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1、关于现代微生物生态学现在学习的是第1页，共46页现代生态学的研究领域现代生态学的研究领域现代生态学要回答和解决的主要问题现代生态学要回答和解决的主要问题微生物生态系统多样性微生物生态系统多样性微生物生态学研究方法微生物生态学研究方法传统方法传统方法分子生物学方法分子生物学方法微生物酶活性测定微生物酶活性测定现在学习的是第2页，共46页1现代生态学的研究领域现代生态学的研究领域l生态系统中种群规模的调控生态系统中种群规模的调控l生物生产力的利用和保护生物生产力的利用和保护l研究人工生物群落的稳定性和提高生产力研究人工生物群落的稳定性和提高生产力l环境污染防治环境污染防治l城市生态系统生态学和人类
2、生态学的研究和城市生态系统生态学和人类生态学的研究和建设建设现在学习的是第3页，共46页2现代生态学要研究与解决的主要问题现代生态学要研究与解决的主要问题l能源短缺问题能源短缺问题l环境污染问题环境污染问题l防止自然生态系统的萎缩、保护森林，防止沙漠化等防止自然生态系统的萎缩、保护森林，防止沙漠化等l城市有机废弃物的处理及综合利用的生态工程城市有机废弃物的处理及综合利用的生态工程l建立高产高效、持续发展的生态农业和企业化生态工厂。如：建立高产高效、持续发展的生态农业和企业化生态工厂。如：白色农业白色农业l生命活动密切相关元素、化合物及生态效应与人体健康关系。生命活动密切相关元素、化合物及生态效
3、应与人体健康关系。l海洋资源的生态调查、开发利用、保护的研究海洋资源的生态调查、开发利用、保护的研究现在学习的是第4页，共46页3微生物生态系统多样性微生物生态系统多样性u陆生微生物生态系统陆生微生物生态系统u水生微生物生态系统水生微生物生态系统u大气微生物生态系统大气微生物生态系统u根系微生物生态系统根系微生物生态系统u肠道肠道(消化道消化道)微生物生态系统微生物生态系统u极端环境微生物生态系统极端环境微生物生态系统u活性污泥微生物生态系统活性污泥微生物生态系统u“生物膜生物膜”微生物生态系统微生物生态系统现在学习的是第5页，共46页海洋古菌的分布海洋古菌的分布海洋真细菌的分布海洋真细菌的分
4、布海洋真菌的分布海洋真菌的分布海洋真核微藻的分布海洋真核微藻的分布海洋病毒的分布海洋病毒的分布海洋微生物的分布现在学习的是第6页，共46页海洋古菌的分布海洋古菌的分布古菌的绝对数量大约占微型浮游生物的古菌的绝对数量大约占微型浮游生物的2%2%。表层海水中多为广域古菌，而在表层海水中多为广域古菌，而在150150米深以下的水域中则以泉古米深以下的水域中则以泉古菌为主。菌为主。浮游古菌的分布还受到季节、海水温度和海流等环境因素影响。浮游古菌的分布还受到季节、海水温度和海流等环境因素影响。不同海域、不同深度的沉积物中古菌分布不均。不同海域、不同深度的沉积物中古菌分布不均。同一海域沉积物中，影响古菌分
5、布的主要因素是有机物。同一海域沉积物中，影响古菌分布的主要因素是有机物。海底火山口主要分布为泉古菌，少量为广古菌。海底火山口主要分布为泉古菌，少量为广古菌。海底热泉口主要分布嗜热古菌（典型类群为热网菌属海底热泉口主要分布嗜热古菌（典型类群为热网菌属PyrodictiumPyrodictium和火叶菌属和火叶菌属PyrolobusPyrolobus）。）。海海海海洋洋洋洋浮浮浮浮游游游游古古古古菌菌菌菌沉沉沉沉积积积积物物物物中中中中古古古古菌菌菌菌特特特特殊殊殊殊生生生生境境境境古古古古菌菌菌菌现在学习的是第7页，共46页大多数古菌难以分离培养，主要利用分子生物学技术进行多样性研究。近大多数古
6、菌难以分离培养，主要利用分子生物学技术进行多样性研究。近大多数古菌难以分离培养，主要利用分子生物学技术进行多样性研究。近大多数古菌难以分离培养，主要利用分子生物学技术进行多样性研究。近几年在沿岸水域发现海洋古菌群几年在沿岸水域发现海洋古菌群几年在沿岸水域发现海洋古菌群几年在沿岸水域发现海洋古菌群和和和和海洋古菌群海洋古菌群海洋古菌群海洋古菌群，在不透光层以下，在不透光层以下，在不透光层以下，在不透光层以下海域发现海域发现海域发现海域发现海洋古菌群海洋古菌群海洋古菌群海洋古菌群，在深海海水中发现，在深海海水中发现，在深海海水中发现，在深海海水中发现海洋古菌群海洋古菌群海洋古菌群海洋古菌群。泉古菌
