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1、神经生物学试验指导书试验一脑内重要神经核团和神经生物学争辩方法简介Methods for neuroscience research and nuclei in brain1. 试验目的理解神经核团的概念，理解重要的神经核团；把握脑立体定位图谱的使用方法；了解神经生物学争辩的常用方法。2. 试验器材、试剂及试验材料手术刀、毛剪、注射器，1%戊巴比妥钠(Pentobarbital Sodium)、依文氏蓝(Evans Blue)，大鼠。3. 试验步骤3.1 脑的大致构造和重要神经核团脑膜至外由内分别有：硬脑膜、蛛网膜、软脑膜，其下是大脑皮层，边缘系统等构造。重要的核团神经内分泌相关的丘脑下部核团
2、有：PVN室周核、PeN室旁核、SON视上核、ME正中隆起、Hippocampus海马等。下表给出几个重要核团的大致范围，值得留意的是：核团在不同截面上的位置和外形是不同的，因此具体位置应查阅图谱。神经核团距离前囟mm中心线两侧mm距脑背侧mmPVN室周核-1.0-4.20.00.85.05.5PeN室旁核0.0-3.20.00.56.59.5SON视上核0.0-1.81.02.38.58.8ME正中隆起-2.4-3.40.00.59.510.0Hippocampus海马-1.8-6.20.56.33.28.03.2 试验内容a) 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠40mg/kg；b) 在颅骨前囟后
3、3-5mm 处打孔；c) 用微量注射器吸入 3l 依文氏蓝，注入大鼠背侧三脑室。d) 大鼠断头，除去颅骨，观看脑的构造。George Paxinos and Charles Watson，The Rat Brain in Stereofaxic coordinates，Academic press，19864. 江湾型脑定位仪的使用6.1 脑立体定位仪的原理a) 脑立体定位仪分为两大类：直线式和赤道式。b) 直线式脑立体定位仪的设计原则c) 利用动物颅骨外表的某些解剖标志同脑外表及深部某一构造的相对恒定关系，从外部确定脑深部各构造的位置。d) 用立体空间直角坐标，以mm 为单位，描述脑深部某构
4、造所在的空间位置。e) 用一结实的金属主框，加上杆、夹组成准确而对称的头夹。用一组有三维立体滑尺的电极移动架来导向，电极可准确地插入脑内某一指定构造。6.2 使用方法a) 装上耳杆、上颌固定器、电极移动架，调整主框架至水平，测试两耳杆中心接触处是否在正中处。b) 装上架假电极，用假电极测定耳杆中心的高度,然后将电极移到门齿板上缘,调整门齿板比耳间线低 5mm该调整须依据图谱定，要与图谱中的方法保持全都。c) 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠40mg/kg，将其固定在定位仪上。d) 按图谱确定核团的位置，在颅骨相应位置打孔。e) 按图谱在相应核团埋管。5. 神经生物学争辩的常用方法神经科学的进展与的争
5、辩方法的进步亲热相关。总体上，神经生物学的争辩方法有六 大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子生物学方法及脑成像技术。7.1 形态学方法神经生物学争辩中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。7.1.1 束路追踪法追踪神经元之间的联系是神经解剖学争辩中的重大目标，它对争辩神经元的功能、神经系统的 发育和成熟都具有重要意义。这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变顺行溃变指胞体 或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变争辩。20世纪40年 代主要手段是镀银染色法，依据变性纤维的形态
6、变化来推断变性纤维。20世纪50年月进展了Nanta法， 能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过 氧化物酶HRP注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在脊髓和延脑的相应局部运动神经元胞体内觉察HRP 的积存 。不久LaVail正式使用HRP作为轴突逆行追踪，以后遂广泛应用于中枢神经系统的争辩。HRP 可被神经末梢、胞体和树突吸取，轴突损伤局部也可摄入。在胞体内，HRP的活性可持续45天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反响而显现出来。被标记的神经元可以清楚的显示胞体、树突及轴突。除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。7.1
7、.2 免疫组织化学，检测细胞内多肽、蛋白质及膜外表抗原和受体等大分免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合 的免疫学原理子物质的存在与分布。这种方法特异性强，敏感度高，进展快速，应用广泛，成为生 物学和医学众多学科的重要争辩手段。近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技 术不断提高，免疫组织化学的进展更是日月异，不仅用于很多根本理论的争辩，并取得重大突破， 而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。组织的多肽和蛋白质种类繁多，具有抗原性。分别纯化人或动物组织某种蛋白质，作为抗原注入另 一种动物体内，后者即产生相应的特异性抗体免疫球蛋白。从被免疫动物的血清中提取出该抗体， 再以荧光素、酶、铁
