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1、关于植物抗病基因工程的基本原理与方法第一页，讲稿共十五页哦1 1 植物抗病基因工程策略植物抗病基因工程策略1.1 1.1 导入植物抗病相关基因和病原菌致病相关基因导入植物抗病相关基因和病原菌致病相关基因在植物抗性基因的利用方面在植物抗性基因的利用方面 根据已有的根据已有的R基因结构特征，设计新的基因结构特征，设计新的R基因。基因。异源表达异源表达R基因。基因。向同一株植物中导入多个向同一株植物中导入多个R基因。基因。在病原菌无毒基因的利用方面在病原菌无毒基因的利用方面 转病原菌无毒基因。转病原菌无毒基因。将病原菌无毒基因和相应的将病原菌无毒基因和相应的R基因一起导入植物。基因一起导入植物。导入
2、与植物抗病信号有关的基因。导入与植物抗病信号有关的基因。第二页，讲稿共十五页哦1.2 1.2 导入植物防卫基因导入植物防卫基因 Broglie(1991),et al.在克隆菜豆几丁质基因的基础上将在克隆菜豆几丁质基因的基础上将CH5B基因修饰改造，通过基因修饰改造，通过Ti质粒转化烟草，获得几丁质酶高效表达的转质粒转化烟草，获得几丁质酶高效表达的转基因植株，具有协同拮抗枯萎病菌的效果。基因植株，具有协同拮抗枯萎病菌的效果。M.J.Carmona(1993),et al.，将来源于大麦基因组克隆的硫素基，将来源于大麦基因组克隆的硫素基因和来源于小麦因和来源于小麦cDNA克隆的硫素基因转化到烟草
3、中，获得了对克隆的硫素基因转化到烟草中，获得了对P.s.pv.tabaci具有较高抗性的植株。具有较高抗性的植株。美国孟山都（美国孟山都（Monsanto）公司将真菌编码葡萄糖氧化酶基）公司将真菌编码葡萄糖氧化酶基因导入马铃薯中，获得了对因导入马铃薯中，获得了对Ecc引起的细菌性软腐病具有良好抗性的引起的细菌性软腐病具有良好抗性的植株。植株。第三页，讲稿共十五页哦1.3 1.3 导入降解病原物致病因子基因导入降解病原物致病因子基因 H.Anzai(1989),et al.分离到了抗烟毒素（分离到了抗烟毒素（tabtoxin）的基）的基因因ttr，将基因，将基因ttr与与CaMV 35S启动子融
4、合成嵌合基因，通过农启动子融合成嵌合基因，通过农杆菌介导的转化法转入烟草，获得杆菌介导的转化法转入烟草，获得ttr高表达量的转基因植株，高表达量的转基因植株，对烟毒素和病原菌的侵染均表现出良好的抗性。对烟毒素和病原菌的侵染均表现出良好的抗性。菜豆毒素（菜豆毒素（phaseolotoxin）是一种非寄主专化性毒素，产）是一种非寄主专化性毒素，产菜豆毒素的菜豆毒素的P.s.pv.phaseolicola菌株通过菌株通过argK基因合成一种不被基因合成一种不被菜豆毒素抑制的菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，从而对该毒素不敏感。将酶，从而对该毒素不敏感。将argK基基因导入烟草和菜豆，获得的转基因烟草和
5、菜豆对因导入烟草和菜豆，获得的转基因烟草和菜豆对P.s.pv.phaseolicola有较高的抗性。有较高的抗性。第四页，讲稿共十五页哦1.4 1.4 导入其它蛋白基因导入其它蛋白基因 贾士荣贾士荣,等等(1993)和和M.Hassan(1993),et al.向马铃薯导入向马铃薯导入cecropin基因后提高了马铃薯对青枯病的抗性。基因后提高了马铃薯对青枯病的抗性。J.M.Jaynes(1993),et al.将将cecropinB基因导入烟草后获得基因导入烟草后获得的转基因植株，提高了其对的转基因植株，提高了其对R.solanacearum引起病害的抗性。引起病害的抗性。黄大年黄大年,等等