7、目泉古菌目泉古菌目泉古菌目广古菌目广古菌目广古菌目广古菌目现在学习的是第8页，共46页现在学习的是第9页，共46页The marine sponge Axinella mexicana and its archaeal symbiont,Cenarchaeum symbiosum.3A.,Axinella mexicana a bright red demosponge found off the California coast.3C.,FISH experiment showing C.symbiosum population present in the sponge tissues(i
8、n green).Many of the C.symbiosum cells are visibly dividing.现在学习的是第10页，共46页海洋真细菌的分布海洋真细菌的分布海洋浮游细菌分布受可利用有机物、季节、深度、盐度、及海洋浮游细菌分布受可利用有机物、季节、深度、盐度、及叶绿素浓度影响较大而区域性差异影响较小。叶绿素浓度影响较大而区域性差异影响较小。沉积物中的海洋细菌分布表现区带化特征。沉积物中的海洋细菌分布表现区带化特征。海洋浮游细菌主要属于海洋浮游细菌主要属于-变形菌纲、变形菌纲、-变形菌、拟杆菌纲变形菌、拟杆菌纲等。等。海底沉积物中酸杆菌门、海底沉积物中酸杆菌门、-变形菌纲
9、、变形菌纲、-变形菌、变形菌、-变形变形菌纲、拟杆菌纲等多种类型菌种。菌纲、拟杆菌纲等多种类型菌种。近年来，不断有从海洋中新类群的发现。近年来，不断有从海洋中新类群的发现。海海海海洋洋洋洋细细细细菌菌菌菌现在学习的是第11页，共46页海洋真细菌的分布海洋真细菌的分布浮游放线菌是海洋放线菌的重要组成部分，数量浮游放线菌是海洋放线菌的重要组成部分，数量处于中等丰度水平，相关报道较少。处于中等丰度水平，相关报道较少。海洋沉积物中最重要的真细细类群。其中浅海区海洋沉积物中最重要的真细细类群。其中浅海区以链霉菌为主，也有较多游动放线菌；而深海区以链霉菌为主，也有较多游动放线菌；而深海区沉积物中的优势放线
10、菌为小孢囊菌和诺卡氏菌。沉积物中的优势放线菌为小孢囊菌和诺卡氏菌。无脊椎动物及海洋植物的表面或体内存在着相当无脊椎动物及海洋植物的表面或体内存在着相当部分的海洋放细线菌，研究得较多的是海绵。部分的海洋放细线菌，研究得较多的是海绵。海海海海洋洋洋洋放放放放线线线线菌菌菌菌现在学习的是第12页，共46页海洋真细菌的分布海洋真细菌的分布迄今为止发现的海洋蓝细菌主要属于原绿球藻属迄今为止发现的海洋蓝细菌主要属于原绿球藻属（ProchlorococcusProchlorococcus）和聚球藻属（）和聚球藻属（SynechococcusSynechococcus）。是海）。是海洋初级生产者的重要组成洋初
11、级生产者的重要组成聚球菌分布于热带和温带海域。粒径为聚球菌分布于热带和温带海域。粒径为0.5-1.5um0.5-1.5um。通常比其消费。通常比其消费者微型原生动物至少高一个数量级，足以作为微型原生动物的重者微型原生动物至少高一个数量级，足以作为微型原生动物的重要食物源。对总初级生产力的贡献在世界大多数海区为要食物源。对总初级生产力的贡献在世界大多数海区为20-6020-60原绿球菌原绿球菌(Prochlorococcus)(Prochlorococcus)分布广泛。粒径为分布广泛。粒径为0.4-0.8um0.4-0.8um。丰度。丰度大于聚球菌，对总初级生产力的贡献约为大于聚球菌，对总初级生
12、产力的贡献约为50%50%海海洋洋蓝蓝细细菌菌现在学习的是第13页，共46页海洋真菌的分布海洋真菌的分布木生真菌木生真菌木生真菌木生真菌藻体真菌藻体真菌藻体真菌藻体真菌红树林真菌红树林真菌红树林真菌红树林真菌海草真菌海草真菌海草真菌海草真菌寄生动物体真菌寄生动物体真菌寄生动物体真菌寄生动物体真菌海底沉积物真菌海底沉积物真菌海底沉积物真菌海底沉积物真菌存在于漂流木、沉积木。多数为子囊菌。其分布特点为存在于漂流木、沉积木。多数为子囊菌。其分布特点为热带海域和浅海较广泛。种类与丰度受季节及附着基质热带海域和浅海较广泛。种类与丰度受季节及附着基质影响。影响。生活方式为腐生、寄生或共生。海藻及其代谢物对
13、其分布影响显著。如含单宁生活方式为腐生、寄生或共生。海藻及其代谢物对其分布影响显著。如含单宁酸的马尾藻真菌极少；红藻上有数量较多的酵母菌而褐藻相对较少，因后者分酸的马尾藻真菌极少；红藻上有数量较多的酵母菌而褐藻相对较少，因后者分泌酚类。泌酚类。多数为腐生，能分解红树的枯枝败叶，为海洋提供有机物碎多数为腐生，能分解红树的枯枝败叶，为海洋提供有机物碎片。片。多栖于海草的叶部和根部，数量少。多栖于海草的叶部和根部，数量少。寄生于动物的外骨骼及肠道等。寄生于动物的外骨骼及肠道等。发现不同海域沉积物中都有真菌，但鉴定的很少。发现不同海域沉积物中都有真菌，但鉴定的很少。现在学习的是第14页，共46页海洋真
