皿及移液管等：用水清洗后再用重、难清洗器皿及移液管等：用水清洗后再用重铬酸钾洗液浸泡，最后清水冲洗，或用超声波仪铬酸钾洗液浸泡，最后清水冲洗，或用超声波仪清洗。清洗。第十六页，讲稿共七十八页哦（二）灭菌：（二）灭菌：1、

7、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。（1）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，150 保温保温2小时，成本较高。小时，成本较高。（2）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌锅内）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌锅内120 15-20min15-20min。（3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。第十七页，讲稿共七十八页哦2、培养基灭菌：、培养基灭菌：采用高压蒸汽灭菌，采用高压蒸汽灭菌，120 1520min

8、。培养基体积越大，。培养基体积越大，灭菌时间越长。灭菌时间越长。3、不耐高温化合物：、不耐高温化合物：采用过滤灭菌，如采用过滤灭菌，如IAA等。等。4、外植体的表面灭菌：、外植体的表面灭菌：采用采用7075乙醇（乙醇（10-30秒）、有效氯秒）、有效氯1的次氯酸钠的次氯酸钠（5-30分钟）、分钟）、0.10.2%的氯化汞（的氯化汞（2-15分钟）等。杀菌剂分钟）等。杀菌剂中加入几滴吐温中加入几滴吐温20或或80（Tween20或或80）效果较好。）效果较好。第十八页，讲稿共七十八页哦（三）无菌操作：（三）无菌操作：1、保持接种室的无污染环境，定期熏蒸或喷雾处理，、保持接种室的无污染环境，定期熏

9、蒸或喷雾处理，进行消毒。接种前打开超净工作台及紫外灯照射进行消毒。接种前打开超净工作台及紫外灯照射20-30min，关闭紫外等灯后使气体散出后开始操作。，关闭紫外等灯后使气体散出后开始操作。2、保持超净工作台的洁净：接种前用、保持超净工作台的洁净：接种前用70乙醇擦乙醇擦拭台面或用喷壶喷雾，操作前，将手和手臂用拭台面或用喷壶喷雾，操作前，将手和手臂用70乙乙醇消毒，所需试验用品用乙醇擦拭后放入超净工作醇消毒，所需试验用品用乙醇擦拭后放入超净工作台。台。第十九页，讲稿共七十八页哦3、点燃酒精灯，进行操作，接种材料前后，灼烧瓶口，、点燃酒精灯，进行操作，接种材料前后，灼烧瓶口，工具要灼烧彻底，防止

10、交叉污染。工具要灼烧彻底，防止交叉污染。4、保持接种室的洁净，发现污染及时挑出，并在灭菌、保持接种室的洁净，发现污染及时挑出，并在灭菌后清洗，以减少污染源。后清洗，以减少污染源。5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接种室、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接种室换拖鞋以保持接种室的洁净。换拖鞋以保持接种室的洁净。第二十页，讲稿共七十八页哦 第二节第二节 培养基的组成、配制与灭菌培养基的组成、配制与灭菌第二十一页，讲稿共七十八页哦一、培养基的组成和作用一、培养基的组成和作用 培养基（培养基（mediummedium）是植物组织培养的重要材料，是外植）是植物组织培养的重要材料，是外植体生长的

11、营养物质，只有配制出适宜的培养基，才能使组体生长的营养物质，只有配制出适宜的培养基，才能使组织培养获得成功。织培养获得成功。通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，即通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，即矿质营养、有机成分、植物生长调节剂、碳源、琼脂以及矿质营养、有机成分、植物生长调节剂、碳源、琼脂以及其他附加物等。其他附加物等。培养基的主要指标是营养成分及植物生长调节物质的浓培养基的主要指标是营养成分及植物生长调节物质的浓度。度。第二十二页，讲稿共七十八页哦 培培养养基基成成分分 水水 植物激素植物激素 碳源碳源 有机物（维生素、肌醇、氨基酸）有机物（维生素、肌醇、氨基酸）培

12、养体支持材料培养体支持材料 辅助性物质辅助性物质 无机盐（大量元素、微量元素、铁盐）无机盐（大量元素、微量元素、铁盐）第二十三页，讲稿共七十八页哦 碳源碳源 碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在10-50g/L10-50g/L，此外果糖、，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。于植物组织培养

