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1、生物工艺学第四章生物工艺过程中的无菌技术现在学习的是第1页，共43页 目录目录第一章绪论第一章绪论第二章工业微生物菌种选育、制备与保藏第二章工业微生物菌种选育、制备与保藏 第三章工业培养基及其设计第三章工业培养基及其设计 第四章生物工艺过程中的无菌技术第四章生物工艺过程中的无菌技术 第五章生物反应动力学第五章生物反应动力学 第六章第六章 发酵过程原理发酵过程原理第七章第七章 生物反应器及生物工艺过程的放大生物反应器及生物工艺过程的放大第八章第八章 生物反应过程参数检测与控制生物反应过程参数检测与控制 第九章第九章 生物产品分离及纯化技术生物产品分离及纯化技术 第十章第十章 生物产品工艺学及应用
2、生物产品工艺学及应用 现在学习的是第2页，共43页 第四章第四章 生物工艺过程中的无菌技术生物工艺过程中的无菌技术 4.1 生物反应过程中无菌的要求生物反应过程中无菌的要求4.2 工业常用无菌技术工业常用无菌技术4.2.1 干热灭菌干热灭菌 4.2.2 湿热灭菌湿热灭菌 4.2.3 射线灭菌射线灭菌 4.2.4 化学药剂灭菌化学药剂灭菌 4.2.5 过滤除菌过滤除菌 4.3 培养基灭菌培养基灭菌 4.3.1 湿热灭菌原理湿热灭菌原理 4.3.2 分批灭菌分批灭菌 4.3.3 连续灭菌连续灭菌 4.4 空气除菌空气除菌 4.4.1 空气除菌方法空气除菌方法4.4.2 空气除菌流程空气除菌流程 4
3、.5 设备及管道灭菌设备及管道灭菌 现在学习的是第3页，共43页 采取措施对生产过程涉及到的原料、设备等进行灭菌采取措施对生产过程涉及到的原料、设备等进行灭菌处理，达到严格的纯种培养条件。处理，达到严格的纯种培养条件。通常工业上采取的主通常工业上采取的主要措施是：要措施是：(1)对培养基进行灭菌处理；对培养基进行灭菌处理；(2)对好氧过程的空气进行灭菌处理；对好氧过程的空气进行灭菌处理；(3)对生物反应器对生物反应器(发酵罐发酵罐)及其连接管道进行灭菌处理；及其连接管道进行灭菌处理；(4)菌种为无污染的纯粹种子；菌种为无污染的纯粹种子；(5)使生物反应器处于正压环境；使生物反应器处于正压环境；
4、(6)对培养过程中补料进行灭菌处理等。对培养过程中补料进行灭菌处理等。4.1 生物反应过程中无菌的要求生物反应过程中无菌的要求现在学习的是第4页，共43页4.2.1 干热灭菌干热灭菌 4.2 工业常用无菌技术工业常用无菌技术4.2.2 湿热灭菌湿热灭菌 4.2.3 射线灭菌射线灭菌 4.2.4 化学药剂灭菌化学药剂灭菌4.2.5 过滤除菌过滤除菌现在学习的是第5页，共43页干干热热灭灭菌菌时时，微微生生物物主主要要由由于于氧氧化化作作用用而而死死亡亡。最最常常用用的的方方法法有有以下两种：以下两种：(1)(1)灼灼烧烧法法。常常用用于于实实验验室室接接种种针针、勺勺、试试管管或或三三角角瓶瓶口
5、口和和棉棉塞塞的的灭灭菌，也用于工业发酵罐接种时的火环保护。菌，也用于工业发酵罐接种时的火环保护。(2)(2)烘烘箱箱热热空空气气法法。将将物物品品放放入入烘烘箱箱内内，然然后后升升温温至至165165，维维持持2 2小小时时。经经过过烘烘箱箱热热空空气气法法可可以以达达到到彻彻底底灭灭菌菌的的目目的的。该该法法适适用用于于玻玻璃璃、陶陶瓷瓷和和金金属属物物品品的的灭灭菌菌。其其优优点点是是灭灭菌菌后后物物品品干干燥，缺点是操作所需时间长，易损坏物品，对液体样品不适用。燥，缺点是操作所需时间长，易损坏物品，对液体样品不适用。4.2.1 干热灭菌干热灭菌 现在学习的是第6页，共43页利用饱和蒸汽
6、进行灭菌的方法称为湿热利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌。通常湿热灭菌条件为灭菌。通常湿热灭菌条件为121，维持，维持30 min。高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌是实验室、发酵工业生产是实验室、发酵工业生产中最常用的灭菌方法。一般培养基、玻中最常用的灭菌方法。一般培养基、玻璃器皿、无菌水、缓冲液、金属用具等璃器皿、无菌水、缓冲液、金属用具等都可以采用此法灭菌。都可以采用此法灭菌。4.2.2 湿热灭菌湿热灭菌 现在学习的是第7页，共43页射射线线灭灭菌菌是是利利用用紫紫外外线线、高高能能电电磁磁波波或或放放射射性性物物质质产产生生的的高高能能粒粒子子进进行行灭灭菌菌的的方方法法，其其中中以以紫紫外