6、(1997)将将cecropinB和和cecropinD基因导入水稻基因导入水稻幼胚，获得的转基因水稻植株可明显地提高对水稻白叶枯病幼胚，获得的转基因水稻植株可明显地提高对水稻白叶枯病的抗性，同时也获得了高抗水稻条斑病和水稻白叶枯病的高的抗性，同时也获得了高抗水稻条斑病和水稻白叶枯病的高抗品系。抗品系。第五页，讲稿共十五页哦2 2 植物抗病基因工程的技术环节植物抗病基因工程的技术环节 至今已分离的供植物基因工程应用的目的至今已分离的供植物基因工程应用的目的基因有基因有100多个，其中研究得比较多的是抗病毒、多个，其中研究得比较多的是抗病毒、细菌和真菌的基因，能杀死害虫或使害虫拒食的细菌和真菌的
7、基因，能杀死害虫或使害虫拒食的基因，能抵抗各种除草剂的基因，能抗逆境如干基因，能抵抗各种除草剂的基因，能抗逆境如干旱、高寒、高温盐碱等的基因，能提高植物体中旱、高寒、高温盐碱等的基因，能提高植物体中蛋白质含量或蛋白质品质的基因等等。这些基因蛋白质含量或蛋白质品质的基因等等。这些基因中有些是来自植物本身，有些来自微生物，还有中有些是来自植物本身，有些来自微生物，还有少数是人工合成的。少数是人工合成的。第六页，讲稿共十五页哦2.1 2.1 目的基因的分离和鉴定目的基因的分离和鉴定 对已知序列进行分子克隆对已知序列进行分子克隆 从蛋白质到基因序列从蛋白质到基因序列 PCR扩增扩增构建构建cDNA文库
8、文库构建基因组文库构建基因组文库 与已知基因紧密连锁基因的分离与已知基因紧密连锁基因的分离 第七页，讲稿共十五页哦 根据植株或细胞表型变异进行基因分离根据植株或细胞表型变异进行基因分离 转座子标签法转座子标签法图位克隆法图位克隆法基因挽救技术基因挽救技术基因组相减法基因组相减法cDNA差式显示差式显示转座子导入细胞转座子导入细胞目的形状突变株目的形状突变株构建核构建核DNA文库文库用转座子序列作用转座子序列作探针进行杂交探针进行杂交分析转座子两侧序分析转座子两侧序列并以此作探针列并以此作探针野生型野生型细胞核细胞核DNA构建构建 核核DNA 文库文库完整的目的完整的目的性状基因性状基因转座子标
9、签法流程图转座子标签法流程图第八页，讲稿共十五页哦2.2 2.2 表达载体的构建表达载体的构建 目的基因分离后，往往需要经过修饰才能应用于植物基目的基因分离后，往往需要经过修饰才能应用于植物基因工程。构建植物表达载体就是在目的基因的因工程。构建植物表达载体就是在目的基因的5端加上启动子，端加上启动子，在基因的在基因的3端加上中止子，以便使外源基因能在植物中有效地表端加上中止子，以便使外源基因能在植物中有效地表达，充分发挥其功能。达，充分发挥其功能。加入启动子区加入启动子区 目前植物基因工程中外源基因常选用的启动子主要有目前植物基因工程中外源基因常选用的启动子主要有3类：第一类是从类：第一类是从
10、Ti质粒的质粒的T-DNA序列上分离的启动区。具有序列上分离的启动区。具有真核生物转基因起始所需的真核生物转基因起始所需的TATA盒和盒和CAT盒；第二类是盒；第二类是CaMV的的35S和和19S启动子；第三类是从植物本身分离出来的启动子；第三类是从植物本身分离出来的启动子。启动子。第九页，讲稿共十五页哦加入转录的加尾序列加入转录的加尾序列 真核生物为保证一个结构基因表达完全末端需要有一个真核生物为保证一个结构基因表达完全末端需要有一个加尾序列。其功能一方面保证转录的终止；另一方面保证加尾序列。其功能一方面保证转录的终止；另一方面保证形成有活性的形成有活性的mRNA链。植物基因工程中常用的加尾
11、序列是链。植物基因工程中常用的加尾序列是AATAAA。插入内含子插入内含子 内含子是真核生物基因组结构的特点之一。在基因工程内含子是真核生物基因组结构的特点之一。在基因工程中，多数不用在目的基因中插入这种片段就能得到有效的表中，多数不用在目的基因中插入这种片段就能得到有效的表达，因此，认为它是基因产物功能非必需的。但是在实际操达，因此，认为它是基因产物功能非必需的。但是在实际操作中，如果在目的基因适当的位置插入这种序列，其表达量作中，如果在目的基因适当的位置插入这种序列，其表达量可以提高几十到几百倍。因此，有人推测，内含子可能在基可以提高几十到几百倍。因此，有人推测，内含子可能在基因翻译中起增