13、。但在胚培养时采用但在胚培养时采用40-150g/L的高浓度，的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用因蔗糖对胚状体的发育起重要作用 糖浓度高低直接影响形态建成。糖浓度高低直接影响形态建成。第二十四页，讲稿共七十八页哦无无 机机 盐盐 元素名称元素名称 添加形式添加形式 N KNO3,NH4NO3大量大量 P KH2PO4 NaH2PO4元素元素 K KCl KNO3(0.5mmol/L)Ca CaCl2 2H2O Mg Mg2SO4 7H2O S Mg2SO4 7H2O Fe FeNa2-EDTA微量微量 B H3BO3元素元素 Mn MnSO4(0.5mmol/L)Cu CuSO4 Mo

14、Na2MoO4 2H2O Cl CaCl2 2H2O第二十五页，讲稿共七十八页哦种类：种类：VB1（盐酸硫胺素盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇）、）、Vpp（烟酸烟酸）、）、Vc(抗坏血酸抗坏血酸）浓度：浓度：0.1-1.0mg/L作用：作用：VB1促愈伤组织产生，提高活力促愈伤组织产生，提高活力 VB6 促根生长促根生长 Vpp与代谢和胚发育有关与代谢和胚发育有关 Vc防组织褐变防组织褐变维生素维生素第二十六页，讲稿共七十八页哦肌醇肌醇 (又叫环己六醇又叫环己六醇）能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用

15、，对细对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。胞壁的形成也有作用。使用浓度一般为使用浓度一般为5050lOOmglOOmgL L第二十七页，讲稿共七十八页哦氨基酸氨基酸(almino acide)(almino acide)培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、冬酰胺、丙氨酸等也常用，用量在丙氨酸等也常用，用量在1 1-3-3mgmgL L之之间。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，用量在间。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，用量在10101000mg1000

16、mgL L之间。由于它们营养丰富，极之间。由于它们营养丰富，极易引起污染易引起污染。第二十八页，讲稿共七十八页哦1 1、生长素类、生长素类(auxin)(auxin)（1 1）IAA(IAA(吲吲哚哚乙乙酸酸)是是生生长长素素中中活活力力最最弱弱的的激激素素，对对器器官官形形成成的的副副作作用用小小，高高温温高高压压易易被被破破坏坏，也也易易被被细细胞胞中中的的1AA1AA分分解解酶酶降降解解，受受光也易分解。光也易分解。（2 2）NAA(NAA(萘乙酸萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比在组织培养中的起动能力要比IAAIAA高出高出3 34 4倍，耐高倍，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较

17、普遍。温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAANAA和和IBAIBA广泛用于生广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。（3 3）IBA(IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。是促进发根能力较强的生长调节物质。（4 4）2,4-D(2,4-22,4-D(2,4-2氯苯氧乙酸氯苯氧乙酸)起动能力比起动能力比IAAIAA高高1010倍，特别在促进愈伤组织倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量

18、常有毒效应。量范围较狭窄，过量常有毒效应。植物激素植物激素第二十九页，讲稿共七十八页哦2 2、细胞分裂素类、细胞分裂素类 (cytokinin)(cytokinin)（1 1）6-BA(6-6-BA(6-苄基氨基嘌呤苄基氨基嘌呤）应用广，人工合成。应用广，人工合成。（2 2）Zt(zeatin Zt(zeatin 玉米素玉米素)是一种活性最大的天然是一种活性最大的天然细胞分裂细胞分裂素素，效果显著，效果显著，但非常昂贵但非常昂贵。（3 3）Kt(Kt(糠基腺糠基腺嘌呤嘌呤）功能：功能：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂与扩大。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分

19、化抑制根的分化第三十页，讲稿共七十八页哦 3 3、GA(gibberellic acidGA(gibberellic acid赤霉素赤霉素)培培养养基基中中添添加加的的是是GAGA3 3，主主要要用用于于促促进进幼幼苗苗茎茎的的伸伸长长生生长长，促促进进不不定定胚胚发发育育成成小小植植株株；赤赤霉霉素素和和生生长长素素协协同同作作用用，对对形形成成层层的的分分化化有有影影响响，当当生生长长素素/赤赤霉霉素素比比值值高高时时有有利利于于木木质质部部分分化化，比比值值低低时时有利于韧皮部分化。有利于韧皮部分化。第三十一页，讲稿共七十八页哦 高高 有利于根的形成和愈伤组织有利于根的形成和愈伤组织 生

