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1、分子生物学与临床天津市第三中心医院刘树业1.随着分子生物学技随着分子生物学技术的的发展，聚合展，聚合酶链反反应（PCR）技）技术已逐已逐渐应用于用于遗传性疾病、性疾病、肿瘤及感染性瘤及感染性疾病等方面的疾病等方面的诊断。断。1.检测临床床标本中病原体核酸序列。本中病原体核酸序列。2.肿瘤基因突瘤基因突变情况。情况。3.遗传性疾病的基因序列。性疾病的基因序列。4.人人类白白细胞表面抗原（胞表面抗原（HLA）配型。）配型。5.法医学方面的法医学方面的鉴定工作。定工作。PCR技技术在在临床床实验室室应用的价用的价值2.优点：点：1.灵敏度高，理灵敏度高，理论上，只要上，只要标本中含有一个分子的本中含
2、有一个分子的DNA或或RNA就可以作出就可以作出诊断。断。2.特异性特异性强，对于一个于一个19核苷酸的引物来核苷酸的引物来说，非特异性配，非特异性配对的概的概率率为419=2.75*1011这表示要与表示要与这19个碱基的排列个碱基的排列顺序完全相序完全相同同时需要的基因需要的基因组DNA片段的最小片段的最小长度，而人的基因度，而人的基因组长度度为3*109碱基碱基对，以克服血清学，以克服血清学诊断有交叉反断有交叉反应的缺陷。的缺陷。3.可以早期可以早期诊断，如在断，如在HCV的感染中，第一周内就可以的感染中，第一周内就可以检测出出HCVRNA，而抗体的，而抗体的产生一般在第二周以后生一般在
3、第二周以后。PCR在在诊断病原体感染断病原体感染时的的优缺点缺点3.4.对于体液免疫力低下或使用免疫抑制于体液免疫力低下或使用免疫抑制剂而无而无抗体抗体产生者，生者，PCR却可以作出明确却可以作出明确诊断。断。5.可以可以对病原体作定量分析，反映病原体在机病原体作定量分析，反映病原体在机体的复制及体的复制及动力学力学变化情况。化情况。6.可可对病原体病原体进行基因分型。指行基因分型。指导临床治床治疗。4.不足之不足之处:1.操作复操作复杂，技，技术不易被熟不易被熟练掌握。掌握。2.价格昂价格昂贵。3.出于敏感性太高，操作步出于敏感性太高，操作步骤多而复多而复杂，即使有极少，即使有极少量的量的污
4、染也会造成假阳性。染也会造成假阳性。4.由于操作复由于操作复杂，对试剂及及实验条件要求条件要求严格，稍有格，稍有差差错就会出就会出现假阴性。假阴性。5.几点几点认识一一.今后今后仪器和器和试剂的的发展方向：封管、定量及自展方向：封管、定量及自动化；化；二二.样品采集方式品采集方式对PCR很重要，比操作更重要。很重要，比操作更重要。三三.内内标作用：操作作用：操作过程的程的监控、控制假阴性。控、控制假阴性。四四.从核酸提取、从核酸提取、扩增到增到检测，对照与待照与待测标本本同步同步进行；行；6.五五.禁用禁用产物的物的电泳分析技泳分析技术。六六.探探针杂交技交技术和防和防污染技染技术的采用是一大
5、的采用是一大进步。步。7.一.标本的采集常用于基因常用于基因扩增增检测的的临床床标本包括本包括EDTA或枸或枸橼酸酸钠抗凝全血抗凝全血或骨髓、血清或血或骨髓、血清或血浆、痰、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等脊液、尿及分泌物等。采血液等样本本时，应使用一次性密使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用非密容器，如真空采血管。当使用非密闭采采样系系统时，如尿、分泌物和骨髓的采，如尿、分泌物和骨髓的采样，必，必须注意防止来自采注意防止来自采样者皮屑或分泌物的者皮屑或分泌物的污染。采染。采样时必必须戴一次性手套。戴一次性手套。玻璃器皿在使用前玻璃器皿在使用前应高高压处理，因理，因为玻璃器皿常含有不易失
6、活的玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是。最好是热灭菌，菌，250烘烤烘烤4小小时以上可使以上可使RNA酶永久永久性失活。性失活。全血和骨髓全血和骨髓标本必本必须进行抗凝行抗凝处理。理。EDTA和枸和枸橼酸酸盐是首是首选的的抗凝抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因。不能使用肝素抗凝，因为肝素是肝素是Taq酶的的强抑制抑制剂，而，而且在其后的核酸提取步且在其后的核酸提取步骤中很中很难去除。去除。临床用于床用于RNA（如（如HCVRNA）扩增增检测的血的血标本建本建议进行抗凝行抗凝处理，并尽快（理，并尽快（3小小时以内）分离血以内）分离血浆，以避免，以避免RNA的降解。如的降解。如未作抗凝未作抗凝处理