7、外线线最最常常用用。其其杀杀菌菌作作用用主主要要是是因因为为导导致致DNA胸胸腺腺嘧嘧啶啶间间形形成成胸胸腺腺嘧嘧啶啶二二聚聚体体和和胞胞嘧嘧啶啶水水合合物物，抑抑制制DNA正正常常复复制制。此此外外，空空气气在在紫紫外外线线辐辐射射下下产产生生的的臭臭氧氧有有一一定杀菌作用。定杀菌作用。4.2.3 射线灭菌射线灭菌 现在学习的是第8页，共43页 某些某些化学试剂化学试剂能与微生物发生反应而具有杀菌作用。能与微生物发生反应而具有杀菌作用。常用的化学药剂有常用的化学药剂有酒精、甲醛、漂白粉酒精、甲醛、漂白粉(或次氯酸钠或次氯酸钠)、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐等。高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐等。由于
8、化学药剂也由于化学药剂也会与培养基中的一些成分作用，且加入培养基后易会与培养基中的一些成分作用，且加入培养基后易残留在培养基内，所以，残留在培养基内，所以，化学药剂不能用于培养基的化学药剂不能用于培养基的灭菌，一般应用于发酵工厂环境的消毒。灭菌，一般应用于发酵工厂环境的消毒。4.2.4 化学药剂灭菌化学药剂灭菌现在学习的是第9页，共43页 过滤除菌过滤除菌是利用过滤法阻留微生物以达到除菌是利用过滤法阻留微生物以达到除菌的目的。此法仅的目的。此法仅适用于不耐高温的液体培养基组分适用于不耐高温的液体培养基组分和空气的过滤除菌。和空气的过滤除菌。工业上常用过滤法大量制备无菌工业上常用过滤法大量制备无
9、菌空气，供好氧微生物的液体深层发酵使用。空气，供好氧微生物的液体深层发酵使用。4.2.5 过滤除菌过滤除菌现在学习的是第10页，共43页4.3.1 湿热灭菌原理湿热灭菌原理 4.34.3培养基灭菌培养基灭菌4.3.2 分批灭菌分批灭菌 4.3.3 连续灭菌连续灭菌现在学习的是第11页，共43页4.3.1.1 微生物热阻微生物热阻 每种微生物都有一定的生长每种微生物都有一定的生长温度范围温度范围。当微生物处于生长。当微生物处于生长温温度的下限度的下限时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过生时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过生长长温度的上限温度的上限时，微生物细胞中的蛋白质等大
10、分子物质会发时，微生物细胞中的蛋白质等大分子物质会发生不可逆变性，使微生物在很短的时间内死亡，加热灭菌就生不可逆变性，使微生物在很短的时间内死亡，加热灭菌就是根据微生物的这一特性进行的。是根据微生物的这一特性进行的。一般微生物一般微生物的营养细胞在的营养细胞在60加热加热10min全部死亡，但全部死亡，但细菌芽细菌芽孢孢能耐受较高的温度，在能耐受较高的温度，在100需要数分钟甚至数小时才能被需要数分钟甚至数小时才能被杀灭。某些杀灭。某些嗜热菌的芽孢嗜热菌的芽孢在在120下需下需30min甚至更长时间才甚至更长时间才能杀灭。所以，能杀灭。所以，一般衡量灭菌彻底与否，是以能否杀灭芽孢细菌为一般衡量
11、灭菌彻底与否，是以能否杀灭芽孢细菌为标准。标准。4.3.1 湿热灭菌原理湿热灭菌原理 致死温度：致死温度：杀死微生物的极限温度。杀死微生物的极限温度。致死时间：致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。由于不同种在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。由于不同种类微生物细胞及微生物细胞和微生物孢子对热的抵抗力不同，类微生物细胞及微生物细胞和微生物孢子对热的抵抗力不同，它们的致死温度和致死时间也有很大的差别。它们的致死温度和致死时间也有很大的差别。热阻：热阻：微生物微生物对热的抵抗力，即指微生物在某一特定
12、条件下对热的抵抗力，即指微生物在某一特定条件下(主要是温度主要是温度)的的致死时间。致死时间。相对热阻：相对热阻：指某一条件下的致死时间与另一微生物在相同指某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。条件下的致死时间之比。现在学习的是第12页，共43页 在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速率理论，微生物受热死亡的速率率理论，微生物受热死亡的速率dN/dt在任何瞬间与残在任何瞬间与残留的活菌数留的活菌数N成正比，这就是成正比，这就是对数残留定律，对数残留定律，其数学表达其数学表达式为式为 式中：式中：N残留活菌数，个；残留活菌数，个