20、长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素 适中适中 有利于根芽的分化有利于根芽的分化 低低 有利于芽的形成有利于芽的形成 生长调节物质的使用甚微，一般用生长调节物质的使用甚微，一般用mgmgL L表示浓度。一般生长表示浓度。一般生长素浓度的使用为素浓度的使用为0.050.055mg5mgL L，细胞分裂素，细胞分裂素0.050.0510mg10mgL L。第三十二页，讲稿共七十八页哦培养体支持材料培养体支持材料1.1.琼脂琼脂A A 用量用量7 710g/L10g/LB B 新买应试凝固力新买应试凝固力2.2.其它其它玻璃纤维滤纸桥海绵等玻璃纤维滤纸桥海绵等第三十三页，讲稿共七十八页哦辅助性物质辅助性

21、物质抗生素抗生素抗氧化物抗氧化物活性炭活性炭天然复合物天然复合物第三十四页，讲稿共七十八页哦1.1.常用种类：常用种类：青霉素链霉素青霉素链霉素 庆大霉素等庆大霉素等2.2.用量：用量：5 520%20%3.3.注意：注意：抗生素对组织生长有抑制抗生素对组织生长有抑制作用，使用要慎重作用，使用要慎重 抗生素抗生素第三十五页，讲稿共七十八页哦抗氧化物抗氧化物常用抗氧化剂及使用：常用抗氧化剂及使用：半胱氨酸、半胱氨酸、VC（50200mg/L液洗涤外液洗涤外植体伤口表面）。植体伤口表面）。活性炭活性炭1.1.作用：作用：具吸附作用；茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增具吸附作用；茎尖初代培养可防褐化；

22、促进新梢增殖（浓度殖（浓度0.1-0.2%0.1-0.2%）；促进生根；防止组培苗玻璃化（浓度）；促进生根；防止组培苗玻璃化（浓度0.3%0.3%）。利于胚胎培养。）。利于胚胎培养。2.2.常用浓度：常用浓度：0.5-10g/L0.5-10g/L3.3.注意：注意：活性炭具副作用。活性炭具副作用。第三十六页，讲稿共七十八页哦椰椰乳乳：一一般般使使用用浓浓度度在在1 10 00 0200ml200mlL L 它它在在愈愈伤伤组组织织和和细细胞胞培培养养中中有有促促进进作作用用。在在马马铃铃薯薯茎茎尖尖分分生生组组织织和和草草莓莓微微茎茎尖尖培培养养中中起起明明显显的的促促进作用进作用。香香蕉蕉：

23、用用量量为为1 10 00 0200ml200mlL L。用用黄黄熟熟的的小小香香蕉蕉，加加入入培培养养基基后后变变为为紫紫色色。对对pHpH值的缓冲作用大。主要在值的缓冲作用大。主要在兰花兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。的组织培养中应用，对发育有促进作用。马铃薯马铃薯(potato)(potato)：去掉皮和芽后，加水煮去掉皮和芽后，加水煮30min30min，再经过过滤，取其，再经过过滤，取其滤液使用。用量为滤液使用。用量为150150200g200gL L，对，对pHpH值缓冲作用也大，添加后可值缓冲作用也大，添加后可得到健壮的植株。得到健壮的植株。水解酪蛋白水解酪蛋白：为蛋白质

24、的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100100200mg200mgL L。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。天然复合物天然复合物第三十七页，讲稿共七十八页哦 培培养养基基种种类类 MS培养基培养基 B5培养基培养基White培养基培养基 N6培养基培养基KM-8P培养基培养基 基本培养基基本培养基 二、培养基的类型：二、培养基的类型：第三十八页，讲稿共七十八页哦N6培养基特点：培养基特点：成分简单成分简单KNO3 和和(NH4)2SO4含量高含量高适合花药培养适合花药培养White培养基特点：培养基特点：无