14、核微藻的分布海洋真核微藻的分布寒带种寒带种：最适温度小于：最适温度小于4 4。小于。小于0 0左右为寒带种；左右为寒带种；0 0-4-4来亚寒带种。来亚寒带种。温带种温带种：最适温度最适温度4 4-20-20 。4 4-12-12为冷温带种为冷温带种1212-20-20为暖温带种。为暖温带种。热带种热带种：最适温度大于最适温度大于 2020 。2020-25-25为亚热带种；大于为亚热带种；大于2525为热带种。为热带种。主要影响因子为光强。分喜光藻与适阴藻。主要影响因子为光强。分喜光藻与适阴藻。海底的分布与沉积物的组成及大小相关，含沙粒的多于泥泞。海底的分布与沉积物的组成及大小相关，含沙粒的
15、多于泥泞。双峰模式双峰模式：温带海域春、秋各有一个高峰（受光强、营养盐影响）。温带海域春、秋各有一个高峰（受光强、营养盐影响）。单峰模式单峰模式：寒带海域春季一高峰；某些温带海域（受径流影响）。：寒带海域春季一高峰；某些温带海域（受径流影响）。水平模式水平模式：多见热带海域（季节不明显）：多见热带海域（季节不明显）水水水水平平平平分分分分布布布布垂垂垂垂直直直直分分分分布布布布季季季季节节节节变变变变化化化化现在学习的是第15页，共46页海洋病毒的分布海洋病毒的分布季节、水深、光密度、温度、盐度等理化因子影响海洋浮游季节、水深、光密度、温度、盐度等理化因子影响海洋浮游病毒的分布病毒的分布。赤潮
16、发生期病毒丰度骤增赤潮发生期病毒丰度骤增。丰度随宿主变化而变化丰度随宿主变化而变化。病毒丰度与宿主丰度间的比值。病毒丰度与宿主丰度间的比值（virus-to-bacteriumratio,VBR）是研究病毒侵染对水生菌群影）是研究病毒侵染对水生菌群影响的重要参数。响的重要参数。底栖病毒丰度大于浮游病毒丰度。底栖病毒丰度大于浮游病毒丰度。VBRVBR也大于浮游病毒也大于浮游病毒沉积层深度增加病毒丰度及沉积层深度增加病毒丰度及VBRVBR都降低。都降低。浮浮浮浮游游游游病病病病毒毒毒毒底底底底栖栖栖栖病病病病毒毒毒毒现在学习的是第16页，共46页4.1微生物生态学研究中的传统方法微生物生态学研究中
17、的传统方法样品的采集样品的采集微生物菌量计数微生物菌量计数富集培养和富集培养和菌种菌种分离分离最大或然值法最大或然值法活菌计数法活菌计数法现在学习的是第17页，共46页4.2微生物生态学研究中的分子生物学方法微生物生态学研究中的分子生物学方法u核酸探针杂交技术核酸探针杂交技术uPCR特异性扩增技术特异性扩增技术urRNA基因同源性分析方法基因同源性分析方法现在学习的是第18页，共46页核酸探针杂交技术核酸探针杂交技术核酸杂交技术快速，能灵敏地探测出环境微生物中特核酸杂交技术快速，能灵敏地探测出环境微生物中特殊的核酸序列，并且用光密度测定法可直接比较核酸殊的核酸序列，并且用光密度测定法可直接比较
18、核酸杂交所得到的阳性条带或斑点就能得出定量的结果，杂交所得到的阳性条带或斑点就能得出定量的结果，从而反映出相关微生物的存在及功能。从而反映出相关微生物的存在及功能。标记核苷酸探针可直接用来探测溶液中、固定在膜上标记核苷酸探针可直接用来探测溶液中、固定在膜上或细胞或组织内的同源核酸序列。探针可以是长探针或细胞或组织内的同源核酸序列。探针可以是长探针(100-1000bp)，也可以是短的寡核苷酸，也可以是短的寡核苷酸(10-50bp)。杂。杂交方式可以是菌落杂交、狭缝杂交或原位杂交。交方式可以是菌落杂交、狭缝杂交或原位杂交。现在学习的是第19页，共46页菌落杂交菌落杂交该法可从大量细菌中筛选含特异
19、的该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。序列及基因工程重组体。杂交探针不仅可以鉴定细菌克隆也可以鉴定噬菌体形成的噬杂交探针不仅可以鉴定细菌克隆也可以鉴定噬菌体形成的噬菌斑。菌斑。首先将克隆或噬菌斑转移到纤维素膜或尼龙膜上，去掉所有首先将克隆或噬菌斑转移到纤维素膜或尼龙膜上，去掉所有的残留物，只留下的残留物，只留下DNA，这种处理同时导致了，这种处理同时导致了DNA变性，使变性，使双链的氢键断裂形成单链分子。通过双链的氢键断裂形成单链分子。通过80短时间处理，将短时间处理，将DNA分子固定在膜上（纤维素膜）；对于尼龙膜需要进行紫外分子固定在膜上（纤维素膜）；对于尼龙膜需要进行