13、；t受热时间，受热时间，min；k比死亡速率常数，比死亡速率常数，s-1。k也称灭菌速率常数，也称灭菌速率常数，此常此常数大小与微生物种类及灭菌温度有关；数大小与微生物种类及灭菌温度有关；dN/dt活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。4.3.1.2湿热灭菌的对数残留定律湿热灭菌的对数残留定律若若开开始始灭灭菌菌(t=0)时时，培培养养基基中中活活的的微微生生物物数数为为N0，将将式式上上式式积积分分后可得到后可得到式中：式中：N0开始灭菌时原有的活菌数，个；开始灭菌时原有的活菌数，个；Nt经过经过t时间灭菌后的残留菌数，个。时间灭菌后的残留菌数，个。此式是计算灭菌的
14、基本公式，从式中可知此式是计算灭菌的基本公式，从式中可知灭菌时间取决于污染灭菌时间取决于污染程度程度(N0)、灭菌程度、灭菌程度(残留菌数残留菌数Nt)和和k值。值。亦可看出，如果要求完全彻底灭菌，即残留菌数亦可看出，如果要求完全彻底灭菌，即残留菌数Nt=0时，需要的灭时，需要的灭菌时间为无穷大，菌时间为无穷大，此式即无意义，事实上是不可能的。因此，工程上此式即无意义，事实上是不可能的。因此，工程上进行灭菌设计时，一般采用进行灭菌设计时，一般采用Nt=0.001，即，即在在1000次灭菌中允许有一次次灭菌中允许有一次染菌机会。染菌机会。现在学习的是第13页，共43页 在在实实际际过过程程中中某
15、某些些微微生生物物受受热热死死亡亡的的速速率率是是不不符符合合对对数数残残留留规规律律的的。将将其其N0/Nt对对灭灭菌菌时时间间t在在半半对对数数坐坐标标中中标标绘绘得得到到的的残残留留曲曲线线不不是是直直线线。呈呈现现这这种种热热死死亡亡非非对对数数动动力力学学行行为为的的主主要要是是一一些些微微生生物物芽芽孢孢。有有关关这这一一类类热热死死亡亡动动力力学学的的行行为为，虽虽然然可可用用多多种种模模型型来来描描述述，但但其其中中以以Prokop和和Hunphey所所提提出出的的“菌菌体体循循序序死死亡亡模模型型”最最有有代代表表性性，其其假假设设耐耐热热性性微微生生物物芽芽孢孢的的死死亡亡
16、不不是是突突然然的的，而而是是渐渐变变的的，即即耐耐热热性性芽芽孢孢(R型型)先先转转变变为为对对热热敏敏感感的的中中间间态态芽芽孢孢(S型型)，然后转变成死亡的芽孢，然后转变成死亡的芽孢(D型型)，这一过程可用下式表示，这一过程可用下式表示 NR耐热性活芽孢数耐热性活芽孢数(R型型)；NS敏感性活芽孢数敏感性活芽孢数(S型型)；ND死亡的芽孢数死亡的芽孢数(D型型)；4.3.1.3 湿热灭菌的非对数残留定律湿热灭菌的非对数残留定律根据对数残留定律，联立微分方程可得根据对数残留定律，联立微分方程可得式中：式中：Nt任一时刻具有活力的芽孢数，即任一时刻具有活力的芽孢数，即Nt=NS+NR；N0初
17、始的活芽孢数；初始的活芽孢数；kR耐热性芽孢的比死亡速率，耐热性芽孢的比死亡速率，s-1；kS敏感性芽孢的比死亡速率，敏感性芽孢的比死亡速率，s-1。在温度相同时，对数与非对数定律的灭菌时间在温度相同时，对数与非对数定律的灭菌时间t不同。不同。现在学习的是第14页，共43页 当培养基受热温度从当培养基受热温度从T1上升至上升至T2时，微生物的比死亡速率常数时，微生物的比死亡速率常数k和和培养基成分分解破坏的速率常数培养基成分分解破坏的速率常数k变化情况为变化情况为对微生物的死亡情况而言对微生物的死亡情况而言将上述两式相除并取对数后可得将上述两式相除并取对数后可得 培养基成分的破坏，培养基成分的
18、破坏，同样也可得同样也可得两式相除得两式相除得 4.3.1.4 灭菌温度和时间的选择灭菌温度和时间的选择 在在生生产产中中必必须须选选择择既既能能达达到到灭灭菌菌目目的的，又又能能使使培培养养基基成成分分破破坏坏减减少少至至最少的工艺条件。最少的工艺条件。微生物的受热死亡属于单分子反应，微生物的受热死亡属于单分子反应，其灭菌速率常数其灭菌速率常数k与温度之与温度之间的关系可用间的关系可用阿伦尼乌斯方程阿伦尼乌斯方程表示：表示：式中：式中：A阿伦尼乌斯常数，阿伦尼乌斯常数，s-1；R气体常数，气体常数，8.314J/(molK)；T热力学温度，热力学温度，K；E微生物死亡活化能，微生物死亡活化能
19、，J/mol。大部分培养基的破坏也可认为是一级分解反应，大部分培养基的破坏也可认为是一级分解反应，若其他条件不若其他条件不变，培养基成分分解速率常数和温度的关系也可用阿伦尼乌斯变，培养基成分分解速率常数和温度的关系也可用阿伦尼乌斯方程表示。方程表示。现在学习的是第15页，共43页4.3.1.4 灭菌温度和时间的选择灭菌温度和时间的选择灭菌温度灭菌温度/完全灭菌时间完全灭菌时间/min维生素维生素B1破坏量破坏量/%10040099.3110366711515501204271300.581450.0821500.011灭菌温度和完全灭菌时间对灭菌温度和完全灭菌时间对维生素维生素B1破坏量的比较