25、机盐量较低，适合生根培养无机盐量较低，适合生根培养第三十九页，讲稿共七十八页哦B5培养基培养基 特点：特点：含较低的铵含较低的铵双子叶植物双子叶植物 尤其木本植物组培可选择尤其木本植物组培可选择 MS培养基特点：培养基特点：无机盐、离子无机盐、离子 浓度高，硝酸盐含量较浓度高，硝酸盐含量较高高。有机成分复杂有机成分复杂用于原生质体培养用于原生质体培养(包括原生质融合的培养包括原生质融合的培养)KM-8PKM-8P培养基特点：培养基特点：第四十页，讲稿共七十八页哦表表1MS培养基的组成配方培养基的组成配方组成成分组成成分数量数量(mg/L)组成成分组成成分数量数量(mg/L)NH4NO31650

26、 Na2-EDTA37.3 KNO31900 FeSO47H2O 27.8 CaCl22H2O 440 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 370 蔗糖蔗糖 30 KH2PO4170 pH 5.8 KI0.83 肌醇肌醇 100.0 H3BO36.2 烟酸烟酸 0.5 MnSO44H2O22.3 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 0.5 ZnSO47H2O8.6 甘氨酸甘氨酸 2.0 Na2MoO42H2O0.25 盐酸硫铵等盐酸硫铵等 0.4 CoCl26H2O0.025 第四十一页，讲稿共七十八页哦表表2 2B B5 5培养基的组成和配方培养基的组成和配方组成成分组成成分 数量数量(m

27、g/l）组成成分组成成分 数量数量(mg/l)KNO3 2500 FeSO47H2O 27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖蔗糖40(NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇肌醇 100 H3BO4 3.0 烟酸烟酸 1.0 MnSO44H2O 10 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激动素激动素 0.1 Na2MoO42H20.25 2,4D 0.11.0 0.025 盐酸硫铵盐酸硫铵 10 Na2-EDTA37.3 CoCl26H2O第四十二页，讲稿共七十八页哦 表表3 N6培养基的组

28、成和配方培养基的组成和配方组成成分组成成分 数量数量(mg/l)组成成分组成成分(mg/l)KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185 蔗糖蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8(NH4)2SO4 463 烟酸烟酸 0.5 KI 0.8 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 盐酸硫铵盐酸硫铵 1.0 ZnSO47H2O1.5 第四十三页，讲稿共七十八页哦三、培养基母液及激素母液的配制：三、培养基母液及激素母液的配制：母液：欲配制液的浓缩液。

29、一般母液配成比所需浓度高母液：欲配制液的浓缩液。一般母液配成比所需浓度高1010100100倍。倍。大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类母液等。大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类母液等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀，一定要充分溶解配制时注意一些离子之间易发生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。母液配好后放入冰箱内低温保存，高的化学纯或分析纯。母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。用时再按比例稀释。第四十四页，讲稿共七十八页哦（一）母液配制流程图

30、（一）母液配制流程图 称称 量量 母液分装母液分装确定培养基确定培养基 溶溶 解解 定定 容容 贴标签贴标签保存于冰箱保存于冰箱母液配制母液配制(以以MS为例为例)第四十五页，讲稿共七十八页哦母母液液种种类类种类种类成成 分分规规 定定 用用量量(mg/L)(mg/L)扩大扩大倍数倍数称取量称取量(mg)(mg)母母液液定定容容体积体积(ml)(ml)配配1LMS1LMS培培养养基基 吸吸 取取 量量(ml)(ml)大量元素大量元素KNOKNO3 3NHNH4 4NONO3 3MgSOMgSO4 4.7H.7H2 2O OKHKH2 2POPO4 4CaCI.2HCaCI.2H2 2O O19

31、00190016501650370370170170440440202038000380003300033000740074003400340088008800100010005050微量元素微量元素MnSOMnSO4 4.4H.4H2 2O OZnSOZnSO4 47H7H2 2O OH H3 3BOBO3 3KIKINaNa2 2MoOMoO4 4.2H.2H2 2O OCuSOCuSO4 4.5H.5H2 2O OCoCICoCI2 2.6H.6H2 2O O22.322.38.68.66.26.20.830.830.250.250.0250.0250.0250.025100100223