7、，理，则抽血后，必抽血后，必须在在1小小时内分离血清。内分离血清。8.二.标本的稳定化处理用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐（Guanidinethiocyanate,GITC）可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按14的比例加至含有5mol/LGITC的试管内中，从而使血清（浆）中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目，上述稳定化处理方法的效果
8、究竟如何，要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。9.三.标本的运送标本采集后必须尽快送至实验室。经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本，通常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。10.四.标本的贮存临床体液标本如血清/血浆等可于-70下长时间贮存。用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/LTris-1mmol/LEDTA缓冲液（pH7.5-8.0）中4保存，用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80或液氮中
9、贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20即可。用GITC处理的RNA标本在室温可保存7天。11.五.标本的处理（核酸提取）标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体或降解产物）或核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等），这些物质对其后的Taq酶扩增反应步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。当标本为痰时，则必须先进行液化处理，再提取核酸。需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。此外，当
10、靶核酸为RNA时，逆转录PCR测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理(血清或血浆按14的比例加至含有5mol/LGITC的试管内中，从而使血清（浆）中的RNA酶不可逆失活)及核酸提取试剂的RNA酶的污染。对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果发现有RNA降解的证据，实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。对于后者，建议使用高质量的商品核酸提取试剂。12.一一.内源性物内源性物质(影响因子）影响因子）1.类风湿因子2.补体3.嗜异性抗体4.嗜靶抗原的自身抗体5.医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体6.交叉反应物质7.标本中其它成分的影响13.二二.外源性物外源
11、性物质1.标本溶血2.标本受细菌污染3.标本保存不当4.标本凝集不全5.标本管中添加物质的影响14.PCR测定的定的临床床应用及用及测定定结果的果的临床意床意义结核分支杆菌核分支杆菌病原学：病原学：结核分支杆菌复合群（核分支杆菌复合群（MTBC）：人型）：人型结核分支杆菌、牛型核分支杆菌、牛型结核分支杆菌、非洲型核分支杆菌、非洲型结核核分支杆菌和田鼠型分支杆菌和田鼠型结核分支杆菌，后者无致病性。核分支杆菌，后者无致病性。对人有致病性的主要是人型人有致病性的主要是人型结核分支杆菌，牛型核分支杆菌，牛型引起人引起人类发病已很少病已很少见。此外分支杆菌。此外分支杆菌报道有道有100余种，余种，199
12、4年国年国际公公认有有56种，常用非种，常用非结核核分支杆菌（分支杆菌（NTM）或其他分支杆菌（）或其他分支杆菌（MOTT）的）的名称。名称。培养培养：15-20小小时一代，一代，2-4周周看到看到培养基上的培养基上的菌落。抗菌治菌落。抗菌治疗后需后需4-8周或周或20周才出周才出现菌落。菌落。15.引物引物设计：结核分支杆菌共有的靶序列：核分支杆菌共有的靶序列：65KD人型人型结核分支杆菌特异的靶序列核分支杆菌特异的靶序列mpt40MTBC特有的靶序列，如特有的靶序列，如IS6110插入序列插入序列rRNA序列，以序列，以16S-rRNA为模板模板cDNA扩增，高增，高度保守，度保守，TB有