20、紫外交联，通过糖交联，通过糖-磷酸中枢将分子连接到膜上。磷酸中枢将分子连接到膜上。标记探针，加热变性，加入到杂交膜上进行杂交，然后洗标记探针，加热变性，加入到杂交膜上进行杂交，然后洗去未结合的探针，干燥，接合探针的位置就可以检测出来。去未结合的探针，干燥，接合探针的位置就可以检测出来。现在学习的是第20页，共46页斑点杂交或狭缝杂交法斑点杂交或狭缝杂交法 基本过程：基本过程：将变性的将变性的DNADNA或或RNARNA直接点到固相支持滤膜上直接点到固相支持滤膜上用标记探针与之杂用标记探针与之杂交交自显影或显色反应自显影或显色反应检测杂交信号检测杂交信号分析结果。分析结果。优点：优点：简便、快速
21、、灵敏、样本用量少；简便、快速、灵敏、样本用量少；缺点：缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性。特异性不高，有一定比例的假阳性。用途：用途：检测样本中存在的微量检测样本中存在的微量DNADNA或或RNA RNA 现在学习的是第21页，共46页原位杂交原位杂交 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而 检测特异的检测特异的DNADNA或或RNARNA序列。序列。细胞原位杂交细胞原位杂交 组织切片原位杂交组织切片原位杂交 DNA-DNADNA-DNA RNA-DNA RNA-DNA 三类杂交三类杂交 RNA-RNARNA-RNA 该法优点：该法
22、优点：不需提取核酸，不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。准确地反映组织细胞的功能状态。有有现在学习的是第22页，共46页PCR特异性扩增技术特异性扩增技术在环境检测中，靶核酸序列往往存在于一个复杂的混合在环境检测中，靶核酸序列往往存在于一个复杂的混合物中，且含量极低，若探测这种复杂群体中特异微生物物中，且含量极低，若探测这种复杂群体中特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。或某个基因，杂交就显得不敏感。PCR技术使靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探技术使靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性
23、或定量研究分析微生物群体结构。测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR常与其他技术结合起来使用，常与其他技术结合起来使用，如如RT-PCR，competitivePCR、nestedPCR、RAPD、ARDRA等。等。现在学习的是第23页，共46页第一步：第一对引物结合。第一步：第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。上并扩增多种产物。第二步：第二套引物对第二步：第二套引物对第一轮第一轮PCR扩增的产物进扩增的产物进行第二轮行第二轮PCR扩增。扩增。由于第二套引物位于第由于第二套引物位于第
24、一轮一轮PCR产物内部，而非产物内部，而非目的片断包含两套引物结目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增此第二套引物不可能扩增非目的片断。非目的片断。Nested PCRNested PCR现在学习的是第24页，共46页competitivePCR是一种定量是一种定量PCR（quantitativePCR），通），通过向过向PCR体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究。争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究。靶基因与参考标准
25、在同一反应管中共同扩增，但参照标准通靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参照标准通常是一段人工合成的模板而不是内源性基因。竞争常是一段人工合成的模板而不是内源性基因。竞争PCR必须构必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分子，具有相同的引物结合位点，其扩增产物能通过电泳或高效液相子，具有相同的引物结合位点，其扩增产物能通过电泳或高效液相色谱色谱(HPLC)等方法区分开来。对竞争性模板作系列稀释后加入到恒等方法区分开来。对竞争性模板作系列稀释后加入到恒量的样品量的样品DNA中进行中进行PCR，靶基因的量取决于