32、02230860860620620838325252.52.52.52.5100010001010铁盐铁盐NaNa2 2-EDTA-EDTAFeSOFeSO4 4.7H.7H2 2O O37.337.327.827.81001003730373027802780100010001010有机物有机物烟酸烟酸甘氨酸甘氨酸 VBVB6 6 VBVB1 1 肌醇肌醇 505025251001005 525255000500050050010100.520.50.1100第四十六页，讲稿共七十八页哦(二二)母液配制要求：母液配制要求：1、母液浓缩倍数：、母液浓缩倍数：10-100，大量元素，大量元素20

33、；微量元素；微量元素100、铁盐铁盐100；有机物；有机物50；2、选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂、选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂3、防止沉淀、防止沉淀:Ca2+和和S042-，Ca2+Mg2+和和PO43-4、激素母液浓度：、激素母液浓度：1mg/ml,1次配成次配成50或或100 ml5、激素溶解：、激素溶解：IAA、IBA、GA、ZT先溶先溶95%酒精再定容；酒精再定容；NAA先溶于热水或先溶于热水或95%酒精再加水；酒精再加水；2，4-D先溶于先溶于1 mlNaOH再加水；再加水；KT、BA先溶于先溶于1 mlHCl再加水。再加水。第四十七页，讲稿共七十八页哦四、培

34、养基的配制：四、培养基的配制：1、量取母液：营养元素和激素。、量取母液：营养元素和激素。2、称量蔗糖、琼脂，放入、称量蔗糖、琼脂，放入600ml左右蒸馏水的锅左右蒸馏水的锅内，电路上加热，使琼脂溶化。内，电路上加热，使琼脂溶化。3、加入母液，混合均匀，调整、加入母液，混合均匀，调整pH值。值。4、分装入瓶，每瓶、分装入瓶，每瓶4050ml。5、封口：用、封口：用46层称量纸封口，之后灭菌备用。层称量纸封口，之后灭菌备用。第四十八页，讲稿共七十八页哦母液母液1 100ml 琼脂琼脂 7 g母液母液2 10ml 蔗糖蔗糖 30g 母液母液3 10ml 母液母液4 10ml BA 2mgNAA 1.

35、5mg 加热加热 定容定容1000ml 用氧化钠调用氧化钠调PH5.8分装（占容器分装（占容器1/41/3，不沾瓶壁口），不沾瓶壁口）高压灭菌高压灭菌（121C，1.1kg/cm2，20min）第四十九页，讲稿共七十八页哦 大量元素母液大量元素母液 微量元素母液微量元素母液 铁铁 盐母液盐母液 有机物母液有机物母液 取100ml取10ml取10ml取10ml注：注：MSMS培养基配制培养基配制容容量量瓶瓶要求：一次性移取，不能吸进要求：一次性移取，不能吸进吸耳球里，数量看准，不滴不吸耳球里，数量看准，不滴不漏，吹净为度。漏，吹净为度。移母液移母液第五十页，讲稿共七十八页哦用用0.1MNaOH0

36、.1MNaOH或或HClHCl调调PHPH值为值为5.85.8。趁热分装，。趁热分装，100ml100ml的三角的三角瓶约装入瓶约装入303040ml,3540ml,35瓶瓶/L/L。调调PHPH值：值：分装：分装：趁热分装，趁热分装，100ml100ml的三角瓶约装入的三角瓶约装入303040ml,40ml,3535瓶瓶/L/L。第五十一页，讲稿共七十八页哦扎口与灭菌扎口与灭菌:要求封口松紧适宜，系活扣，要求封口松紧适宜，系活扣，便于接种操作。便于接种操作。培养基应及时灭菌，防止培养基应及时灭菌，防止变质。变质。第五十二页，讲稿共七十八页哦五、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）：五、培养基的灭菌（

37、高压蒸汽灭菌）：1、加热：、加热：灭菌前检查灭菌锅内水量是否充足，然后将培养灭菌前检查灭菌锅内水量是否充足，然后将培养基放于灭菌锅内，改好盖，关闭放气阀，打开电源，基放于灭菌锅内，改好盖，关闭放气阀，打开电源，加热升温。加热升温。2、排气：、排气：当温度升至当温度升至0.05MPa时，打开放气阀彻底排出时，打开放气阀彻底排出锅内冷空气。然后关闭放气阀，促使压力继续上升。锅内冷空气。然后关闭放气阀，促使压力继续上升。第五十三页，讲稿共七十八页哦3、温度控制：、温度控制：当锅内压力升至当锅内压力升至0.10MPa时，计时时，计时1520分钟，计时结束后，分钟，计时结束后，关闭电源。关闭电源。4、出

