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1、第七章第七章 发酵工程技术概发酵工程技术概述述本章重点：优良菌种的选育 发酵工艺的控制内容内容n n第一节第一节 概述概述n n第二节第二节 优良菌种的选育优良菌种的选育n n第三节第三节 发酵的基本过程发酵的基本过程n n第四节第四节 发酵方式发酵方式n n第五节第五节 发酵工艺控制发酵工艺控制n n第六节第六节 发酵产物的提取发酵产物的提取n n第七节第七节 发酵设备发酵设备n n第八节第八节 发酵工程产品的制造实例发酵工程产品的制造实例n n第九节第九节 基因工程在发酵中的应用基因工程在发酵中的应用n n第十节第十节 发酵工程的发展展望发酵工程的发展展望第一章第一章 概述概述发酵工程发酵
2、工程n n发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。n n现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物高分子、酶以及维生素和单细胞蛋白等。FERMENTATIONProcess ControlFermentation engineering上游工程上游工程UPSTREAM PROCESSES
3、下游工程下游工程DOWNSTREAM PROCESSES发酵工程组成发酵工程组成从广义上讲，由三部分组成：从广义上讲，由三部分组成：上游工程、发酵工程、下游工程上游工程、发酵工程、下游工程上游工程、发酵工程、下游工程上游工程、发酵工程、下游工程UPSTREAM PROCESSES-genetics,cell-inoculum development-media formulation-sterilization-inoculationFERMENTATIONProcess Control上游工程上游工程Fermentation engineeringDOWNSTREAM PROCESSES-p
4、roduct extraction,purification&assay-waste treatment-by product recoveryFERMENTATIONProcess Control下游工程 The ratio of recovery to fermentation costs for L-asparaginase:3.0 ethanol:0.16Fermentation engineering发酵工程发酵工程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术胞和生产代谢产物的工艺技术(1)(1)有严格的无菌生长环境：
5、有严格的无菌生长环境：包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；气的空气过滤技术；(2)(2)在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速 度的计算机控制技术；度的计算机控制技术；(3)(3)种子培养和生产培养的不同的工艺技术。种子培养和生产培养的不同的工艺技术。(4)在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学
6、模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。(5)由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。微生物发酵技术微生物发酵技术n n 1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”n n 巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死有害的微
7、生物，防止酒发生质变。有害的微生物，防止酒发生质变。同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。获得所需的发酵产品。利用微生物的特点利用微生物的特点 n n发酵工程所利用的微生物微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌 利用微生物的特点：(1)对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力 (2)有极强的消化能力 (3)有极强的繁殖能力 Use of Microorganismsn nPositivePositive（益处）（益处）（益