20、破坏量的比较 由于由于灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分破坏的灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分破坏的活化能活化能E，因此随着温度的上升，微生物比死亡速率常数因此随着温度的上升，微生物比死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分破坏分解速率常数的增加倍数。增加倍数要大于培养基成分破坏分解速率常数的增加倍数。也就是说，当灭菌温度升高时，微生物死亡速率大于培养基也就是说，当灭菌温度升高时，微生物死亡速率大于培养基成分破坏的速率。根据这一理论，培养基灭菌一般选择成分破坏的速率。根据这一理论，培养基灭菌一般选择高温高温快速灭菌法，快速灭菌法，换言之，为达到目的相同的灭菌效果，提高灭菌温度换言之，为达
21、到目的相同的灭菌效果，提高灭菌温度可以明显缩短灭菌时间，并可减少培养基因受热时间长而遭到破坏的可以明显缩短灭菌时间，并可减少培养基因受热时间长而遭到破坏的损失。损失。现在学习的是第16页，共43页 不同成分的培养基其含菌量是不同成分的培养基其含菌量是不同的。不同的。培养基中微生物数量越多，培养基中微生物数量越多，达到无菌要求所需的灭菌时间也越达到无菌要求所需的灭菌时间也越长。长。天然基质培养基，天然基质培养基，特别是营养丰特别是营养丰富或变质的原料中含菌量远比化工富或变质的原料中含菌量远比化工原料的含菌量多，因此，灭菌时间原料的含菌量多，因此，灭菌时间要适当延长。要适当延长。含芽孢杆菌多的培养
22、含芽孢杆菌多的培养基，基，要适当提高灭菌温度并延长灭要适当提高灭菌温度并延长灭菌时间。菌时间。4.3.1.5 影响培养基灭菌的其他因素影响培养基灭菌的其他因素培养基成分培养基成分培养基培养基pH培养基物理状态培养基物理状态泡沫泡沫微生物数量微生物数量 pH对微生物的耐热性影对微生物的耐热性影响很大，响很大，pH为为6.08.0时微生时微生物耐热能力最强，物耐热能力最强，pH小于小于6.0时，时，H+易渗入微生物细胞内，易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死改变细胞的生理反应促使其死亡。所以亡。所以培养基培养基pH愈低，灭菌愈低，灭菌所需时间愈短。所需时间愈短。固体培养基的灭菌时间要比液
23、体培养固体培养基的灭菌时间要比液体培养基的灭菌时间长，基的灭菌时间长，假如假如100时液体培养基时液体培养基的灭菌时间为的灭菌时间为1h，而固体培养基则需要，而固体培养基则需要23h才能达到同样的灭菌效果。其原因在于液体才能达到同样的灭菌效果。其原因在于液体培养基灭菌时，热的传递除了培养基灭菌时，热的传递除了传导作用传导作用外还外还有有对流作用，对流作用，而固体培养基则只有传导作而固体培养基则只有传导作用而没有对流作用，另外液体培养基中水用而没有对流作用，另外液体培养基中水的的传热系数传热系数要比有机固体物质大得多。要比有机固体物质大得多。泡沫中的空气形成隔热层，泡沫中的空气形成隔热层，使传热
24、困难，对灭菌极为不使传热困难，对灭菌极为不利。因此对易产生泡沫的培利。因此对易产生泡沫的培养基进行灭菌时，可加入少养基进行灭菌时，可加入少量消泡剂。量消泡剂。油脂、糖类及一定浓度的蛋白质油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加增加了微生物的耐热性，了微生物的耐热性，高浓度有机物会高浓度有机物会在细胞的周围形成一层薄膜，从而影在细胞的周围形成一层薄膜，从而影响热的传入。所以灭菌温度应高些。响热的传入。所以灭菌温度应高些。例如，大肠杆菌在水中加热到例如，大肠杆菌在水中加热到6065便死亡，在便死亡，在10%的糖液中，需的糖液中，需70处理处理46min，而在，而在30%的糖液中的糖液中则需则需70处理处理
25、30min。现在学习的是第17页，共43页4.3.2 分批灭菌分批灭菌 培养基的分批灭菌培养基的分批灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或生物就是将配制好的培养基放在发酵罐或生物反应器中，通入蒸汽将培养基和所用设备仪器进行灭菌的操作过程，反应器中，通入蒸汽将培养基和所用设备仪器进行灭菌的操作过程，也称为也称为实罐灭菌实罐灭菌，而若反应中没有物料，则称为，而若反应中没有物料，则称为空消空消，空消是，空消是对发酵罐设备及其周边连接管道进行灭菌处理。对发酵罐设备及其周边连接管道进行灭菌处理。优点：优点：培养基的分批灭菌不需要专门的灭菌设备，对蒸汽要培养基的分批灭菌不需要专门的灭菌设备，对蒸汽要求低，投