13、高达有高达1000-10000拷拷贝数，具很高的灵数，具很高的灵敏度和特异性。敏度和特异性。注意注意问题：标本本处理理痰、胸腹水：液化痰、胸腹水：液化剂，红细胞裂解液胞裂解液16.临床床应用用评价价：1.Tb与其他分支杆菌区与其他分支杆菌区别：AIDS鸟分支杆菌，分支杆菌，龟分支分支杆菌杆菌2.TB耐耐药基因基因3.含菌量含菌量较低低标本分离本分离TB敏感性：敏感性：远高于直接涂片和培养高于直接涂片和培养涂片涂片镜检：10000-100000菌菌/ml，培养：培养：10-100个活菌个活菌PCR：1-20个个结核杆菌，但不能核杆菌，但不能鉴别死菌和活菌，不死菌和活菌，不能反映抗能反映抗结核治核
14、治疗的效果；的效果；还可可见临床无床无结核病核病证据涂据涂片和培养均阴性而片和培养均阴性而PCR阳性的情况，阳性的情况，这在理在理论上可上可诊断断结核，但核，但临床上很床上很难被医被医师认同，同，这涉及所涉及所谓金金标准的准的问题，目前，目前还远不能就此情况下不能就此情况下PCR阳性的生物学意阳性的生物学意义和价和价值作出作出评价。价。17.沙眼衣原体ChlamydeatrachomatisCt病原学：三个生物变种：沙眼生物变种A-K12个血清型性病淋巴肉牙肿变种LGV3个血清型，人是天然宿主鼠生物变种鼠是天然宿主，不侵犯人，与鼠肺炎有关病原学检验：涂片、抗原抗体检测、核酸检测18.四种衣原体
15、的性状比四种衣原体的性状比较19.PCR：16SrRNA基因高度保守基因高度保守衣原体属特异引物衣原体属特异引物7.5kD质粒及粒及MOMP(主要外膜蛋白主要外膜蛋白)基因适于构建种或基因适于构建种或型特异性引物型特异性引物根据沙眼衣原体内源性根据沙眼衣原体内源性质粒序列粒序列设计合成的一合成的一对引物引物:1:GGACAAATCGTATCTCGG;2:GAAACCAACTCTACGCTG.扩增片段增片段517,可可扩增增15个已知血清型的沙眼衣原体个已知血清型的沙眼衣原体.实验证明明,此引物不此引物不扩增其他眼部常增其他眼部常见微生物和正常人核酸微生物和正常人核酸,而而对临床床49例例诊断断
16、为沙眼的沙眼的标本阳性率本阳性率为63%,敏感性和特敏感性和特异性均超异性均超过细胞培养法和免疫胞培养法和免疫荧光法与光法与酶免疫法等常免疫法等常规方法方法,灵敏度达到能灵敏度达到能检出出1个衣原体个衣原体DNA分子分子.20.特别要注意的问题:取材:一定要取到细胞临床评价：金标准培养免疫学：荧光主观判定EIA金葡、链球菌、淋球菌-交叉反应PCR：假阴阳性21.人类组织相容性抗原(HLA)组织相容性相容性（主要（主要组织相容性复合体相容性复合体MHC）系系统的概念的概念：有有I、II、III类I类：HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-E，HLA-F，HLA-G，HLA-HL等等II类:
17、HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP，HLA-DO，HLA-DN，HLA-M,等位点等位点III类:为补体系体系统C2，C4，Bf等。等。HLA抗原的分抗原的分类:I类和和II类抗原抗原多多态性、共性、共显性性遗传：已：已发现的的HLA基因位基因位点点(等位基因数等位基因数)约400左右左右22.HLA分型的基本方法血清学方法:基本原理活的淋巴细胞表面有大量的HLA-A,HLA-B,HLA-CHLA-DR抗原,在与特异性的同型抗体结合后,有补体存在时会被杀死,经过染色，根据淋巴细胞被杀死的百分率,可以决定待测淋巴细胞是否具有某一特异性的抗原.细胞学方法:基本原理检测的抗原属于HLA-DP，
18、HLA-DQ两个位点，如果两种淋巴细胞表面抗原不同,在一起培养，不同抗原互相刺激，淋巴细胞增殖并向母细胞转化；否则，这两种细胞会保持不变。23.HLA分型的基本方法常用X射线处理已知HLA-DP，HLA-DQ特异淋巴细胞，失去增殖能力保持刺激能力，与待测淋巴细胞混合培养，若不发生增殖和母细胞化即认为与已知特异性细胞同型，否则为不同型别淋巴细胞.HLA-DR基因分型:(例)序列特异性引物PCR法合成19对引物,21管加公共引物DR型别.24.HLA抗原：抗原：一.HLAABC抗原:与疾病相关HLAA,B与器官移植的关与器官移植的关联没有没有D的配型意的配型意义显著著,C无意无意义.二.HLAD抗