8、处）（益处）n nBiomassBiomassn nProductionProductionn nConversionConversionn nNegativeNegative（危害）（危害）（危害）（危害）n nPathogensPathogensn nSpoilageSpoilage一、发酵的定义一、发酵的定义1 1、传统发酵、传统发酵2 2、生化和生理学意义的发酵、生化和生理学意义的发酵3 3、工业上的发酵、工业上的发酵1 1、传统发酵、传统发酵n n最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。2 2、生化和生理学意义的发酵、生化和生理学意义的发酵n
9、n指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。n n如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出并放出COCO2 2。3 3、工业上的发酵、工业上的发酵n n泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程 包括：1.厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2.通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。n n产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。二、发酵工
10、业二、发酵工业1.1.定义：定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。n n适宜的微生物适宜的微生物n n保证或控制微生物进行代谢的各种条件保证或控制微生物进行代谢的各种条件n n进行微生物发酵的设备进行微生物发酵的设备n n精制成产品的方法的设备精制成产品的方法的设备2.获得发酵产品的条件三、发酵工业的发展历史三、发酵工业的发展历史发酵工程发展的4个阶段（了解）人类利用微生物发酵制造所需产物有几千年的历人类利用微生物发酵制造所需产物有几千年的历史，但对其过程的原理、反应步骤、物质变
11、化、史，但对其过程的原理、反应步骤、物质变化、调控机制等的认识主要在调控机制等的认识主要在2020世纪完成的。其发展世纪完成的。其发展大体可分为以下大体可分为以下4 4个阶段：个阶段：1.1.第一阶段：传统微生物阶段第一阶段：传统微生物阶段 20 20世纪以前时期世纪以前时期n n主要生产葡萄酒、酒、醋、酱、奶酪等。主要生产葡萄酒、酒、醋、酱、奶酪等。n n16751675年荷兰人年荷兰人列文虎克列文虎克发明显微镜，首次观察到微生发明显微镜，首次观察到微生物物n n1857-18761857-1876年，年，巴斯德巴斯德提出提出“一切发酵过程都是微生一切发酵过程都是微生物物 作用的结果，发酵是
12、没有空气的生命过程，微生物是作用的结果，发酵是没有空气的生命过程，微生物是 引起化学变化的作用者。引起化学变化的作用者。”生物工程之父生物工程之父像牛顿开辟出经典力学一样，巴斯德像牛顿开辟出经典力学一样，巴斯德开辟了微生物领域，他也是一位科学开辟了微生物领域，他也是一位科学巨人巨人 巴斯德巴斯德路易斯路易斯（LouisPasteur），法国微），法国微生物学家、化学家，近代微生物学家、化学家，近代微生物学的奠基人生物学的奠基人 巴斯德巴斯德路易斯路易斯n n曲颈瓶实验曲颈瓶实验n n巴氏消毒法巴氏消毒法n n酒精发酵酒精发酵,醋酸发酵的机理醋酸发酵的机理n n减毒疫苗减毒疫苗在食品工业上的应用
13、在食品工业上的应用n n主要包括以下三方面。主要包括以下三方面。n n第一，生产传统的发酵产品，如啤酒、果酒、第一，生产传统的发酵产品，如啤酒、果酒、第一，生产传统的发酵产品，如啤酒、果酒、第一，生产传统的发酵产品，如啤酒、果酒、食醋等，使产品的产量和质量得到明显的提高。食醋等，使产品的产量和质量得到明显的提高。食醋等，使产品的产量和质量得到明显的提高。食醋等，使产品的产量和质量得到明显的提高。n n第二，生产各种食品的添加剂。第二，生产各种食品的添加剂。第二，生产各种食品的添加剂。第二，生产各种食品的添加剂。n n第三，帮助解决粮食问题。第三，帮助解决粮食问题。第三，帮助解决粮食问题。第三，