26、资少，设备简单，灭菌效果可靠。求低，投资少，设备简单，灭菌效果可靠。缺点缺点：蒸汽消耗量大，造成锅炉负荷波动大；灭菌温度低时间长以蒸汽消耗量大，造成锅炉负荷波动大；灭菌温度低时间长以及升降温时间长，对培养基破坏大。及升降温时间长，对培养基破坏大。应用：应用：分批灭菌是中、小型发酵罐经常采用的一种培养基灭菌方分批灭菌是中、小型发酵罐经常采用的一种培养基灭菌方法。法。分分批批灭灭菌菌在在所所用用的的发发酵酵罐罐中中进进行行。将将培培养养基基在在配配制制罐罐中中配配好好以以后后，用用泵泵通通过过专专用用管管道道输输入入发发酵酵罐罐中中，然然后后用用直直接接蒸蒸汽汽或或间间接接蒸蒸汽汽加加热热到到灭灭
27、菌菌温温度度(一一般般121)在在此此温温度度维维持持一一定定时时间间，再再冷冷却却到到发发酵酵所所需需温温度，完成灭菌过程。度，完成灭菌过程。分分批批灭灭菌菌过过程程包包括括升升温温、维维持持和和冷冷却却三三个个阶阶段段，通通常常100以以下下的的温温度度对对灭灭菌菌没没有有太太多多贡贡献献，在在实实际际过过程程中中是是忽忽略略的的，升升温温是是指指从从100升升到到121的的情情况况，而而冷冷却却是是指指121冷冷却却到到100时时的的情情况况，在在这这两两个个温温度度段，加热升温和冷却对灭菌是有贡献的。段，加热升温和冷却对灭菌是有贡献的。为为了了使使灭灭菌菌处处理理得得到到期期望望的的结
28、结果果，Deindoerfer引引入入了了来来测测定定灭菌度灭菌度(N0/N)。ln Deindoerfer还假设各阶段灭菌效果可以叠加，即还假设各阶段灭菌效果可以叠加，即 总总加热加热维持维持冷却冷却ln 现在学习的是第18页，共43页现在学习的是第19页，共43页现在学习的是第20页，共43页现在学习的是第21页，共43页4.3.2 分批灭菌分批灭菌 例：例：一万升培养基在发酵罐中于一万升培养基在发酵罐中于121分批灭菌，各阶段的时间分别为：升温分批灭菌，各阶段的时间分别为：升温从从100121，37分钟，保持分钟，保持121，10分钟，从分钟，从121冷却到冷却到100，13分钟，分钟，
29、计算计算总。总。解：解：由表由表45，从，从100121的的值累加为值累加为11.36，由于实际升温过程为，由于实际升温过程为37分分钟，而不是钟，而不是20分钟，实际有更多的灭菌处理。则：分钟，实际有更多的灭菌处理。则：加热加热11.3637/2021.016同样，从同样，从121冷却到冷却到100，在，在20分钟时间内分钟时间内值为值为11.36，由于实际冷却时间，由于实际冷却时间为为13分钟，灭菌过程实际更少，则分钟，灭菌过程实际更少，则冷却冷却11.3613/207.384保持阶段保持阶段.kt，k1.83(121)保持保持1.831018.3所以，所以，总总加热加热维持维持冷却冷却2
30、1.0167.38418.346.7 一般来说，在培养基分批灭菌，使用一般来说，在培养基分批灭菌，使用Richards方法计算有大约方法计算有大约5的偏的偏差，其最大优点是计算简单，这样，在灭菌过程中可很快调整灭菌过程中出现差，其最大优点是计算简单，这样，在灭菌过程中可很快调整灭菌过程中出现的失误。的失误。现在学习的是第22页，共43页分批灭菌操作：分批灭菌操作：发酵罐上一般装有发酵罐上一般装有空气管道，空气管道，取样用的取样用的取样管道，取样管道，放料用放料用的的出料管道，接种管道，消泡管道，补料管道，出料管道，接种管道，消泡管道，补料管道，调节调节pH用的用的酸碱管道酸碱管道以及控制培养温
31、度用的以及控制培养温度用的降温水管道。降温水管道。降温水管是与夹套降温水管是与夹套或蛇管连接，与发酵罐内部不相通。或蛇管连接，与发酵罐内部不相通。4.3.2 分批灭菌分批灭菌 注意事项：注意事项：灭菌之前，进行灭菌之前，进行分空气过滤器灭菌并用空气吹干。分空气过滤器灭菌并用空气吹干。放去夹套或蛇管中的冷水，放去夹套或蛇管中的冷水，进料完毕，并进料完毕，并开动搅拌器开动搅拌器以防料液沉淀。以防料液沉淀。开始灭菌时，开启夹套蒸汽阀，缓慢进蒸汽，使开始灭菌时，开启夹套蒸汽阀，缓慢进蒸汽，使料液间接加热至料液间接加热至80 左右左右后关闭夹套蒸汽阀。后关闭夹套蒸汽阀。从取样管和放料管从取样管和放料管向
