《第十二章基因工程与蛋白质工程.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第十二章基因工程与蛋白质工程.pptx（44页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第十二章基因工程与蛋白质工程n n 第一节 生物工程概述n n 第二节 基因工程n n 第三节 蛋白质工程第一节 生物工程概述一、生物工程概念及研究技术二、在现代工、农、医领域中的应用一、生物工程的概念及研究技术1.基因工程在分子水平的遗传操作技术2.细胞工程遗传物质在细胞间的转移4.生化工程生物工程产品的最终取得手段3.酶工程酶的改造和设计二、生物工程在现代工、农、医领域中的应用1.1.化工及冶金工业化工及冶金工业2.2.轻工和食品工业轻工和食品工业4.4.农业和畜牧业农业和畜牧业3.3.医药工业医药工业5.5.环保和能源工业环保和能源工业 基因工程包括DNA重组技术和其他使基因结构得以定向
2、改造的技术。本节主要介绍DNA重组技术，大体上包括下列5个步骤。DNA重组的 技术路线Foreign DNA to be insertedPlansmid vectorJoiningRecombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation Host chromatemeSlection for cells coteining a recombinant DNA moleculeCloning+1、目的基因的制备、目的基因的制备2、载体载体的构建的构建3、目的基因与载体、目的基因与载体的重组的重组4、重组、重组
3、 体体导入导入宿主宿主细胞进行扩增细胞进行扩增5、克隆基因的鉴定克隆基因的鉴定第二节 基因工程一、目的基因的获得二、基因载体三、重组DNA的筛选及表达一、目的基因的获得1.限制酶特异性切割DNA的手术刀2.取得目的基因的方法分离法及合成法1.限制性内切酶 DNA重组重组即是将两种DNA分子经过切割，选择适合的片段连接起来的过程 实现这一步，是在限制性内切酶发现以后才实现的 限制性内切酶：一类核酸内切酶，可以将外源DNA在特定位点切割降解 。以后从细菌中分别分离出了I型和型两类限制性内切酶。限制性内切酶的命名 用细菌同名的第一个字母（大写）和种名的用细菌同名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母
4、（小写）构成酶的基本名称。若酶前两个字母（小写）构成酶的基本名称。若酶是从其中一种特殊菌株来，还在基本名称后加是从其中一种特殊菌株来，还在基本名称后加上菌株名称符号。名称后的罗马数字，表示在上菌株名称符号。名称后的罗马数字，表示在该特殊菌株中发现此酶的先后次序。如该特殊菌株中发现此酶的先后次序。如HaeIIHaeII是从（是从（Haemophilus aegypticusHaemophilus aegypticus）中提取的，中提取的，并且是从中发现的第二个酶并且是从中发现的第二个酶。l限制性内切酶切割DNA的方式 a.a.从识别序列的中间切开从识别序列的中间切开b.b.在识别序列对称轴的左右
5、两方进行切割在识别序列对称轴的左右两方进行切割 c.c.在识别序列对称轴的右边（在识别序列对称轴的右边（5 5-3 3 链）和对称轴链）和对称轴左边（左边（3 3-5 5 链）切开链）切开 a.从识别序列的中间切开 从识别序列的中间切开产生平齐末端（从识别序列的中间切开产生平齐末端（bluntendsbluntends），），如如HaeHae b.在识别序列对称轴的左右两方进行切割 即分别在即分别在5 5-3-3 链和链和3 3-5-5 链对称轴的左右方切开链对称轴的左右方切开 ，形成带有凸出的形成带有凸出的5 5 磷酸基团的粘性末端磷酸基团的粘性末端（Cohesive endsCohesiv
6、e ends），），如如EcoREcoR c.在识别序列对称轴的右边（5-3链）和对称轴左边（3-5链）切开形成带有凸出的形成带有凸出的3 3 羟基的粘性末端，如羟基的粘性末端，如pstIpstI2.取得目的基因的方法 分离法及合成法（1）DNA片段的直接提取（2）用噬菌体或质粒直接从宿主细胞中将目 的基因携出（3）使用相应的mRNA分离基因二、基因载体1.质粒染色体以外的遗传单元2.噬菌体感染细菌的病毒 质粒是一种环状双链的DNA分子。自身在细菌细胞中能不断复制繁殖。研究比较深入的质粒有大肠杆菌的性因子（F因子）、大肠杆菌素因子和抗药因子等 抗药因子（质粒）在其DNA上编码有某些酶的基因，表