14、帮助解决粮食问题。n n2.第二阶段：1900-1940有机酸工业新的发酵产品不断问世，主要有酵母、甘油、乳酸、柠檬酸、丁醇和丙酮等。是第一个进行大规模工业生产的发酵过程，也是工业生产中首次采用大量纯培养技术的工艺。河南省郸城金河南省郸城金丹乳酸实业有丹乳酸实业有限公司限公司 3.第三阶段：1942-1952抗生素工业n n世界上第一个抗生素产品是青霉素，第二个抗生素是链霉素。n n青霉素工业化成功推动了发酵工业的发展，主要标志有：深层发酵、生产大规模化、多种抗抗生素生素、氨基酸氨基酸、核酸核酸发酵成功，甾体的微生物转化。谷氨酸发酵的生产实例谷谷氨氨酸酸钠钠是是味味精精的的主主要要成成分分谷氨
15、酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径 在工厂里是怎在工厂里是怎样应用谷氨酸棒样应用谷氨酸棒状杆菌来生产谷状杆菌来生产谷氨酸的？氨酸的？n n4.第四阶段第四阶段n n 从从DNADNA双螺旋结构模型的提出到质粒的不断发双螺旋结构模型的提出到质粒的不断发现，生物工程的新飞跃已具备了一切条件。分子现，生物工程的新飞跃已具备了一切条件。分子生物学和基因工程、细胞工程的发展为微生物工生物学和基因工程、细胞工程的发展为微生物工程的发展创造了条件。程的发展创造了条件。n n 重组重组DNADNA和细胞融合技术能打破物种之间的屏和细胞融合技术能打破物种之间的屏障，获得障，获得“杂交杂交”分子的新产物，而且通过活化分子
16、的新产物，而且通过活化微生物的某些沉默基因，也可获得一些新结构的微生物的某些沉默基因，也可获得一些新结构的活性物质。活性物质。n n三、发酵工程的研究内容主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术(1)有严格的无菌生长环境：有严格的无菌生长环境：包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；(2)在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速速 度的计算机控制技术；度的计算机控制技术；(3)种子培养和生产培养的不同的工艺技术。种子培养和生产培养的不同的工
17、艺技术。(4)(4)在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验室规在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。(5)(5)由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。发酵工程工艺放大问题。
18、发酵工业的生产水平取决于三个要素：发酵工业的生产水平取决于三个要素：生产菌种、发生产菌种、发酵工艺和发酵设备。酵工艺和发酵设备。n n思考题n n填空填空n n1.1.在发酵工程发展过程中，在发酵工程发展过程中，发明了显微发明了显微 镜，镜，被称为被称为“生物工程之父生物工程之父”。n n2.2.世界上第二个抗生素是世界上第二个抗生素是。n n3.3.发酵工业的生产水平取决于三个要素：发酵工业的生产水平取决于三个要素：、。第二节第二节 优良菌种的选育优良菌种的选育发酵工业的生产水平的决定因素之一是生产菌种，故发酵工业的生产水平的决定因素之一是生产菌种，故发酵工业的生产水平的决定因素之一是生产菌
19、种，故发酵工业的生产水平的决定因素之一是生产菌种，故发酵工程产品开发的关键之一是筛选新的有用的物质发酵工程产品开发的关键之一是筛选新的有用的物质发酵工程产品开发的关键之一是筛选新的有用的物质发酵工程产品开发的关键之一是筛选新的有用的物质的生产菌种。的生产菌种。的生产菌种。的生产菌种。n n菌种的来源：菌种的来源：n n根根据据资资料料直直接接向向有有科科研研单单位位、高高等等院院校校、工工厂厂或或菌菌种保藏部门索取或购买；种保藏部门索取或购买；n n从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从自然界筛选从自然界筛选目的l 提高生产能力提高生产能力l 提提高高产产品品质
20、质量量l 开发新产品开发新产品l 解决生产实际问题解决生产实际问题l 防止菌种退化防止菌种退化n n菌株选育、分子改造n n菌种选育方法有：菌种选育方法有：n n自然选育、诱变选育、杂交育种等，还包括控制自然选育、诱变选育、杂交育种等，还包括控制杂交育种、原生质体融合、基因工程育种等。杂交育种、原生质体融合、基因工程育种等。一一、菌种选育的物质基础、菌种选育的物质基础n nDNADNA是微生物遗传的物质基础是微生物遗传的物质基础，基因是遗传物质的基本功能单位，每个基因包含几百对以上的核苷酸，只要其中一对发生交换或突变就会导致遗传性状的改变。决定遗传性状的DNA主要集中在染色体上，只有少许游离在