19、原:与器官移植配型相关DR座位上的等位基因数比座位上的等位基因数比AB座位上的少座位上的少,在随在随机人群中挑机人群中挑选到到DR抗原配合的供体要比抗原配合的供体要比选择AB抗原配合的供体容易抗原配合的供体容易,所以目前器官移植主所以目前器官移植主要做要做DR配型配型.25.遗传病检测遗传病是由基因在性病是由基因在性细胞的突胞的突变引起的引起的一。一。PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探合等位基因特异性寡核苷酸探针法法对已知突已知突变热点基因点基因检测：PCR-目的基因目的基因-膜膜杂交交发现突突变位点位点合成正常及突合成正常及突变寡核苷酸探寡核苷酸探针一个等位基因有一种一个等位基因有一种ASO
20、探探针,要要证明待明待测标本是否属于本是否属于这一等位基因一等位基因,要要进行一次行一次杂交交显示信号的操作示信号的操作,这对于致病基于致病基因有多个突因有多个突变可能性的可能性的诊断断(地中海地中海贫血在中国有血在中国有18种突种突变类型型,全球有全球有100多种多种),操作繁操作繁杂甚至不可能甚至不可能.二。二。PCR扩增特异等位基因增特异等位基因在在3末端末端设计突突变位点位点,根据特异性根据特异性PCR产物出物出现与否判断与否判断突突变的存在的存在.26.三.限制性片段长度多态性分析突突变位点与位点与酶切位点相关切位点相关出出现新的新的电泳泳图谱四.单链构象多态性分析(SSCP)PCR
21、扩增靶增靶DNA;将特异的将特异的PCR扩增增产物物变性，性，而后快速复性，使之成而后快速复性，使之成为具有一定空具有一定空间结构的构的单链DNA分子分子;将适量的将适量的单链DNA进行非行非变性聚丙性聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳;最后通最后通过放射性自放射性自显影、影、银染或溴化乙染或溴化乙锭显色分析色分析结果果.若若发现单链DNA带迁移率与正常迁移率与正常对照照的相比的相比发生改生改变，就可以判定，就可以判定该链构象构象发生改生改变，进而推断而推断该DNA片段中有碱基突片段中有碱基突变.该方法方法简便、快速、便、快速、灵敏，不需要特殊的灵敏，不需要特殊的仪器，适合器，适合临床床实验的需要的需
22、要.27.不不足足之之处.例例如如，只只能能作作为一一种种突突变检测方方法法，要要最最后后确确定定突突变的的位位置置和和类型型，还需需进一一步步测序序;电泳泳条条件件要要求求较严格格;另另外外，由由于于SSCP是是依依据据点点突突变引引起起单链DNA分分子子立立体体构构象象的的改改变来来实现电泳泳分分离离的的，这样就就可可能能会会出出现当当某某些些位位置置的的点点突突变对单链DNA分分子子立立体体构构象象的的改改变不不起起作作用用或或作作用用很很小小时，再再加加上上其其他他条条件件的的影影响响，使使聚聚丙丙烯酰胺胺凝凝胶胶电泳泳无无法法分分辨辨造造成成漏漏检.尽尽管管如如此此该方方法法和和其其
23、他他方方法法相相比比仍仍有有较高高的的检测率率.首首先先，它它可可以以发现靶靶DNA片片段段中中未未知知位位置置的的碱碱基基突突变.Takao，经实验证明明小小于于300bp的的DNA片片段段中中的的单碱碱基基突突变，90%可可被被SSCP发现，他他认为现在在知知道道的的所所有有单碱碱基基改改变绝大大多多数数可可用用该方方法法检测出出来来.另另外外，SSCP方方法法可可通通过聚聚丙丙烯酰胺胺凝凝胶胶电泳泳将将不不同同迁迁移移率率的的突突变单链DNA分分离离，并并且且还可可以以进一一步步提提纯.用用这种种方方法法可可以以最最终从从DNA序列水平上序列水平上鉴别突突变DNA片段片段.28.UNG酶
24、/dUTP防防污染系染系统本本试剂盒中加入了盒中加入了dUTP以保以保证PCR只只选择性地性地扩增增临床中的靶床中的靶DNA。UNG酶（尿（尿嘧啶糖基化糖基化酶）能）能识别并并催化催化酶解含有解含有dUTP的的DNA结构，但不会构，但不会对含有含有dTTP的的DNA的的结构构识别并催化并催化酶解。解。dUTP不存在不存在于自然的于自然的DNA中，只有运用中，只有运用dUTP替代替代dTTP的的PCR反反应之中之中产生的生的扩增子中存在。增子中存在。这种种dU化的化的PCR产物物与与UNG酶一起孵育后使其失去再被一起孵育后使其失去再被扩增的能力，因增的能力，因UNG可裂解可裂解尿尿嘧啶碱基和糖磷