32、罐内通入蒸汽，向罐内通入蒸汽，培养基温度达到培养基温度达到121，罐压达，罐压达1105Pa(表压表压)时，安装在发酵罐上封头的接种、补料、消泡剂、酸、时，安装在发酵罐上封头的接种、补料、消泡剂、酸、碱管道应排气，并调节好各进气和排气阀门，使罐压和温度保持在碱管道应排气，并调节好各进气和排气阀门，使罐压和温度保持在这一水平进行保温。这一水平进行保温。在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道以及显示镜管都应通入蒸在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道以及显示镜管都应通入蒸汽，在液面上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能汽，在液面上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死保证灭菌彻底
33、，不留死角。角。保温结束后，依次关闭各排气，进气阀门，待罐内压力低于空气保温结束后，依次关闭各排气，进气阀门，待罐内压力低于空气压力后，压力后，向罐内通入无菌空气，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水，使培养基温在夹套或蛇管中通冷却水，使培养基温度降到所需温度。度降到所需温度。现在学习的是第23页，共43页培养基的连续灭菌培养基的连续灭菌就是将配好的就是将配好的培养基在向发酵罐等培养装置培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和输送的同时进行加热、保温和冷却的灭菌过程冷却的灭菌过程。图图4-1 连续灭菌过程中温度变化连续灭菌过程中温度变化优优点点：培培养养基基成成分分破破坏坏少
34、少；发发酵酵罐罐利利用用率率高高；提提高高产产量量；产产品品质质量量较较易易控控制制；蒸蒸汽汽负负荷荷均均衡衡，锅锅炉炉利利用用率率高高，操作方便；操作方便；适宜采用自动控制；适宜采用自动控制；降低劳动强度。降低劳动强度。4.3.3 连续灭菌连续灭菌缺缺点点：气气压压要要求求高高于于0.5MP；灭菌设备复杂，投资大。灭菌设备复杂，投资大。现在学习的是第24页，共43页常用连续灭菌工艺流程常用连续灭菌工艺流程u 4.3.3.1 连消塔连消塔喷淋冷却流程喷淋冷却流程 u 4.3.3.2 喷射加热喷射加热真空冷却流程真空冷却流程u 4.3.3.3 板式换热器灭菌流程板式换热器灭菌流程现在学习的是第2
35、5页，共43页4.3.3.1 连消塔连消塔喷淋冷却流程喷淋冷却流程1-配料预热罐配料预热罐 2-连消泵连消泵 3-连消塔连消塔 4-维持罐维持罐 5-喷淋冷却器喷淋冷却器图图4-2 连消塔连消塔-喷淋冷却流程喷淋冷却流程配好的培养基用泵打人配好的培养基用泵打人连消塔与蒸汽直接混合，连消塔与蒸汽直接混合，达到灭菌温度后进入维达到灭菌温度后进入维持罐，维持一定时间后持罐，维持一定时间后经喷淋冷却器冷却至一经喷淋冷却器冷却至一定温度后进入发酵罐。定温度后进入发酵罐。现在学习的是第26页，共43页基本设备一般包括：基本设备一般包括：配料预热罐，配料预热罐，将配好的料液预热到将配好的料液预热到6070，
36、以避免灭菌时由于，以避免灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；连消塔，连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混合，并使料液的温度很快升高到灭菌温度合，并使料液的温度很快升高到灭菌温度(126132)；维持罐，维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，需要在维持罐高温保温；够的，需要在维持罐高温保温；冷却管，冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却管进行冷却，生产从维持罐出来的料液要经过冷却管进行冷却，生产上一般采用冷却水喷淋冷却，冷
37、却到上一般采用冷却水喷淋冷却，冷却到4050后，输送到预先已后，输送到预先已经灭菌过的罐内。经灭菌过的罐内。4.3.3.1 连消塔连消塔喷淋冷却流程喷淋冷却流程现在学习的是第27页，共43页图图4-3 喷射加热喷射加热-真空冷却流程真空冷却流程4.3.3.2 喷射加热喷射加热真空冷却流程真空冷却流程 培养基用泵打入培养基用泵打入喷射加热器，喷射加热器，以较高速度自喷嘴喷以较高速度自喷嘴喷出，借高速流体的抽吸作用与蒸汽混合后进人管道出，借高速流体的抽吸作用与蒸汽混合后进人管道维维持器，持器，经一定维持时间后通过一膨胀阀进入经一定维持时间后通过一膨胀阀进入真空闪真空闪急蒸发室，急蒸发室，因真空作用