21、外n nDNA分子结构的改变是诱变育种的工作根据，染色体搭配的变化交换是杂交育种的根据。对DNA子结构和它复制过程的了解将更有利于充实诱变育种的理论根据n n二、自然育种n n定义定义：不经人工处理，利用微生物的自然突变进：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。行菌种选育的过程。n n自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10101010-8-8-8-810101010-9-9-9-9，一种是我们生产上所不希望看到的，表现为，一种是我们生产上所不希望看到的，表现为，
22、一种是我们生产上所不希望看到的，表现为，一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变变变变。另另另另一一一一种种种种是是是是我我我我们们们们生生生生产产产产上上上上希希希希望望望望看看看看到到到到的的的的，对对对对生生生生产产产产有有有有利利利利，这这这这种突变成为正突变。种突变成为正突变。种突变成为正突变。种突变成为正突变。n n问题问题：高产菌株是正突变还是负突变？：高产菌株是正突变还是负突变？自然选育虽然突变率很低，但
23、却是工厂保证稳产高产自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。的重要措施。的重要措施。的重要措施。回复突变：回复突变：回复突变：回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变高产菌株在传代的过程中，由于自然突变高产菌株在传代的过程中，由于自然突变高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变称为回复突变称
24、为回复突变称为回复突变自然选育操作步骤：自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞单细胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备平板分离平板分离挑选单菌落挑选单菌落(注意形态的观察注意形态的观察)发酵试验发酵试验n n三、诱变育种n n定义定义：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突用各种物理、化学的因素人工诱发基因突用各种物理、化学的因素人工诱发基因突用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变筛选高产菌种的过程。变筛选高产菌种的过程。变筛选高产菌种的过程。变筛选高产菌种的过程。n n1.1.1.1.诱变机制诱变机制诱变机制诱变机制：由诱变而导致
25、微生物：由诱变而导致微生物：由诱变而导致微生物：由诱变而导致微生物DNADNADNADNA的微细结构的微细结构的微细结构的微细结构发生的变化，主要分为发生的变化，主要分为发生的变化，主要分为发生的变化，主要分为 微小损伤突变微小损伤突变微小损伤突变微小损伤突变:碱基的置换、码组移动突变碱基的置换、码组移动突变碱基的置换、码组移动突变碱基的置换、码组移动突变 染色体畸变染色体畸变染色体畸变染色体畸变:易位、倒位、缺失、重复易位、倒位、缺失、重复易位、倒位、缺失、重复易位、倒位、缺失、重复 染色体组突变染色体组突变染色体组突变染色体组突变:细胞内染色体组的改变细胞内染色体组的改变细胞内染色体组的改
26、变细胞内染色体组的改变2.2.诱变剂及其作用方式诱变剂及其作用方式诱变剂：诱变剂：诱变剂：诱变剂：能诱发基因突变并使突变率提高到超过自发突能诱发基因突变并使突变率提高到超过自发突变水平的物理化学因子。变水平的物理化学因子。可分为三大类：可分为三大类：物理诱变剂物理诱变剂：UVUV、X X射线、射线、射线等射线等 化学诱变剂化学诱变剂：亚硝酸胍、氮芥等：亚硝酸胍、氮芥等 生物诱变剂生物诱变剂：噬菌体：噬菌体n n3.诱变和筛选n n首先要制定明确的筛选目标，其次是制定合理的首先要制定明确的筛选目标，其次是制定合理的步骤，再次是建立正确快速的测定方法和摸索培步骤，再次是建立正确快速的测定方法和摸索