12、强子的作用。因翻译中起增强子的作用。第十页，讲稿共十五页哦加入翻译起始密码子加入翻译起始密码子 由于植物中由于植物中mRNA的翻译起始密码子多数也是的翻译起始密码子多数也是AUG，因此，因此，要在目的基因功能蛋白的编码序列前加上适当的核苷酸序列。要在目的基因功能蛋白的编码序列前加上适当的核苷酸序列。加入终止密码子加入终止密码子 植物基因工程中所使用的植物基因工程中所使用的mRNA翻译终止密码子有翻译终止密码子有UAA、UAG、UGA三种。一般在目的基因功能蛋白的编码序列后三种。一般在目的基因功能蛋白的编码序列后直接加上对应的碱基序列。实验中通常采用的是直接加上对应的碱基序列。实验中通常采用的是
13、Ti质粒中质粒中的的Nos终止子。终止子。加入增强序列加入增强序列第十一页，讲稿共十五页哦加入与植物中特定加入与植物中特定DNA同源的序列同源的序列 为了实现将目的基因和植物基因组有效整合，植物基因为了实现将目的基因和植物基因组有效整合，植物基因工程中常在目的基因两端接上能和植物特定基因能整合的工程中常在目的基因两端接上能和植物特定基因能整合的DNA序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方面也可以结合植物基因组表达调控规律，通过调整所加同面也可以结合植物基因组表达调控规律，通过调整所加同源序列的碱基序列有效地控制外源基因的插入位点和表达源序列
14、的碱基序列有效地控制外源基因的插入位点和表达时间，使目的基因更便于操作以及整合后更好地发挥作用。时间，使目的基因更便于操作以及整合后更好地发挥作用。加入报道基因加入报道基因 常用的报道基因：常用的报道基因：lacZ、ocs、cat、npt、lux和和gus第十二页，讲稿共十五页哦2.3 2.3 目的基因向植物的转化目的基因向植物的转化 近年来，植物的遗传转化技术得到了迅速的发近年来，植物的遗传转化技术得到了迅速的发展，已建立了多种转化系统，如以农杆菌展，已建立了多种转化系统，如以农杆菌Ti质粒及质粒及Ri质粒为载体的转化系统，以质粒为载体的转化系统，以PEG介导的原生质化学介导的原生质化学导入
15、法、电激法、基因枪法、花管导入法等等。导入法、电激法、基因枪法、花管导入法等等。总之，植物细胞遗传转化系统可分为两大类：以总之，植物细胞遗传转化系统可分为两大类：以载体为介导的基因转化（载体为介导的基因转化（vector mediated gene transfer）和）和DNA直接转化（直接转化（naked DNA transfer）。）。第十三页，讲稿共十五页哦2.4 2.4 转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定 植物外植体经过农杆菌或植物外植体经过农杆菌或DNA直接转化后，大部分细胞直接转化后，大部分细胞是没有转化的，只有极少数是转化的，这就需要采用特
16、定的是没有转化的，只有极少数是转化的，这就需要采用特定的的方式将未转化细胞与转化细胞区分开来，淘汰未转化的细的方式将未转化细胞与转化细胞区分开来，淘汰未转化的细胞，然后利用植物细胞的全能性在适宜的环境条件下使转化胞，然后利用植物细胞的全能性在适宜的环境条件下使转化的细胞再生成可育的转基因植株。的细胞再生成可育的转基因植株。目前，转化细胞与非转化细胞的区分及非转化细胞的淘汰目前，转化细胞与非转化细胞的区分及非转化细胞的淘汰常采用抗菌素抗性基因及抗除草剂基因，总称筛选标记。植物基因常采用抗菌素抗性基因及抗除草剂基因，总称筛选标记。植物基因工程中常用的筛选标记是工程中常用的筛选标记是npt（neomycin phosphotransferase）基因和基因和cat（chloramphenicol acetyltr-ansferase）基因）基因第十四页，讲稿共十五页哦05.04.2023感感谢谢大大家家观观看看第十五页，讲稿共十五页哦