38、锅：、出锅：当灭菌锅自然冷却后，取出培养基，放置于接种室备用。当灭菌锅自然冷却后，取出培养基，放置于接种室备用。第五十四页，讲稿共七十八页哦六、培养基的保存：六、培养基的保存：1、防尘：、防尘：防治灰尘污染。防治灰尘污染。2、避光：吲哚乙酸等易于分解，要注意遮光。、避光：吲哚乙酸等易于分解，要注意遮光。3、恒温：、恒温：4 oC可保存可保存36周，室温下两周内用完。周，室温下两周内用完。4、定期更新：不易长期保存。、定期更新：不易长期保存。第五十五页，讲稿共七十八页哦第三节第三节 植物离体培养体系的建立植物离体培养体系的建立第五十六页，讲稿共七十八页哦一、植物组织培养的阶段划分：一、植物组织培

39、养的阶段划分：通常将组织培养过程划分为四个阶段通常将组织培养过程划分为四个阶段 1、起始培养阶段（诱导阶段）、起始培养阶段（诱导阶段）2、增殖培养阶段、增殖培养阶段 3、生根培养阶段、生根培养阶段 4、驯化移栽、驯化移栽第五十七页，讲稿共七十八页哦第五十八页，讲稿共七十八页哦（一）外植体的起始培养过程（一）外植体的起始培养过程 1、起始培养的一般过程：起始培养的一般过程：A、选取适宜的基因型（品种）；、选取适宜的基因型（品种）；B、选取适宜的外植体；常用外植体有茎尖、茎段、选取适宜的外植体；常用外植体有茎尖、茎段、节间、叶片、叶柄等。节间、叶片、叶柄等。C、流水冲洗外植体；、流水冲洗外植体；D

40、、外植体切割、分离及灭菌处理；、外植体切割、分离及灭菌处理；E、外植体接种于诱导培养基。、外植体接种于诱导培养基。F、环境条件控制促进外植体的生长。、环境条件控制促进外植体的生长。二、外植体起始培养（无菌体系建立）二、外植体起始培养（无菌体系建立）第五十九页，讲稿共七十八页哦2、接种外植体的生长过程：、接种外植体的生长过程：A 细胞分裂的启动；细胞分裂的启动；B 细胞增殖；细胞增殖；C 组织和器官的形成。组织和器官的形成。第六十页，讲稿共七十八页哦第六十一页，讲稿共七十八页哦（二）影响外植体起始培养的因素：（二）影响外植体起始培养的因素：1、影响外植体起始的因素、影响外植体起始的因素 A A

41、外植体外植体 B B 培养基组成成分培养基组成成分 C C 培养条件培养条件第六十二页，讲稿共七十八页哦外植体：外植体：(1)外植体种类及基因型外植体种类及基因型 (2)外植体供体植株和外植体的来源与生理状外植体供体植株和外植体的来源与生理状态态 (3)外植体大小外植体大小 (4)外植体的极性外植体的极性第六十三页，讲稿共七十八页哦外植体种类及基因型外植体种类及基因型a.单子叶植物不易诱导器官发生。单子叶植物不易诱导器官发生。b.b.木本植物较难诱导。木本植物较难诱导。c.c.存在基因型差异（如番茄存在基因型差异（如番茄29%63%）d.d.开始生长季节取材容易诱导。开始生长季节取材容易诱导。

42、第六十四页，讲稿共七十八页哦外植体状态：外植体状态：第六十五页，讲稿共七十八页哦外植体大小：外植体越小成苗能力越弱，较大的外外植体大小：外植体越小成苗能力越弱，较大的外植体增殖较快。植体增殖较快。外植体极性：当外植体以形态学的基部接种于外植体极性：当外植体以形态学的基部接种于培养基上时，从远离基部的表面诱导出芽、苗培养基上时，从远离基部的表面诱导出芽、苗数目较多。数目较多。第六十六页，讲稿共七十八页哦B、培养基、培养基 a 培养基类型培养基类型:b 碳碳 源的影响源的影响:第六十七页，讲稿共七十八页哦 C、植物生长调节物质、植物生长调节物质 a 细胞分裂素和生长素类细胞分裂素和生长素类 b 赤