26、所添加的竞争性，靶基因的量取决于所添加的竞争性DNA片段的量，使两者的片段的量，使两者的PCR终产物有相等摩尔数。终产物有相等摩尔数。competitive PCRcompetitive PCR现在学习的是第25页，共46页u用那些对某一特定基因的非特异性的引物来扩用那些对某一特定基因的非特异性的引物来扩增某些片段。增某些片段。uRAPD分析用于探测含有混合微生物种群的各种分析用于探测含有混合微生物种群的各种生物反应器中的微生物多样性。其分析得到的基因生物反应器中的微生物多样性。其分析得到的基因组指纹图谱在比较一段时间内微生物种群的变化以组指纹图谱在比较一段时间内微生物种群的变化以及比较小试规
27、模和中试规模的反应器方面是有用的。及比较小试规模和中试规模的反应器方面是有用的。但不足以用来估测群落的微生物多样性。但不足以用来估测群落的微生物多样性。RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)现在学习的是第26页，共46页rRNA基因分析方法基因分析方法rRNAapproach是综合应用多项分子生物技术对细胞是综合应用多项分子生物技术对细胞中中rRNA基因进行分析，从而揭示微生物多样性。基因进行分析，从而揭示微生物多样性。所使用的技术主要包括环境样品中所使用的技术主要包括环境
28、样品中DNA的提取、引的提取、引物及探针的设计、物及探针的设计、PCR扩增、梯度胶电泳（主要是扩增、梯度胶电泳（主要是DGGE和和TGGE）、限制性内切酶长度多态型）、限制性内切酶长度多态型（RFLP）、基因文库的筛选、序列测定、序列分析及系）、基因文库的筛选、序列测定、序列分析及系统进化树构建、斑点杂交和全细胞原位杂交及巢式杂交等。统进化树构建、斑点杂交和全细胞原位杂交及巢式杂交等。现在学习的是第27页，共46页微生物样品基因组微生物样品基因组DNA的提取的提取16srRNA基因片段的获得（基因片段的获得（pcr）16srRNA基因片段的分析基因片段的分析16srRNA基因分析步骤基因分析步
29、骤现在学习的是第28页，共46页肠道微生物样品基因组肠道微生物样品基因组DNA的提取的提取rRNA的含量很高，易于获得较多的模板，但是的含量很高，易于获得较多的模板，但是RNA易降解，因此一般研究易降解，因此一般研究多采用提取细胞总多采用提取细胞总DNA。肠道环境中存在的细菌种类繁多，形态及性质各异，必须尽可能无选择性地裂肠道环境中存在的细菌种类繁多，形态及性质各异，必须尽可能无选择性地裂解肠道细菌细胞以得到代表性的核酸分子。解肠道细菌细胞以得到代表性的核酸分子。l菌体菌体细胞裂解常用方法胞裂解常用方法酶法酶法化学法化学法机械法机械法u目前认为最可靠的方法是：目前认为最可靠的方法是：溶菌酶配合
30、微珠振荡裂解，溶菌酶配合微珠振荡裂解，使肠道混合微生物的使肠道混合微生物的DNA充分释放，充分释放，再用酚再用酚-氯仿抽提总氯仿抽提总DNA。现在学习的是第29页，共46页16srRNA基因片段的获得基因片段的获得u16SrRNA通用引物进行通用引物进行PCR扩增的一般程序扩增的一般程序9496预变性预变性25min9495变性变性3060s4555退火退火60s6872延伸延伸24min 最后最后6872延伸延伸610min 缺点：缺点：可能出现嵌合产物和扩增偏嗜性现象。可能出现嵌合产物和扩增偏嗜性现象。现在学习的是第30页，共46页16srRNA基因片段的分析基因片段的分析1）将）将PCR
31、产物克隆到质粒载体上进行测序，与产物克隆到质粒载体上进行测序，与16SrRNA数据库中数据库中序列比较，确定其进化树中位置，从而鉴定样品中可能存在的微序列比较，确定其进化树中位置，从而鉴定样品中可能存在的微生物种类。生物种类。u16SrRNA16SrRNA基因片段的分析方法基因片段的分析方法特点：特点：该方法获得信息最全面，但在样品复杂情况下测序工作繁重。该方法获得信息最全面，但在样品复杂情况下测序工作繁重。主要应用：主要应用：单株菌的鉴定；两种菌的同源性比较，确定其归属。单株菌的鉴定；两种菌的同源性比较，确定其归属。2）16SrRNA基因片段的多态性分析（又叫基因片段的多态性分析（又叫DNA