27、培养最适条件。养最适条件。诱变剂处理过程中几个有关的问题诱变剂处理过程中几个有关的问题诱变剂处理过程中几个有关的问题诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性；化学诱变剂使用过程的安全性；化学诱变剂使用过程的安全性；化学诱变剂使用过程的安全性；诱变剂量的选择；诱变剂量的选择；诱变剂量的选择；诱变剂量的选择；诱变剂的选择；诱变剂的选择；诱变剂的选择；诱变剂的选择；出发菌株的选择。出发菌株的选择。出发菌株的选择。出发菌株的选择。n n筛选的方法：筛选的方法：n n随机筛选：随机筛选：随机筛选：随机筛选：n n形态：形态：形态：形态：n n理性化筛选：理性化筛选：理性化筛选：理性化筛
28、选：从从产产物物形形成成的的生生理理生生化化途途径径着着手手，进进行行有有的的放放矢矢的的筛筛选选。如如结结构构类类似似物物抗抗性性、营营养养缺缺陷陷型型等等，筛筛选选而而产产生生的的这这些特性，称为些特性，称为遗传标记遗传标记。n n四、原始质体融合n n用脱壁酶除去细胞壁，制成原生质体，再用用脱壁酶除去细胞壁，制成原生质体，再用聚乙聚乙二醇（二醇（PEGPEG）促进原生质体发生融合，从而获得异促进原生质体发生融合，从而获得异核体活重组子的技术。核体活重组子的技术。n n原生质体融合于原生质体融合于19781978年第三届国际工业微生物遗年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出，是基因重组的
29、一种重要方法传学讨论会上提出，是基因重组的一种重要方法n n原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，原生质体诱变育种等。体转化技术，原生质体诱变育种等。n n1.1.1.1.步骤步骤步骤步骤n n（1 1）标记菌株的筛选和稳定性验证。）标记菌株的筛选和稳定性验证。n n（2 2）原生质体制备。）原生质体制备。n n（3 3）等量原生质体加聚乙二醇促进融合。）等量原生质体加聚乙二醇促进融合。n n（4 4）涂布于再生培养基，再生出菌落。）涂布于再生培养基，再生出菌落。n n（5 5）选选择择性性培培养养基基上上划划线线生生长长，分分离离验验
30、证证，挑挑取取融合子进一步试验、保藏。融合子进一步试验、保藏。n n（6 6）生产性能筛选。）生产性能筛选。n n2.2.影响因素影响因素n n（1 1）菌龄：一般采用对数前期的菌体进行酶解。）菌龄：一般采用对数前期的菌体进行酶解。n n（2 2）培养基组分：限制性培养基上比在完全培养）培养基组分：限制性培养基上比在完全培养基上原生质体形成效果好。基上原生质体形成效果好。n n（3 3）PEGPEG：必须物质，其分子量和浓度影响融合：必须物质，其分子量和浓度影响融合效果。效果。n n（4 4）外界因素：）外界因素：n n 思考题思考题n n一、名词解释一、名词解释n n自然育种自然育种 诱变育
31、种诱变育种 诱变剂诱变剂 原生质体融合原生质体融合n n二、填空二、填空n n1.1.有诱变而导致微生物有诱变而导致微生物DNADNA的微细结构发生变化，主的微细结构发生变化，主要分为要分为、和和。n n2.2.诱变剂有很多中，可分为诱变剂有很多中，可分为、和和三大类。三大类。n n3.3.原生质体融合育种一般选用原生质体融合育种一般选用作为助融剂。作为助融剂。n n三、选择三、选择n n原生质体融合时，菌龄对原生质体的形成影响很大，原生质体融合时，菌龄对原生质体的形成影响很大，一般采用一般采用的菌体进行酶解，原生质体形成率较高。的菌体进行酶解，原生质体形成率较高。n nA.A.延迟期延迟期
32、B.B.对数前期对数前期 C.C.对数后期对数后期 D.D.稳定期稳定期第三节第三节 发酵的基本过程发酵的基本过程n n发酵的基本过程为：菌种发酵的基本过程为：菌种 种子制备种子制备 发酵发酵 发酵液预处理发酵液预处理 提取精制提取精制(1)(1)用作培养菌种、扩大生产的发酵罐、培养基的配制用作培养菌种、扩大生产的发酵罐、培养基的配制(2)(2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌(3)(3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中罐中(4)(4)将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并将接种到发酵罐中