43、霉素类赤霉素类 c 乙烯及其生物合成抑制剂乙烯及其生物合成抑制剂 d 其他有机化合物其他有机化合物第六十八页，讲稿共七十八页哦细胞分裂素和生长素：细胞分裂素和生长素：第六十九页，讲稿共七十八页哦a.部分植物单独使用细胞分裂素（部分植物单独使用细胞分裂素（CTK）可以形成）可以形成 无根无根苗苗b.部分植物无根苗的形成需要细胞分裂素和生长素配合使用。部分植物无根苗的形成需要细胞分裂素和生长素配合使用。c.外源外源CTK与生长素必须维持适当比例以改变内源激素平衡，与生长素必须维持适当比例以改变内源激素平衡，促进器官发生。促进器官发生。d.不同细胞分裂素对分化的作用效果不同不同细胞分裂素对分化的作用

44、效果不同e.苯基脲衍生物具有较高的细胞分裂素活性苯基脲衍生物具有较高的细胞分裂素活性 （4PU、CPPU、TDZ）第七十页，讲稿共七十八页哦赤霉素类：组织培养条件下只在少数植物上对芽的诱导有促进作用。赤霉素类：组织培养条件下只在少数植物上对芽的诱导有促进作用。如马铃薯、甜菜、樱桃等。如马铃薯、甜菜、樱桃等。乙烯及其生物合成抑制剂：具有促进和抑制两方面的影响，但抑乙烯及其生物合成抑制剂：具有促进和抑制两方面的影响，但抑制作用多于促进作用。因此在某些植物种类，乙烯抑制剂可以促制作用多于促进作用。因此在某些植物种类，乙烯抑制剂可以促进芽的形成。进芽的形成。AgNO3、CoCl、AVG第七十一页，讲稿

45、共七十八页哦其他有机化合物：其他有机化合物：腺嘌呤衍生物具有促进器官分化作用。腺嘌呤衍生物具有促进器官分化作用。椰子汁等物质也具有促进分化的功能。椰子汁等物质也具有促进分化的功能。第七十二页，讲稿共七十八页哦3.培养条件及其他因素培养条件及其他因素（1）光照）光照 通常通常10005000 Lx 16 小时光照。小时光照。非洲菊非洲菊1000 lx，洋葱，洋葱 16小时，马铃薯连续光小时，马铃薯连续光照，葡萄要求短日照。照，葡萄要求短日照。光质也影响芽的再生，蓝光有利于器官发生，光质也影响芽的再生，蓝光有利于器官发生，烟草实验，而红光有利于根的发生。烟草实验，而红光有利于根的发生。第七十三页，

46、讲稿共七十八页哦（2）温度：大部分植物要求）温度：大部分植物要求25 oC，少数要求，少数要求较低温度（较低温度（15 20 oC）或较高的温度（）或较高的温度（30 oC）如菖蒲、水仙、洋葱、龟背竹等。如菖蒲、水仙、洋葱、龟背竹等。变温处理对有些植物器官发生有促进作用变温处理对有些植物器官发生有促进作用，如豌豆。，如豌豆。第七十四页，讲稿共七十八页哦（3）湿度：培养室相对湿度以）湿度：培养室相对湿度以7080为适宜，为适宜，培养容器内要保持适宜湿度，防止过于干燥或湿度培养容器内要保持适宜湿度，防止过于干燥或湿度过大。过大。（4）气体：要注意保持培养容器内良好的通气）气体：要注意保持培养容器内良好的通气性。维持适宜的氧气和二氧化碳浓度，防止有性。维持适宜的氧气和二氧化碳浓度，防止有害气体的积累。害气体的积累。第七十五页，讲稿共七十八页哦如何进行外植体的起始培养（无菌体系的建立）？如何进行外植体的起始培养（无菌体系的建立）？1、选择适宜的外植体；、选择适宜的外植体；2、选择适宜的培养基；、选择适宜的培养基；3、创造适宜的环境条件、创造适宜的环境条件第七十六页，讲稿共七十八页哦第七十七页，讲稿共七十八页哦感感谢谢大大家家观观看看第七十八页，讲稿共七十八页哦