32、遗传指纹图谱技术）。遗传指纹图谱技术）。经经PCR后其产物为序列等长但不同源的后其产物为序列等长但不同源的DNA混合物，常用混合物，常用DGGE、TGGE等手段分离。混合物中序列的多样性和不同序列的丰度在一等手段分离。混合物中序列的多样性和不同序列的丰度在一定程度上反映原始样品中微生物种群的多样性和不同物种的丰度。定程度上反映原始样品中微生物种群的多样性和不同物种的丰度。特点：特点：PCR过程中的碱基插入等造成错误过程中的碱基插入等造成错误主要应用：主要应用：微生物群体多样性；微生物种群动态分析等。微生物群体多样性；微生物种群动态分析等。现在学习的是第31页，共46页3）通过）通过16SrRN
33、A种属特异性的探针与种属特异性的探针与PCR产物杂交以获得微生物组产物杂交以获得微生物组成信息。此外，探针也可以直接与样品进行原位杂交，通过原位杂交不仅成信息。此外，探针也可以直接与样品进行原位杂交，通过原位杂交不仅可以测定微生物丰度，且能分析它们的空间分布可以测定微生物丰度，且能分析它们的空间分布u16SrRNA16SrRNA基因片段的分析方法基因片段的分析方法特点：特点：简单快速。简单快速。主要应用：主要应用：快速验证其它方法可能出现的假阴阳性；混合物中钓取已知特定快速验证其它方法可能出现的假阴阳性；混合物中钓取已知特定种类。种类。4）对）对PCR产物进行产物进行RFLP或或T-RFLP。
34、将。将PCR产物酶切，通过观察酶切电产物酶切，通过观察酶切电泳图谱、数值分析，确定微生物基因的核糖体型，再同核糖体数据库中的已泳图谱、数值分析，确定微生物基因的核糖体型，再同核糖体数据库中的已有数据进行比较分析。有数据进行比较分析。主要应用：主要应用：微生物组成和不同微生物的种属关系分析。微生物组成和不同微生物的种属关系分析。现在学习的是第32页，共46页样品的采集样品的采集土壤和污泥样品的采集一般不要求无菌操作。土壤和污泥样品的采集一般不要求无菌操作。而应当注意样品的深度。而应当注意样品的深度。水体样品的采集，应视水体清洁程度而定，或直接水体样品的采集，应视水体清洁程度而定，或直接采集或用滤
35、纸过滤浓缩（要求容器和过滤器无菌及无采集或用滤纸过滤浓缩（要求容器和过滤器无菌及无菌操作）菌操作）空气样品的采集：要求在无菌操作下进行滤纸过空气样品的采集：要求在无菌操作下进行滤纸过滤滤生物体上的样品采集，要求取下一定量的组织，生物体上的样品采集，要求取下一定量的组织，用无菌溶液把其中的微生物洗涤下来。用无菌溶液把其中的微生物洗涤下来。现在学习的是第33页，共46页富集培养和菌种分离富集培养和菌种分离用一定的选择性培养基进行培养，把样品中用一定的选择性培养基进行培养，把样品中所含的特殊微生物数量得到提高。所含的特殊微生物数量得到提高。一般进行一般进行23次富集培养次富集培养分离通常还是采用与富
36、集相同的培养基进行划线分分离通常还是采用与富集相同的培养基进行划线分离离挑取单菌落再进行挑取单菌落再进行23次的纯化。次的纯化。现在学习的是第34页，共46页最大或然值法（最大或然值法（MPN）适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群生理功能的类群。菌液经多次菌液经多次10倍稀释后，然后每个稀释度取倍稀释后，然后每个稀释度取35次重复接种次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为（即临界
37、级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标数量指标，由最大或然数，由最大或然数表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。中的含菌数。应注意两点：应注意两点：N菌液稀释度选择要合适，原则是最低稀释度的菌液稀释度选择要合适，原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无菌生长。复无菌生长。N每个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要每个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要和条件而定，一般和条件而定，一般35个重复。个重复。现在学习的是第35页，共4