33、的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物形成代谢产物(5)(5)将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品(6)(6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水回收或处理发酵过程中产生的废物和废水菌种筛选菌种筛选摇瓶试验摇瓶试验发酵罐试验发酵罐试验一、菌种n n菌种：已有的优良生产菌种和选育的新菌种n n方法：一般都是由保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的斜面菌种开始，在正式使用前要先转接到新鲜斜面培养基上活化后，再用于种子扩大培养。n n注意：生产菌种应不断纯化，淘汰变异菌落，防止衰退。n n二、种子的制备n n目的：使菌种繁殖，以获得足够数量的菌体，以目的：使菌种繁殖
34、，以获得足够数量的菌体，以便接种到发酵罐中。便接种到发酵罐中。n n方法：方法：n n摇瓶培养摇瓶培养：在锥形瓶内装入一定量的液体培养基，：在锥形瓶内装入一定量的液体培养基，灭菌后接入菌种，摇床上恒温培养。灭菌后接入菌种，摇床上恒温培养。n n种子罐发酵：种子罐发酵：相当于小型发酵罐，灭菌接种后在相当于小型发酵罐，灭菌接种后在一定的空气流量、罐温、罐压下进行培养。一定的空气流量、罐温、罐压下进行培养。n n三、发酵n n目的：目的：使微生物产生大量的目的产物使微生物产生大量的目的产物关键阶段关键阶段。n n发酵方式可分为发酵方式可分为固体发酵固体发酵固体发酵固体发酵和和液体发酵液体发酵液体发酵
35、液体发酵两种。两种。n n固体发酵固体发酵固体发酵固体发酵：适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产：适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较简单的产品。比较简单的产品。n n液体深层发酵液体深层发酵液体深层发酵液体深层发酵：适合于大规模工业化生产。：适合于大规模工业化生产。影响发酵的因素很多，如温度、影响发酵的因素很多，如温度、pHpH、通风、搅拌、罐通风、搅拌、罐压力等等，必须适当地控制影响发酵的各种条件，掌压力等等，必须适当地控制影响发酵的各种条件，掌握发酵的动态，并进行杂菌的检查和产物测定，使整握发酵的动态，并进行杂菌的检查和产物测定，使整个发酵过程顺利进行。个发酵过程顺利进行。圆盘床式固
36、体发酵罐圆盘床式固体发酵罐 四、产物提取发酵完成后得到的发酵液是一种混合物，其中除了含发酵完成后得到的发酵液是一种混合物，其中除了含有表达的产物外，还有残余的培养基、微生物代谢产有表达的产物外，还有残余的培养基、微生物代谢产生的各种杂质和微生物菌体等。生的各种杂质和微生物菌体等。提取包括：发酵液的预处理和过滤提取包括：发酵液的预处理和过滤 提取提取 精制精制获得的产物都要按照有关部门制定的国家标准进行质获得的产物都要按照有关部门制定的国家标准进行质量检验和性能测定，符合要求后才为合格产品。量检验和性能测定，符合要求后才为合格产品。n n 思考题n n填空n n1.1.种子制备的目的是：种子制备
37、的目的是：，发酵的目的，发酵的目的是：是：。n n2.2.发酵水平的高低与菌种的性能质量有直接关系，发酵水平的高低与菌种的性能质量有直接关系，菌种的菌种的、是决定发酵水平的内在因是决定发酵水平的内在因素。素。n n3.3.从发酵液中提取产物主要包括三个方面：从发酵液中提取产物主要包括三个方面：、。第五节第五节 发酵工艺控制（发酵工艺控制（）n n n n 发酵工艺过程，不同于化学反应过程，它既涉发酵工艺过程，不同于化学反应过程，它既涉发酵工艺过程，不同于化学反应过程，它既涉发酵工艺过程，不同于化学反应过程，它既涉及生物细胞的生长、生理和繁殖等生命过程，又涉及生物细胞的生长、生理和繁殖等生命过程
38、，又涉及生物细胞的生长、生理和繁殖等生命过程，又涉及生物细胞的生长、生理和繁殖等生命过程，又涉及生物细胞分泌的各种酶所催化的生化反应过程。及生物细胞分泌的各种酶所催化的生化反应过程。及生物细胞分泌的各种酶所催化的生化反应过程。及生物细胞分泌的各种酶所催化的生化反应过程。n n 为了使发酵生产能够得到最佳效果，可测定与为了使发酵生产能够得到最佳效果，可测定与为了使发酵生产能够得到最佳效果，可测定与为了使发酵生产能够得到最佳效果，可测定与环境条件和内在代谢变化有关的各个参数，以了解环境条件和内在代谢变化有关的各个参数，以了解环境条件和内在代谢变化有关的各个参数，以了解环境条件和内在代谢变化有关的各