25、酸骨架碱基和糖磷酸骨架间的的N-糖苷糖苷键，可去除可去除dU，使无，使无dU的位点阻止的位点阻止TaqDNA聚合聚合酶的延的延伸。伸。UNG酶可从可从单链或双或双链DNA中消除中消除尿尿嘧啶，而，而对RNA中的尿中的尿嘧啶和和单一尿一尿嘧啶分子分子则无作用。无作用。UNG酶在正常在正常PCR循循环变性一步就可被性一步就可被灭活，所以活，所以对含含dU的新的的新的PCR产物没有影响。物没有影响。29.肿瘤研究中的分子生物学肿瘤分为:癌,肉瘤,白血病/淋巴瘤癌:90%的人类肿瘤,起源内胚层及外胚层上皮细胞肉瘤,白血病/淋巴瘤起源中胚层细胞,包括肌肉,骨骼,血管,成纤维细胞以及血液和淋巴系统中的循环
26、细胞肿瘤发展的多步性.病毒癌基因:肿瘤病毒:30.有致癌能力的有致癌能力的DNA病毒病毒:(6个病毒家族个病毒家族)乙肝病毒乙肝病毒,猴病毒猴病毒40,多瘤病毒多瘤病毒,乳乳头瘤病毒瘤病毒,疱疹病毒疱疹病毒,痘病毒痘病毒只有一只有一类RNA病毒致癌病毒致癌反反转录病毒病毒肿瘤抑癌基因的发现:Hanis1960年年,正常正常细胞与胞与肿瘤瘤细胞融合胞融合杂合体合体细胞不致瘤胞不致瘤正常正常细胞中具有胞中具有肿瘤抑制基因瘤抑制基因产生生肿瘤表型的瘤表型的负调节物物当当杂合体合体细胞某段染胞某段染色体色体丢失后失后细胞胞变为肿瘤表型瘤表型-这段染色段染色体上有重要的体上有重要的肿瘤抑制基因瘤抑制基因
27、31.抑癌基因:P53多种肿瘤.早期早期发现肿瘤中瘤中P53表达增表达增加加,认为是癌基因是癌基因.正常正常P53基因抑制基因抑制肿瘤形成瘤形成,肿瘤中瘤中过量表达的是量表达的是P53基因突基因突变体体作作为显性抑制物影响性抑制物影响P53功能功能致癌致癌P16,PTP多种抑癌基因多种抑癌基因WT1肾母细胞癌DCC结肠癌APC家族性腺瘤息肉癌变广广义的的讲,许多在多在细胞繁殖中起正常作用的基因胞繁殖中起正常作用的基因,如如DNA修复基因，其突修复基因，其突变也会也会导致致肿瘤的瘤的发生生,它它们的存在的存在间接地起到抑制接地起到抑制肿瘤的作用瘤的作用32.临床评价1、假阳性与假阴性2、阳性率与
28、“金标准”3、临床实践是最重要的依据33.遗传病诊断地中海地中海贫血血：珠蛋白序列中的的十几种点突变；3-碱基特异的PCR或ASO.地中海地中海贫血血:16号染色体珠蛋白序列中基因簇的三种大片段缺失；每条染色体上各有两个紧密连锁的基因，故一对16号染色体上共有四个珠蛋白基因（/）缺失1个基因-+珠蛋白合成障碍性贫血缺失2个基因-0珠蛋白合成障碍性贫血缺失3个基因-HbH病缺失4个基因（全部缺失）-HbBarts胎儿水肿综合症非缺失型珠蛋白合成障碍性贫血不终止HBconstantspring34.遗传病诊断甲型血友病：X-连锁隐性遗传病，（长距离PCR技术）唐氏综合症（21三体）：三体形成配子期
29、；智力低下，1/800全基因组分析法:多个具有多态性的位点进行连锁分析。35.生物芯片：PCR技术在HLA-DRB1基因配型中的应用：序列特异性引物PCR（SSP-PCR）：36.基基因因诊断断是是指指检测感感染染者者体体内内病病毒毒核核酸酸的的有有无无,或或含量多少来含量多少来进行病原学行病原学诊断的一断的一类方法。方法。病病毒毒性性肝肝炎炎基基因因诊断断包包括括病病毒毒基基因因种种类及及含含量量、基因分型、基因分型、亚型和型和变异及准种等的异及准种等的诊断。断。甲甲型型肝肝炎炎和和戊戊型型肝肝炎炎无无慢慢性性化化,且且有有较好好的的血血清清学学诊断指断指标,故一般不需故一般不需进行基因行基
30、因诊断。断。HGV和和TTV病毒性肝炎的基因病毒性肝炎的基因诊断断37.定定性性和和定定量量PCR：定定性性检测主主要要是是用用于于未未知知感感染染者者的的诊断断,确确定定患患者者是是否否感感染染了了肝肝炎炎病病毒毒,结果果分分别报告告为阳性阳性或或阴性阴性。定量定量测定：己知感染者的抗病毒治定：己知感染者的抗病毒治疗时动态观察察疗效效,结果果报告需以量来表示。如高出定量范告需以量来表示。如高出定量范围上限，上限，则需需对标本稀本稀释后再后再测,低于定量范低于定量范围下下限限时,则报告小于告小于copies/ml,不能以不能以阴性阴性形式形式报告。告。病毒性肝炎的基因病毒性肝炎的基因诊断断38
31、.肝炎病毒甲型肝炎病毒与戊型肝炎病毒由消化道传播，引起急性肝炎，不转为慢性肝炎或慢性携带者。乙型与丙型肝炎病毒主要由输血、血制品或注射器污染而传播，除引起急性肝炎外，可致慢性肝炎，并与肝硬化及肝癌相关。丁型肝炎病毒为一种缺陷病毒戊型肝炎病毒（HEV）庚型肝炎病毒（HGV）TT型肝炎病毒（TTV）SEN型肝炎病毒（HSV）39.甲型肝炎病毒（hepatitisAvirus，HAV）40.HAV的生物学性状属小RNA病毒科，直径27nm，无包膜呈20面立体对称外面为一独立外壳，内含一个单链RNA分子41.HAV的电镜照片Feinstone（1973）42.HAV的结构43.HAV的致病性粪口途径传