38、6页例例1：如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；稀释度稀释度10-310-410-5l0-610-710-8重复数重复数555555出现生长的管数出现生长的管数555410其数量指标为其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀，然后乘以第一位数的稀释倍数释倍数即每毫升原菌液含活菌数为即每毫升原菌液含活菌数为l700000个。个。确定数量指标确定数量指标：不管重复次数如何，都是：不管重复次数如何，都是3位数字，第一位数字必位数字，第一位数字必须是所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管，后两位数须是所有试
39、管都生长微生物的某一稀释度的培养试管，后两位数字依次为以下两个稀释度的生长管数，如果再往下的稀释仍有生字依次为以下两个稀释度的生长管数，如果再往下的稀释仍有生长管数，则可此数加到前面相邻的第三位数上即可长管数，则可此数加到前面相邻的第三位数上即可。例例2：如某一微生物生理群稀释培养记录为：如某一微生物生理群稀释培养记录为：稀释度稀释度l0-110-210-3l0-410-510-6重复数重复数444444出现生长的管数出现生长的管数443210数量指标为数量指标为“433”，查表得近似值为，查表得近似值为30，则每毫升，则每毫升原菌液中含活菌原菌液中含活菌30102个。个。现在学习的是第36页
40、，共46页附表附表23-1几种主要微生物生理群几种主要微生物生理群MPN计数法一览表计数法一览表微生物生微生物生理群理群培养基培养基常用稀释度常用稀释度常用重复常用重复次数次数培养时培养时间间(天天)主主要要检检查查方方法法氨化细菌氨化细菌蛋白胨氨蛋白胨氨化培养基化培养基0-610-947根据培养液加奈氏试剂后是否出现棕色或褐色，确定是否产生氨。根据培养液加奈氏试剂后是否出现棕色或褐色，确定是否产生氨。亚硝酸细亚硝酸细菌菌铵盐培养铵盐培养基基0-210-7314根据培养液加格利斯试剂根据培养液加格利斯试剂及及的反应，出现绛红色证明有的反应，出现绛红色证明有NO-2生成；或在生成；或在培养中加锌
41、碘淀粉试剂及体积比值为培养中加锌碘淀粉试剂及体积比值为20%的的H2SO4，若出现蓝色，证明有，若出现蓝色，证明有NO-3生成。生成。硝酸细菌硝酸细菌亚硝酸盐亚硝酸盐培养基培养基0-210-6314根据培养液加入浓硫酸及二苯胺试剂后，是否出现蓝色，确定是否有根据培养液加入浓硫酸及二苯胺试剂后，是否出现蓝色，确定是否有NO-3生生成。成。反硝化细反硝化细菌菌反硝化细反硝化细菌培养基菌培养基0-410-8314根据杜氏小管有无气体，确定有无根据杜氏小管有无气体，确定有无N2生成；利用格利斯试剂生成；利用格利斯试剂及及和二苯胺和二苯胺试剂、浓硫酸检测有无试剂、浓硫酸检测有无NO-2生成及有无生成及有
42、无NH3存在，判断反硝化作用进行情况。存在，判断反硝化作用进行情况。好气性自好气性自生固氮菌生固氮菌阿须贝无阿须贝无氮培养基氮培养基0-210-637-14根据培养液表面与滤纸接触处有无褐色或粘液状菌膜生成，判断有无好气性根据培养液表面与滤纸接触处有无褐色或粘液状菌膜生成，判断有无好气性自生固氮菌生长。自生固氮菌生长。好气性好气性纤维素分纤维素分解菌解菌赫奇逊噬赫奇逊噬纤维培养纤维培养基基0-110-5314根据各试管中滤纸条上有无黄色或桔黄色菌斑出现及滤纸断裂状况，确定有根据各试管中滤纸条上有无黄色或桔黄色菌斑出现及滤纸断裂状况，确定有无好气性纤维素分解细菌的生长。无好气性纤维素分解细菌的生
43、长。厌气性纤厌气性纤维素分解维素分解菌菌嫌气性纤嫌气性纤维素分解维素分解细菌培养细菌培养基基0-110-5314-21根据各试管中滤纸条上有无穿洞、破裂、完全分解情况，确定有无嫌气性纤根据各试管中滤纸条上有无穿洞、破裂、完全分解情况，确定有无嫌气性纤维素分解细菌的生长。维素分解细菌的生长。硫化细菌硫化细菌硫化细菌硫化细菌培养基培养基0-210-8321-23在每管培养液中加入在每管培养液中加入10g/L的的BaCL2溶液溶液2滴，如有白色沉淀出现，则证明有滴，如有白色沉淀出现，则证明有硫化菌活动。硫化菌活动。反硫化细反硫化细菌菌斯塔克反斯塔克反硫化细菌硫化细菌培养基培养基0-210-7321-
44、30根据培养液试管底部、管壁有无黑色沉淀出现，判断有无反硫化细菌活动。根据培养液试管底部、管壁有无黑色沉淀出现，判断有无反硫化细菌活动。现在学习的是第37页，共46页白色农业白色农业l白色农业是指微生物资源产业化的工业型新白色农业是指微生物资源产业化的工业型新农业，包括高科技生物工程的发酵工程和酶工农业，包括高科技生物工程的发酵工程和酶工程。白色农业生产环境高度洁净，生产过程不程。白色农业生产环境高度洁净，生产过程不存在污染，其产品安全、无毒副作用存在污染，其产品安全、无毒副作用 。l目前白色农业的研究应用领域包括：微生物食目前白色农业的研究应用领域包括：微生物食品；微生物饲料；微生物肥料；微