38、使水分急骤蒸发而冷却到因真空作用使水分急骤蒸发而冷却到7080左右，再进入发酵罐冷却到接种温度。左右，再进入发酵罐冷却到接种温度。流程优点：流程优点：加热和冷却在瞬间完成，营养成分破坏最加热和冷却在瞬间完成，营养成分破坏最少。少。注意：注意：恒定灭菌温度的控制恒定灭菌温度的控制 现在学习的是第28页，共43页图图4-4 薄板换热器连续灭菌流程薄板换热器连续灭菌流程 4.3.3.3 板式换热器灭菌流程板式换热器灭菌流程 流程中流程中采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，培培养液在设备中同时完成预热、灭菌及冷却过程。养液在设备中同时完成预热、灭菌及冷却
39、过程。利用板式热交换器进行连续灭菌时，加热和冷却培养液所需要的利用板式热交换器进行连续灭菌时，加热和冷却培养液所需要的时间时间比使用喷射式连续灭菌稍长，但灭菌周期比间歇灭菌短得多。比使用喷射式连续灭菌稍长，但灭菌周期比间歇灭菌短得多。由于灭菌培养液的预热过程同时为灭菌培养液的冷却过程，所以由于灭菌培养液的预热过程同时为灭菌培养液的冷却过程，所以节节约了蒸汽及冷却水的用量。约了蒸汽及冷却水的用量。现在学习的是第29页，共43页连续灭菌优势：连续灭菌优势：1、高温快速灭菌，、高温快速灭菌，对培养基成分破坏少；对培养基成分破坏少；2、耐热性物料和热敏性物料可在不同温度下、耐热性物料和热敏性物料可在不
40、同温度下分开灭菌；分开灭菌；碳源和碳源和氮源可分开灭菌，以免醛基和氨基发生反应生成有害物。氮源可分开灭菌，以免醛基和氨基发生反应生成有害物。需注意：需注意：1、黏度高或固体成分多的培养基连续灭菌，必须、黏度高或固体成分多的培养基连续灭菌，必须避免管道过避免管道过长，长，或尽可能将淀粉质原料先液化。或尽可能将淀粉质原料先液化。2、采用连续灭菌时，发酵罐应、采用连续灭菌时，发酵罐应提前空消，提前空消，加热器、维持罐及加热器、维持罐及冷却器也应先灭菌。冷却器也应先灭菌。现在学习的是第30页，共43页 4.4.1 空气除菌方法空气除菌方法4.4 空气除菌空气除菌 4.4.2 空气除菌流程空气除菌流程
41、空空气气除除菌菌就就是是除除去去或或杀杀灭灭空空气气中中的的微微生生物物，可可使使用用介介质质过过滤滤、辐辐射射、化化学学药药品品、加加热热、静静电电吸吸附附等等方方法法。其其中中，介介质质过过滤滤和和静静电电吸吸附附方方法法是是利利用用分分离离过过程程把把微微生生物物粒粒子子除除去去，其其余余的的方方法法是是使使微微生物蛋白质变性失活。生物蛋白质变性失活。现在学习的是第31页，共43页4.4.1.1 热杀菌热杀菌 热杀菌热杀菌是一种有效的、可靠的方法。是一种有效的、可靠的方法。采用蒸汽或电加热空气；采用蒸汽或电加热空气；利利用用空空气气被被压压缩缩时时产产生生的的热热量量进进行行加加热热保保
42、温温杀杀菌菌，并并安安装装分分过过滤滤器器将将空空气气进进一一步步过过滤滤，然然后后再再进进入入发发酵酵罐。罐。现在学习的是第32页，共43页 X-射射线线、-射射线线、紫紫外外线线、超超声声波波、-射射线线等等从理论上都能破坏蛋白质活性而起杀菌作用。从理论上都能破坏蛋白质活性而起杀菌作用。但但应应用用较较广广泛泛的的还还是是紫紫外外线线，它它的的波波长长在在253.72256 nm时时杀杀菌菌效效力力最最强强，它它的的杀杀菌菌力力与与紫紫外外线线的的强强度度成成正正比比，与与距距离离的的平平方方成成反反比比。紫紫外外线线通通常常用用于于超超净净台台、无无菌菌室室和和医医院院手手术术室室等等空
43、空气气对对流流不不大大的的环环境境消消毒毒杀杀菌菌。但但杀杀菌菌效效率率低低，杀杀菌菌时时间间长长，一一般般要要结结合合甲醛或苯酚喷雾等来保证无菌室的高度无菌。甲醛或苯酚喷雾等来保证无菌室的高度无菌。4.4.1.2辐射杀菌辐射杀菌现在学习的是第33页，共43页4.4.1.3 静电除菌静电除菌 静电除尘静电除尘是利用静电引力吸附带电粒子而达到除是利用静电引力吸附带电粒子而达到除菌除尘的目的，主要去除空气中的水雾、油雾、尘菌除尘的目的，主要去除空气中的水雾、油雾、尘埃和微生物。埃和微生物。常用于洁净工作台和洁净室所需无菌常用于洁净工作台和洁净室所需无菌空气的预处理，再配合高效过滤器使用。空气的预处