7、达产生的酶对链霉素、氯霉素、磺胺、青霉素、四环素、卡那霉素等药物能产生生物化学修饰，使之钝化而失效1.质粒染色体以外的遗传单元质粒的作用 质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌。这个过程称转化。转入的质粒DNA仍能进行复制，这种性能为DNA重组技术提供了重要的条件，即将一种外源基因与质粒重组后，再转入细菌中去复制繁殖，使外源基因得以增殖。质粒自身的某些抗药基因成为从转化的细菌中筛选它们的一种标记。除质粒外，噬菌体、病毒也能通过“感染”将外源基因带入细菌并进行复制。目前所使用的质粒 目前实验中所使用的质粒、噬菌体和病毒载体种目前实验中所使用的质粒、噬菌体和病毒载体种类很多。但都是经过了人工改
8、造，更适宜运用于类很多。但都是经过了人工改造，更适宜运用于DNADNA重组技术。它们既保留了转化和感染活细胞重组技术。它们既保留了转化和感染活细胞的能力，又具有多处携带外源的能力，又具有多处携带外源DNADNA的酶切位点，的酶切位点，并含有特殊的筛选标记并含有特殊的筛选标记 这些载体中有些只能复制扩增带入的外源基因；这些载体中有些只能复制扩增带入的外源基因；有些可以使外源基因复制、转录和翻译出基因的蛋有些可以使外源基因复制、转录和翻译出基因的蛋白质产物，这种载体称为表达载体白质产物，这种载体称为表达载体pBR322质粒的结构质粒的结构 以噬菌体或病毒为载体，将所需基因或含有此基以噬菌体或病毒为
9、载体，将所需基因或含有此基因的因的DNADNA片段转移给受体细胞的过程，称为转导。片段转移给受体细胞的过程，称为转导。我们常常采用我们常常采用 噬菌体作为基因工程的载体，其一噬菌体作为基因工程的载体，其一它的遗传结构与功能知道得比较清楚；其二是易于它的遗传结构与功能知道得比较清楚；其二是易于使细胞感染，易于使外源使细胞感染，易于使外源DNADNA导入宿主细胞。导入宿主细胞。2.噬菌体感染细菌的病毒以以以以 噬菌体为载体噬菌体为载体噬菌体为载体噬菌体为载体进行进行进行进行DNADNA克隆克隆克隆克隆 DNA用限制性内切酶用限制性内切酶除去中间一段除去中间一段与外源与外源DNA连接连接重组载体的体
10、外包装重组载体的体外包装带有外源带有外源DNA的的 噬菌体噬菌体太小不能被包装太小不能被包装头部前体头部前体多联体多联体DNAA蛋白蛋白COSCOSCOS成熟的颗粒成熟的颗粒在宿主细胞内进行在宿主细胞内进行DNA的装配过程的装配过程三、重组DNA的筛选及表达1.1.转化转化带有目的基因的载体进入受体细胞带有目的基因的载体进入受体细胞2.2.筛选筛选从大量受体细胞选出带有重组体的细胞从大量受体细胞选出带有重组体的细胞3.3.表达表达外源外源DNADNA在受体细胞的转录和翻译在受体细胞的转录和翻译1.转化带有目的基因的载体进入受体细胞 由质粒作载体形成的克隆，转入细菌时细菌预先要由质粒作载体形成的
11、克隆，转入细菌时细菌预先要在低温条件下用氯化钙处理，形成在低温条件下用氯化钙处理，形成“感受态感受态”细胞。即细胞。即增加细胞膜的通透性才能实现转化。增加细胞膜的通透性才能实现转化。由噬菌体作载体的克隆，转入细胞的过程称为由噬菌体作载体的克隆，转入细胞的过程称为“侵染侵染”。因噬菌体具有自动侵入的功能。细菌不用预先处理。因噬菌体具有自动侵入的功能。细菌不用预先处理。噬菌体感染大肠杆菌的途径噬菌体感染大肠杆菌的途径2.筛选从大量受体细胞选出带有重组体 的细胞（1 1）插入失活法）插入失活法（2 2）放射性探针检测法）放射性探针检测法（3 3）R-R-环检测法环检测法（4 4）免疫测定法）免疫测定
12、法（1 1）插入失活法）插入失活法 在现在的基因工程操作中，所使用的载体通在现在的基因工程操作中，所使用的载体通常是经过加工改造的衍生物，它们要么带有常是经过加工改造的衍生物，它们要么带有一个或几个可供选择的遗传标记，要么具有一个或几个可供选择的遗传标记，要么具有被选择的遗传功能，这就使带有目的基因与被选择的遗传功能，这就使带有目的基因与不带目的基因的细菌有明显区别，便于筛选。不带目的基因的细菌有明显区别，便于筛选。pBR322质粒结构质粒结构 如果外源如果外源DNA插入，氨卞青霉素插入，氨卞青霉素抗性基因失活抗性基因失活 如果外源如果外源DNA插插入，四环素抗性基入，四环素抗性基因失活因失活
13、（2 2）放射性探针检测法）放射性探针检测法 利用利用mRNAmRNA可与相应的可与相应的DNADNA段落杂交，来检段落杂交，来检测有外源测有外源DNADNA插入的重组体，是一种快速而插入的重组体，是一种快速而灵敏的方法。灵敏的方法。（3 3）R-R-环检测法环检测法 在有利于形成在有利于形成R-R-环的条件下，使待检测的纯环的条件下，使待检测的纯化的质粒化的质粒DNADNA，在含有，在含有mRNAmRNA的缓冲液中局部的缓冲液中局部变性。如若质粒变性。如若质粒DNADNA存在着与存在着与mRNAmRNA探针互补探针互补的序列，的序列，mRNAmRNA就会取代就会取代DNADNA中一条链，与另