32、播口咽部或唾液腺中早期增殖肠道与局部淋巴结中大量增殖入血并形成病毒血症肝脏为最终靶器官（病毒直接损伤或免疫病理作用）通过胆汁随粪便排出体外44.45.HAV的免疫性HAV只存在单一的抗原抗体系统，即HAVAg和抗-HAV无论显性感染还是隐性感染均能诱生出高效价抗-HAV抗-HAVIgM阳性是甲肝的确诊依据IgM型抗体在感染后仅持续存于3-6个月IgG型抗体则可存在多年46.TimecourseofHAVinfection47.HAV的其他生物学特性培养特性培养特性原代肝细胞或恒河猴胚肾传代株细胞对HAV敏感，生长缓慢，不引起细胞裂解抵抗力抵抗力比肠道病毒更耐热，601h不被灭活，100oC5分
33、钟可灭活对乙醚、酸处理（pH3）均有抵抗力氯消毒、紫外线照射、福尔马林处理均可破坏其传染性48.常见症状流感样症状厌食恶心黄疸（眼部及皮肤呈黄色）尿黄腹痛乏力49.微生物学检查感染早期可检测血清中的抗HAVIgM流行病学调查可检测抗HAVIgG对已接种甲肝疫苗者检测中和型抗HAV抗体直接检测抗原或用分子生物学方法检测病毒RNA50.乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）51.HBV-DNA病原学：HBV属嗜肝DNA病毒科，部分双链DNA，3200碱基对，10个亚型，序列表明不同亚型的变异为10%，同一亚型的变异为2%。检测：病原体抗原、抗体核酸临床评价：52.HBV的基因组结构
34、3.2Kb不完全双链环状DNA，含4个ORF53.54.可可将将微微孔孔板板包包被被有有蛋蛋白白质（如如亲和和素素或或链霉霉亲和和素素、抗抗Dig-抗抗体体、牛牛血血清清白白蛋蛋白白）或或已已知知序序列列的的核核苷苷酸酸，此此为通通用用型型活活化化微微孔孔板板，任任何何探探针末末端端只只要要含含有有相相应配配体体或或与与已已知知序序列列互互补的的核核苷苷酸酸都都可可与与相相应的的活活化化微微化化板板固固相相化化。我我们设计了了HBV特特异异探探针，其其-端端含含-段段与与通通用用板板已已知知序序列列互互补的的核核苷苷酸酸，引引物物5端端修修饰有有生生物物素素，HBVDNAPCR产物物与与固固相
35、相化化探探针杂交交后后，即即可可用用酶标亲和和素素进行行酶呈呈色色测定定，并并证实其其测定定 敏敏 感感 度度 至至 少少 高高 于于 普普 通通 电 泳泳 法法 100倍倍。55.HBVDNA定量定量测定的定的临床意床意义为临床床诊断提供更全面、精确的断提供更全面、精确的资料料真真实、全面地反映、全面地反映HBV感染、复制及病情感染、复制及病情变化化过程程抗病毒治抗病毒治疗的分子水平的分子水平监测用用HBVDNA的血清的血清浓度的度的变化来化来评价抗病毒价抗病毒药物的物的疗效效56.：荧光探针1：荧光探针2：引物：PCR扩增产物：Taq酶扩增及检测原理57.a：变性，双性，双链模板裂解成两条
36、模板裂解成两条单链58.b：退火，引物、：退火，引物、荧光探光探针分分别结合到合到单链模板的相模板的相应位点，位点，探探针3端激端激发基基团和探和探针5端的端的发光基光基团紧靠在一起，靠在一起，发出出640nm的的荧光光59.c：延伸，随聚合反：延伸，随聚合反应的的进行，行，结合在模板上的合在模板上的2条条荧光探光探针被替被替换下来。下来。60.d：一个循：一个循环结束，生成束，生成2条双条双链模板模板61.阳性率（）阳性率（）上海上海瑞金医院瑞金医院上海市上海市传染病医院染病医院浙医大附属浙医大附属第一医院第一医院合合计“大三阳大三阳”标志志100（42/42）100(38/38）100(2
37、8/28）100（108/108）“小三阳小三阳”标志志43.9(18/41）78.9(30/38）46.4(13/28）57.0(61/107）其它其它HBV血清学血清学标志阳性志阳性7.5（3/40）38.0(19/50）23.8（5/21）24.3(27/111）非乙肝肝病非乙肝肝病0（0/20）0（0/18）0（0/18）0（0/56）献血献血员0（0/40）0（0/36）0（0/28）0（0/104）不同不同临床床标本本组中的中的HBVDNA检出出率率62.不同不同临床床标本本组中中HBVDNA阳性的定量阳性的定量结果果临床组平均病毒载量考核医院“大三阳”标志“小三阳”标志瑞金医院2