45、生物农药、兽品；微生物饲料；微生物肥料；微生物农药、兽药；微生物能源；微生物生态环境保护剂等。药；微生物能源；微生物生态环境保护剂等。现在学习的是第38页，共46页自然界中微生物酶活性测定自然界中微生物酶活性测定u水解酶类活性测定水解酶类活性测定蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、u脱氢酶活性的测定脱氢酶活性的测定u微生物呼吸率测定微生物呼吸率测定现在学习的是第39页，共46页现在学习的是第40页，共46页Synechococcus colonies are found only in salt water,and contribute about 25%of
46、primary production in pelagic waters.现在学习的是第41页，共46页Prochlorococcus marinusProchlorococcus marinus,atinyglobularcyanobacterium.This,atinyglobularcyanobacterium.Thistypeoforganismisextremelyabundantinthetropicalandwarmtypeoforganismisextremelyabundantinthetropicalandwarmtemperateregionsoftheopenocean
47、s,andsomescientistsclaimittemperateregionsoftheopenoceans,andsomescientistsclaimitisthemostabundantorganismonearth.Itisresponsibleforasisthemostabundantorganismonearth.Itisresponsibleforasmuchas50%ofcarbonfixationintheoceans.muchas50%ofcarbonfixationintheoceans.现在学习的是第42页，共46页Five methods are used t
48、o estimate the abundance of viruses in aquatic samples:plaque assays(PAs);most-probablenumber assays(MPNs);transmission electron microscopy(TEM);epifluorescence microscopy(EfM);and flow cytometry(FC).Which procedure is used depends on the question being addressed and the accuracy and sensitivity tha
49、t is required.现在学习的是第43页，共46页Prokaryotesandviruses.ProkaryotesProkaryotesandviruses.Prokaryotes(largeintensedots)andviruses(largeintensedots)andviruses(small,lessintensedots)stainedby(small,lessintensedots)stainedbySYBRGreenIandviewedbySYBRGreenIandviewedbyepifluorescencemicroscopy.Noteepifluorescen
50、cemicroscopy.Notethatvirusesaremorenumerousthanthatvirusesaremorenumerousthanprokaryotesprokaryotes InfectedCell.TransmissionInfectedCell.Transmissionelectronmicroscopyelectronmicroscopymicrographofamicrographofaprokaryoticcellfromaprokaryoticcellfromanaturalmarinecommunitynaturalmarinecommunitywith