14、中一条链，与另一条链形成双链杂交分子，从而形成一条链形成双链杂交分子，从而形成R-R-环结构环结构，在电子显微镜下观察，可直接观察到，在电子显微镜下观察，可直接观察到R-R-环。环。这样可检出重组体质粒这样可检出重组体质粒DNADNA。（4 4）免疫测定法）免疫测定法免疫法测定只能是所转移外源免疫法测定只能是所转移外源DNADNA必须表达必须表达后才能进行，而且必须具备有效的特异性抗后才能进行，而且必须具备有效的特异性抗体。体。SouthernSouthern和和和和WesternWestern印迹法印迹法印迹法印迹法DNA frangmentElectrophoresisTransfer o
15、f DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled spesfic antibody,Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiography3.表达外源DNA在受体细胞中的转录和
16、翻译 带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛选出来后，最终目的是要目的基因在受体细胞中选出来后，最终目的是要目的基因在受体细胞中得以表达，产生具有功能性的蛋白质或肽得以表达，产生具有功能性的蛋白质或肽。第三节第三节 蛋白质工程蛋白质工程一、一、一、一、蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念二、二、二、二、蛋白质工程的一般技术蛋白质工程的一般技术蛋白质工程的一般技术蛋白质工程的一般技术三、三、三、三、蛋白质工程的应用蛋白质工程的应用蛋白质工程的应用蛋白质工程的应用一、蛋白质工程的概念一、蛋白质工程的概念 蛋白质工程蛋白质工程蛋白
17、质工程蛋白质工程(protein engineering)protein engineering)：通过改造通过改造与蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合与蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质技术因表达而获得具有新的特性的蛋白质技术1 1、基因定点突变、基因定点突变定做新蛋白质定做新蛋白质2 2、蛋白质设计、蛋白质设计对天然蛋白质的修饰对天然蛋白质的修饰蛋白质工程 举例：定点突变技术：定点突变技术：已知丝氨酸是由已知丝氨酸是由TCTTCT编码，只要把编码，只要把C C改为改为GG
18、，就变成就变成半胱氨酸的密码半胱氨酸的密码TGTTGT。于是用人工合成一段寡聚核苷酸引于是用人工合成一段寡聚核苷酸引物，引物里含有物，引物里含有TGTTGT外，其余均与基因部分互补。打开含外，其余均与基因部分互补。打开含有被突变蛋白质基因的质粒的双条链成单链模板，用引物有被突变蛋白质基因的质粒的双条链成单链模板，用引物与之互补链退火（假如退火在适宜温度下进行，约与之互补链退火（假如退火在适宜温度下进行，约1515个碱个碱基中，有一个碱基错配是可以容忍的）。然后由基中，有一个碱基错配是可以容忍的）。然后由DNADNA聚合聚合酶延伸引物，由酶延伸引物，由DNADNA连接酶将双链再连接成环，转入宿主
19、连接酶将双链再连接成环，转入宿主细胞复制，即产生两种子代质粒。一半的顺序中含有细胞复制，即产生两种子代质粒。一半的顺序中含有TCTTCT顺序，另一半含有顺序，另一半含有TGTTGT顺序。表达具有顺序。表达具有TGTTGT顺序的质粒，顺序的质粒，即可以产生在同一部位上半胱氨酸代替丝氨酸的蛋白质。即可以产生在同一部位上半胱氨酸代替丝氨酸的蛋白质。二、蛋白质工程的一般技术二、蛋白质工程的一般技术1 1、蛋白质工程的理论设计、蛋白质工程的理论设计蛋白质工程的前提蛋白质工程的前提2 2、点突变法、点突变法基因修饰的方法基因修饰的方法（1 1）基因的全化学合成）基因的全化学合成（2 2）基因直接修饰法）基
20、因直接修饰法（3 3）盒式突变技术）盒式突变技术三、蛋白质工程的应用三、蛋白质工程的应用1 1、蛋白质工程酶、蛋白质工程酶酶特性的改造酶特性的改造（1 1）改变酶的催化活性）改变酶的催化活性（2 2）改变酶的底物专一性）改变酶的底物专一性（3 3）提高酶的稳定性）提高酶的稳定性（4 4）酶的反应特性改变）酶的反应特性改变（5 5）产生新酶）产生新酶2 2、合理药物设计、合理药物设计蛋白质工程用于新药研制蛋白质工程用于新药研制 譬如：胰岛素原的人工合成譬如：胰岛素原的人工合成胰岛素原的人工合成胰岛素原的人工合成胰脏胰脏(A)n胰岛素原胰岛素原mRNAcDNA重组质粒重组质粒转化细菌转化细菌mRNA反转录酶反转录酶胰岛素原基因胰岛素原基因与质粒与质粒连接连接感染感染E.coli胰岛素原胰岛素原The End谢谢观赏Game Over！