38、.831078.80105上海传染病医院1.001071.85105浙一医院1.931071.70105合计1.781076.8510563.电镜下的HBV64.Dane颗粒65.HBV的小球形颗粒66.HBV的管形颗粒67.68.HBV的复制的复制69.HBV的抗原组成表面抗原HBsAg核心抗原HBcAge抗原HBeAg70.表面抗原HBsAg存在于三型颗粒中是HBV感染的主要标志分亚型（a,d/y,w/r,adr）产生抗-HBsPreS1、PreS2及抗-PreS1和抗-PreS271.核心抗原HBcAg仅存在于Dane颗粒中不易在血液中检出可在感染的肝细胞表面存在刺激机体产生抗HBc（I
39、gG、IgM）表明病毒在复制72.e抗原HBeAg仅存在于Dane颗粒中游离存在于血液中为病毒复制及强传染性的指标产生抗HBe，是预后良好的征象73.HBV的其它生物学性状培养黑猩猩动物模型、鸭动物模型用分子生物学技术的细胞培养成功抵抗力抵抗力强于HAV对低温干燥紫外线耐受不被70乙醇灭活10010分钟可灭活74.HBV的致病机制免疫低下：HBsAg无症状携带者病毒变异：逃逸免疫细胞介导的免疫损伤：为主免疫复合物性的免疫损伤：肝外损伤自身免疫反应的免疫损伤：肝特异性脂蛋白抗原75.HBV的传染机制传染源主要传染源是患者或无症状HBsAg携带者传播途径密切接触血液及体液母婴传播不严格集体预防接种
40、、药物注射针刺、文身等76.乙型肝炎的特点我国约有40%-60%人群曾受到过HBV的感染表现急性乙肝的仅占0.1%-1%，亚临床30%-75%，慢性乙肝1%-5%，乙肝病毒携带7%-20%)急性乙肝如治疗不彻底，10%患者可转为慢性乙肝77.乙肝五项及HBVDNA的临床意义HBsAg、抗HBsHBeAg、抗HBe抗HBc（HBcAg）HBVDNA78.乙乙型型肝肝炎炎病病毒毒抗抗原原,特特别是是表表面面抗抗原原,在在血血液液中中的的浓度度较高高,现症症HBV感染感染明确明确诊断。断。仅抗抗HBc单项阳阳性性,也也可可在在血血清清中中检测到到HBVDNA乙型肝炎的乙型肝炎的诊断往往不需要断往往不
41、需要进行病毒核酸的行病毒核酸的检测。抗抗病病毒毒治治疗时,血血清清中中的的病病毒毒核核酸酸含含量量是是反反映映病病毒毒数数量量和和复复制制活活跃程程度度最最可可靠靠的的直直接接指指标、动态观察察药物物疗效效的的确确切切指指标,特特别是是对于于HBeAg阴阴性性患者。患者。79.预防及免疫控制传染源，切断传播途径人工自动免疫：疫苗（血源性、基因工程)人工被动免疫：高效价人血清球蛋白（HBIg）80.丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus）81.HCV的生物学性状4060nm球形有包膜单正链RNA82.HCV的基因结构83.丙型肝炎的特点我国丙肝病毒携带者的比例在2%-5%随着年龄的增长，丙
42、肝病毒携带率亦增高易感人群感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上乙肝患者容易重叠HCV感染84.HCV的诊断及预防检查病毒RNA检测抗HCV因HCV免疫原性不强及变异，目前尚无可用疫苗85.HCV-RNAHCV是引起输血后肝炎主要致病因子，因为血中HCV含量仅为HBV的千分之一，加之其免疫学标志仅有抗-HCV一项，至今HCV分离尚不成功，其检测较HBV困难得多，因此分子生物学方法在此应用显得格外重要。86.丙型肝炎基因丙型肝炎基因诊断及意断及意义 结结果判断果判断果判断果判断抗HCV(+)伴ALT，或已排除其他肝炎的慢性肝炎，可诊断为丙肝。抗HCV(+)，ALTN。必须检测到HCV-RNA(
43、+)（定性）才诊断丙肝。87.丙型肝炎基因丙型肝炎基因诊断及意断及意义 结结果判断果判断果判断果判断抗HCV(-)，临床怀疑丙肝。应做HCV-RNA二次定性或有一次定量(+)，可诊断为丙肝。常见于免疫功能低下或缺陷、少数儿童和老人。急性丙肝抗HCV检出率为50%-90%，应检测HCV-RNA。抗病毒药用治疗必须用定量PCR检测反映药物疗效。88.HCV-RNA病原学：单链正股RNA病毒基因组长度10KB，为一个连续的ORF，包含多个结构区和非结构区的蛋白基因。HCV变异及其亚型：序列变异率在3.2-28%之间,不同国家和地区分离的毒株基因差异很大,同一患者在不同时期分离的毒株也有变异.HCV基
44、因组分为I-IV型和若干亚型.89.定量检测HCVRNA:1.可用于急性丙肝的早期诊断,在HCV阳性之前2.可作为HCV感染有无传染性的指标3.作为抗病毒疗效的指标90.HCV的生物学性状4060nm球形有包膜单正链RNA91.HCV的致病性与免疫性传播途径似HBV是引起输血后慢性肝炎和肝硬化的主要原因潜伏期：4-8周无症状HCV携带者和慢性丙肝者多见诱发肝外损伤：肾小球肾炎免疫力不牢固92.丙型肝炎的特点我国丙肝病毒携带者的比例在2%-5%随着年龄的增长，丙肝病毒携带率亦增高易感人群感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上乙肝患者容易重叠HCV感染93.94.HCV的诊断及预防检查病毒RNA