39、个参数，以了解产生菌对环境条件的要求和代谢变化规律，并根据产生菌对环境条件的要求和代谢变化规律，并根据产生菌对环境条件的要求和代谢变化规律，并根据产生菌对环境条件的要求和代谢变化规律，并根据各个参数的变化情况，结合代谢调控理论，来各个参数的变化情况，结合代谢调控理论，来各个参数的变化情况，结合代谢调控理论，来各个参数的变化情况，结合代谢调控理论，来有效有效有效有效的控制发酵。的控制发酵。的控制发酵。的控制发酵。一、培养基的影响及其控制定义：定义：用于维持细胞生长的营养物质基质。用于维持细胞生长的营养物质基质。不同微生物对营养要求有很大的差异，培养基的成分不同微生物对营养要求有很大的差异，培养基
40、的成分和配比合适与否，对产生菌的生长发育、发酵单位的和配比合适与否，对产生菌的生长发育、发酵单位的增长，有相当大的影响，同时还影响提取工艺及产品增长，有相当大的影响，同时还影响提取工艺及产品质量。培养基主要包括以下几个方面：质量。培养基主要包括以下几个方面：1.1.碳源碳源作用：作用：构成微生物细胞和各种代谢产物碳架的营养物构成微生物细胞和各种代谢产物碳架的营养物质；降解产生能量，供给微生物生命活动所需的能量。质；降解产生能量，供给微生物生命活动所需的能量。n n种类种类种类种类：葡萄糖葡萄糖n n优点优点优点优点：吸收快，利用快，能吸收快，利用快，能迅速参加代谢合成菌体迅速参加代谢合成菌体和
41、产生能量和产生能量n n缺点：缺点：缺点：缺点：有些品种产生分解产物有些品种产生分解产物 阻遏效应。阻遏效应。碳源种类的影响及控制碳源种类的影响及控制迅速利用的碳源迅速利用的碳源缓慢利用的碳源缓慢利用的碳源n种类：种类：淀粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油n优点：优点：不易产生分解产物 阻遏效应。有利于延长次级代谢产物的分泌期n缺点：缺点：溶解度低，发酵液粘度大。n n 发酵工业中常采用含迅速利用的碳源和缓慢利发酵工业中常采用含迅速利用的碳源和缓慢利发酵工业中常采用含迅速利用的碳源和缓慢利发酵工业中常采用含迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源的混合碳源。用的碳源的混合碳源。用的碳源的混合碳源。用的碳源的
42、混合碳源。n n 迅速利用的碳源迅速利用的碳源迅速利用的碳源迅速利用的碳源满足菌体生长的消耗，满足菌体生长的消耗，满足菌体生长的消耗，满足菌体生长的消耗，缓慢利缓慢利缓慢利缓慢利用的碳源用的碳源用的碳源用的碳源，满足产物合成，可延长合成期，提高，满足产物合成，可延长合成期，提高，满足产物合成，可延长合成期，提高，满足产物合成，可延长合成期，提高产量，并可解除葡萄糖效应。产量，并可解除葡萄糖效应。产量，并可解除葡萄糖效应。产量，并可解除葡萄糖效应。2.氮源作用作用：构成菌体细胞物质，也是细胞合成代谢：构成菌体细胞物质，也是细胞合成代谢产物的成分。产物的成分。n n种类：种类：种类：种类：氨水、铵
43、盐和玉氨水、铵盐和玉米浆米浆n n优点：优点：优点：优点：易被菌体利用，明显易被菌体利用，明显促进菌体生长促进菌体生长n n缺点：缺点：缺点：缺点：对于有些品种高浓度的对于有些品种高浓度的铵离子抑制产物合成铵离子抑制产物合成迅速利用的氮源迅速利用的氮源缓慢利用的氮源缓慢利用的氮源n种类：种类：黄豆饼粉、花生饼粉、和棉子饼粉n优点：优点：利用缓慢，有利于延长次级代谢产物的分泌期。防止早衰。n缺点：缺点：溶解度低，发酵液粘度大。发酵工业中常采用含发酵工业中常采用含迅速利用的氮源迅速利用的氮源和和缓慢缓慢利用的氮源利用的氮源的混合氮源。的混合氮源。迅速利用的氮源促进菌体生长繁殖，缓慢利迅速利用的氮源
44、促进菌体生长繁殖，缓慢利用的碳源，满足产物合成，可延长合成期，用的碳源，满足产物合成，可延长合成期，延缓自溶期。延缓自溶期。氮源种类的控制：氮源种类的控制：3.无机盐和微量元素作用作用：构成菌体原生质体的成分（如构成菌体原生质体的成分（如P P、S)S)；作为酶的组成部分和维持酶的活性作为酶的组成部分和维持酶的活性 (如：如：MgMg、ZnZn、FeFe、CaCa、P P）；）；调节细胞的渗透压（调节细胞的渗透压（NaClNaCl、KClKCl）；）；参与产物的合成（参与产物的合成（P P、S S）4.水作用作用：构成菌体细胞的主要成分，一切营养物质传递：构成菌体细胞的主要成分，一切营养物质传