44、理，再配合高效过滤器使用。悬浮于空气中的微生物，其孢子大多带有不同悬浮于空气中的微生物，其孢子大多带有不同的电荷；没有带电荷的微粒在进入高压静电场时都的电荷；没有带电荷的微粒在进入高压静电场时都会被电离变成带电微粒。会被电离变成带电微粒。现在学习的是第34页，共43页4.4.1.4 过滤除菌法过滤除菌法 过滤除菌过滤除菌是目前最常用的空气除菌方法，是目前最常用的空气除菌方法，它采用定期灭它采用定期灭菌的干燥介质来阻截滤过的空气所含的微生物，从而获菌的干燥介质来阻截滤过的空气所含的微生物，从而获得无菌空气。得无菌空气。原理：原理：微粒随空气流通过过滤层时滤层纤维所形成的网微粒随空气流通过过滤层时
45、滤层纤维所形成的网格阻碍气流前进，使气流无数次改变运动速度和运动方向格阻碍气流前进，使气流无数次改变运动速度和运动方向而绕过纤维前进，这些改变引起微粒对滤层纤维产生而绕过纤维前进，这些改变引起微粒对滤层纤维产生惯性惯性冲击、重力沉降、拦截滞留、布朗扩散、静电吸引冲击、重力沉降、拦截滞留、布朗扩散、静电吸引等作用而等作用而把微粒截留在纤维表面。把微粒截留在纤维表面。现在学习的是第35页，共43页4.4.2 空气除菌流程空气除菌流程 空气除菌流程空气除菌流程是按发酵生产时是按发酵生产时对无菌空气的要求，对无菌空气的要求，如无菌程度、空气压力、温度和湿度等，并结合如无菌程度、空气压力、温度和湿度等，
46、并结合采采气环境的空气条件气环境的空气条件和和所用除菌设备的特性，所用除菌设备的特性，根据空气根据空气的性质制定的。的性质制定的。吸风条件吸风条件 压缩和鼓风压缩和鼓风 冷却冷却 除水去油雾除水去油雾 过滤过滤 现在学习的是第36页，共43页4.4.2 空气除菌流程空气除菌流程4.4.2.1 两极冷却、加热除菌流程两极冷却、加热除菌流程4.4.2.2 冷热空气直接混合式空气除菌流程冷热空气直接混合式空气除菌流程4.4.2.3 高效前置过滤空气除菌流程高效前置过滤空气除菌流程4.4.2.4 利用热空气加热冷空气的流程利用热空气加热冷空气的流程现在学习的是第37页，共43页4.4.2.1 两极冷却
47、、加热除菌流程两极冷却、加热除菌流程旋旋风风分分离离器器特特点点：两两次次冷冷却却、两两次次分分离离、适适当当加加热热。两两次次冷冷却却、两两次次分分离离油油水的好处是能提高传热系数，节约冷却水，油水分离得比较完全。水的好处是能提高传热系数，节约冷却水，油水分离得比较完全。适适用用：比比较较完完善善的的除除菌菌流流程程，能能适适应应各各种种气气候候条条件件，充充分分分分离离油油水水，尤其适用潮湿的地区及对无菌程度要求比较高的微生物工程产品。尤其适用潮湿的地区及对无菌程度要求比较高的微生物工程产品。现在学习的是第38页，共43页4.4.2.2冷热空气直接混合式空气除菌流程冷热空气直接混合式空气除
48、菌流程 1-粗过滤器粗过滤器;2-压缩机压缩机;3-贮罐贮罐;4-冷却器冷却器;5-丝网分离器丝网分离器;6-过滤器过滤器图图4-6 冷热空气直接混合式空气除菌流程冷热空气直接混合式空气除菌流程 压缩空气从贮罐出来后分成两部分，压缩空气从贮罐出来后分成两部分，一部分进入冷却器，一部分进入冷却器，冷却到较低温度，经分离器分离水、油雾后与另一部分冷却到较低温度，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合，此时混合空气已达到温未处理过的高温压缩空气混合，此时混合空气已达到温度为度为3035，相对湿度为，相对湿度为5060的要求，再进入过滤器的要求，再进入过滤器过滤过滤特点：特点：省去
49、二次冷却、分离设备和空气加热设备，省去二次冷却、分离设备和空气加热设备，流程比流程比较简单，较简单，利用压缩空气来加热析水后的空气，利用压缩空气来加热析水后的空气，冷却水用量少等。冷却水用量少等。适用：适用：中等含湿地区，中等含湿地区，但不适合于空气含湿量高的地区。但不适合于空气含湿量高的地区。现在学习的是第39页，共43页4.4.2.3 高效前置过滤空气除菌流程高效前置过滤空气除菌流程 特点：特点：采用了高效前置过滤设备，采用了高效前置过滤设备，降低了主过滤器的负荷；降低了主过滤器的负荷；使空气经过多次过滤，因而使空气经过多次过滤，因而所得的空气无菌程度比较高。所得的空气无菌程度比较高。现在
50、学习的是第40页，共43页4.4.2.4 利用热空气加热冷空气的流程利用热空气加热冷空气的流程1-高空采风高空采风;2-压缩机压缩机;3-贮罐贮罐;4-冷却器冷却器;5-丝网分离器丝网分离器;6-加热器加热器7-过滤器过滤器 它利用压缩后热空气和冷却后的冷空气进行交换，使冷空气它利用压缩后热空气和冷却后的冷空气进行交换，使冷空气的温度升高，降低相对湿度。的温度升高，降低相对湿度。特点：特点：对热能利用比较合理，对热能利用比较合理，热交换还可以兼做贮气罐，但由于热交换还可以兼做贮气罐，但由于气气-气交换的传热系数很小，加热面积要足够大才能满足要求。气交换的传热系数很小，加热面积要足够大才能满足要