45、检测抗HCV因HCV免疫原性不强及变异，目前尚无可用疫苗95.HCV的诊断及预防丙型肝炎病毒：中国普通人群抗抗体的阳性率为32%全世界约17亿人感染了目前除了干扰素()或其与利巴韦林联合应用对部分患者有一定疗效疫苗研究：由于包膜糖蛋白2中和性抗原位点存在高变区1(1)进展甚微96.抗原表位：抗原表位：线性表位、空性表位、空间表位。如果以特异表位。如果以特异性抗体性抗体对化学合成的随机噬菌体多化学合成的随机噬菌体多肽库进行行筛选,则很很难筛选到与原始的抗原序列完全一致的序列到与原始的抗原序列完全一致的序列,而是而是获得大量与原得大量与原始抗原序列完全不同的多始抗原序列完全不同的多肽片段。片段。这
46、种一种一级结构序列与原始构序列与原始抗原不同抗原不同,又保留其抗原反又保留其抗原反应性的抗原表位性的抗原表位,称称为模模拟表位表位()。从其。从其结构而言构而言,模模拟表位多数是构象表位多数是构象表位表位(),即即空空间表位。表位。噬菌体表面展示技噬菌体表面展示技术的建立和的建立和应用促用促进了抗原模了抗原模拟表表位的研究。国外学者位的研究。国外学者应用噬菌体表面展示技用噬菌体表面展示技术筛选获得了得了不同的不同的结构和非构和非结构蛋白抗原的模构蛋白抗原的模拟表位。表位。这些研究些研究结果首先在免疫学理果首先在免疫学理论上上阐明了抗原明了抗原抗体分子之抗体分子之间相互相互对应的多的多样性的性的
47、问题,同同时由于模由于模拟表位的抗原性表位的抗原性较强,且具有广且具有广谱性性,因此因此,在新型在新型诊断断试剂和广和广谱疫苗的研究中具有重要的疫苗的研究中具有重要的应用前景。用前景。97.HCV的诊断及预防丙型肝炎病毒感染的诊断,第三代血清学检测试剂较好的敏感性和特异性,但20%患者可不出现抗体,或有的患者抗体存在时间可以很长现行感染，早期诊断因此,核酸检测在HCV感染的诊断中要比HBV感染的诊断重要得多。98.丁型肝炎病毒（hepatitisDvirus，HDV）HDV是一种缺陷病毒由HBsAg构成其外壳HDV定位于肝细胞核内，在血液中由HBsAg包被，形成35-37nm颗粒单负链环状RN
48、A99.HDV的结构Rizzetto于于1977年首先年首先发现，又称，又称 抗原抗原35-37nm球球形形颗粒；粒；1.7Kb-ssRNA含含9个个ORF100.丁型肝炎的特点只能感染HBsAg阳性的病人我国丁肝感染率在1.6%-5%，西南地区感染率高患者可不定期隔离，或隔离至肝功能正常，或HBsAg阴转。病原学检查为HDAg、抗HD及HDV-RNA，持续高滴度IgG型抗HD是慢性HDV感染的主要血清学标志。一旦乙肝患者感染了HDV，尤其是在慢性乙肝的基础上感染，容易发展成为重度慢性乙肝、重型肝炎，甚至肝硬化。101.微生物学检查及预防诊断为检测抗-HDHDV-RNA丁型肝炎传播途经与乙型肝
49、炎相似。传播途径和防治原则似HBV。102.戊型肝炎病毒（hepatitisEvirus，HEV）球形，无包膜直径3234nm单正链RNA，3个ORF两个血清型103.致病性及免疫主要为粪口途径传播由胆汁经粪便排出体外对肝细胞的直接损伤及免疫病理作用多表现为急性戊型肝炎孕妇感染常致流产104.戊型肝炎的特点与甲型肝炎相比，患者黄疸前期症状重，病程持续时间较长，病死率较高，特别是孕妇感染HEV后。青壮年是HEV最喜欢攻击的人群。戊型肝炎分两种：“流行性”多发生在雨季和洪水后，“散发性”在秋冬季呈现高峰。传染性强的时间在患者将要出现症状前(潜伏末期)至发病初期，患者的隔离期为起病后3周。尚末发现有
50、2次发病者。105.微生物学检查及预防检测HEV：EM或IEM检测抗-HEVIgMHEVRNA预防与甲肝类似106.TLMV病毒（病毒（TTV-likedminivirus,TLMV）：2000年TakahashiTTV-DNA引物作PCR，检测抗-HCV阳性血浆，10份TTVDNA滴度105拷贝/ml，其中3份（分别为CBD231、279和203）血浆PCR产物的长度较预期为短（约1.2kb），该病毒的全长DNA序列较TTV为短，分别为2860nt（CBD231株）、2856ntBD279株）和2897nt（CBD203株），证明是一种新病毒，命名为TTV样微小病毒（TTV-likemini