45、递的介质。的介质。二、温度的影响及其控制n n1.1.1.1.温度的影响温度的影响温度的影响温度的影响n n（1 1 1 1）影响微生物各种酶催化反应的速度和蛋白质）影响微生物各种酶催化反应的速度和蛋白质）影响微生物各种酶催化反应的速度和蛋白质）影响微生物各种酶催化反应的速度和蛋白质的性质；的性质；的性质；的性质；n n微微微微生生生生物物物物可可可可生生生生长长长长的的的的温温温温度度度度范范范范围围围围较较较较广广广广，总总总总体体体体说说说说在在在在-10-10-10-1095959595。在在在在生生生生物物物物学学学学范范范范围围围围内内内内温温温温度度度度每每每每升升升升高高高高1
46、0101010，生生生生长长长长速速速速度度度度通通通通常常常常就就就就加加加加快快快快一一一一倍倍倍倍；温温温温度度度度每每每每升升升升高高高高10101010酶酶酶酶反反反反应应应应速速速速度度度度增增增增加加加加23232323倍；倍；倍；倍；n n（2 2 2 2）影响发酵液的物理性质）影响发酵液的物理性质）影响发酵液的物理性质）影响发酵液的物理性质n n如粘度，基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率，如粘度，基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率，如粘度，基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率，如粘度，基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率，基质的分解和吸收速率，进而影响产物合成。基质的分解
47、和吸收速率，进而影响产物合成。基质的分解和吸收速率，进而影响产物合成。基质的分解和吸收速率，进而影响产物合成。n n故温度对菌体的生长和合成代谢的影响是及其复杂故温度对菌体的生长和合成代谢的影响是及其复杂故温度对菌体的生长和合成代谢的影响是及其复杂故温度对菌体的生长和合成代谢的影响是及其复杂的，须综合考察它对发酵的影响。的，须综合考察它对发酵的影响。的，须综合考察它对发酵的影响。的，须综合考察它对发酵的影响。n n2.2.2.2.影响发酵温度的因素影响发酵温度的因素影响发酵温度的因素影响发酵温度的因素n n发酵液的温度变化受生物热、搅拌热发酵液的温度变化受生物热、搅拌热发酵液的温度变化受生物热
48、、搅拌热发酵液的温度变化受生物热、搅拌热 、蒸发热、蒸发热、蒸发热、蒸发热 、辐射热辐射热辐射热辐射热 和显热的影响，用公式表示为：和显热的影响，用公式表示为：和显热的影响，用公式表示为：和显热的影响，用公式表示为：n nQ Q Q Q发酵发酵发酵发酵Q Q Q Q生物生物生物生物+Q+Q+Q+Q搅拌搅拌搅拌搅拌Q Q Q Q蒸发蒸发蒸发蒸发 Q Q Q Q辐射辐射辐射辐射Q Q Q Q显显显显n n（1 1 1 1）生物热）生物热）生物热）生物热n n生物热是菌体在生长繁殖过程中产生的热能，来生物热是菌体在生长繁殖过程中产生的热能，来生物热是菌体在生长繁殖过程中产生的热能，来生物热是菌体在生
49、长繁殖过程中产生的热能，来自菌体的分解代谢，生物热的大小域菌种、培养自菌体的分解代谢，生物热的大小域菌种、培养自菌体的分解代谢，生物热的大小域菌种、培养自菌体的分解代谢，生物热的大小域菌种、培养基成分和菌体的呼吸强度有关。基成分和菌体的呼吸强度有关。基成分和菌体的呼吸强度有关。基成分和菌体的呼吸强度有关。n n培养基愈丰富，生物热愈大；培养基愈丰富，生物热愈大；培养基愈丰富，生物热愈大；培养基愈丰富，生物热愈大；n n细胞数量愈多，生物热愈大；细胞数量愈多，生物热愈大；细胞数量愈多，生物热愈大；细胞数量愈多，生物热愈大；n n呼吸强度愈高，生物热愈大。呼吸强度愈高，生物热愈大。呼吸强度愈高，生
50、物热愈大。呼吸强度愈高，生物热愈大。（2 2）搅拌热）搅拌热搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量。擦所产生的热量。擦所产生的热量。擦所产生的热量。（3 3 3 3）蒸发热、显热和辐射热）蒸发热、显热和辐射热）蒸发热、显热和辐射热）蒸发热、显热和辐射热空气进入发酵罐，与发酵液充分混合，引起水分蒸空气进入发酵罐，与发酵液充分混合，引起水分蒸空气进入发酵罐，与发酵液充分混合，引起水分蒸空气进入发酵罐，与发酵液充分混合，引起水分蒸所需的热能为所需的热