8、蛋白或胶体金标记，用这种标记抗体处理组织切片或细胞，标记抗体即与细胞的相应蛋白质抗原发生特异性结合。常用的荧光素是异硫氰酸荧光素FITC和四甲基异硫氰酸罗丹明 TRITC，在荧光显微镜下可观看荧光抗体抗原复合物。常用的酶是辣根过氧化物酶horseradish peroxidase,HRP,从辣根菜中提取的，它的底物是 3，3”二氨基、联苯胺DAB和H O ,HRP 使DAB 氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观看。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原22的结合，也可在光镜和电镜下观看。标记抗体被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的抗原直接 结合。这种方法操作简便，但敏感度
9、不及间接法。间接法是将分别的抗体第一抗体简称一抗再 作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体抗原的抗体其次抗体简称二抗，再以标记物标记二抗。 先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成抗原一抗标记二抗复合物。间接法中的一个抗原分子 可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它的敏感度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品 供给， 使用便利。间接法中较常用的是一种称之为过氧化物酶 抗过氧化物酶复合物法peroxidase-antiperoxidase complex method,PAS 法，该法除需一抗和二抗外，还需制备HRP 标记的抗酶抗体，即以HRP 作为抗原免疫动物，制成抗HRP 抗体，再以HRP 标
10、记该抗体制成由 3 个酶分子与 2 个抗酶抗体组成的相当稳定的环形PAP 复合物。标本先后以一抗、二抗和 PAP 复合物处理后，再以 DAB 显色，即可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大而与多个酶分子结合，因此敏感性很强。免疫组织化学术近 10 年来又有进展，如生物素亲合素等颖试剂的应用，为检测微量抗原、受体、抗体开拓了途径。生物素biotin又称维生素 H，是从卵黄和肝中提取的一种小分子物质分子量 244.31；亲合素avidin又称卵白素，是从卵白中提取的一种糖蛋白分子量 68kD。每个亲合素分子有生物素结合的4 个位点，二者可结实结合成不行逆的复合物。生物素亲合素的应
11、用大致有三种方法。标记亲合素生物素法labelled avidin- biotin method,LAB 法：将亲合素与标记物HRP结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体一抗与二抗结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原或 通过一抗先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。桥连亲合素生物素法bridged avidin-biotin method,BAB 法：先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也到达多层放大效果。亲合素生物素过氧化物酶复合物法avidi
12、n-biotin-peroxidase complex method,ABC 法；此法是前两种方法的改进，即先按肯定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素 生物素过氧化物酶复合物ABC 复合物，标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC 复合物结合，最终形成晶格样构造的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的灵敏度。现有配制现成的ABC 药盒商品供给，操作简便，是目前广泛应用的一种方法。7.1.3 原位杂交法in sithuybridization原位杂交术是一种核酸分子杂交技术，它是通过检测细胞内mRNA 和DNA 序列片段，原位争辩细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达
13、。其根本原理是依据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配对的特点，应用碱基序列并具有标记物的RNA 或 DNA 片段即核酸探针probe，与组织切片或细胞内的待测核酸RNA 或 DNA 片段进展杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观看目的 mRNA 或 DNA 的存在与定位。此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补 DNA 探针(cDNA);应用限制性核酸内切酶消化制成线性 DNA 模板，在体外转录获得反义 RNA 探针(cDNA);依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA 合成仪合成寡聚核苷酸探针。cRNA 和 cDNA 的常用标记物有 3
14、2S、32P、3H 等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是争辩遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与表达；后者是争辩细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA 在胞质内的定位与表达。核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫细胞化学的根底上，进一步从分子水平探讨细胞功能的表达及其调整机制的，已成为当前神经生物学争辩的重要手段。7.2 生理学方法神经生物学争辩中的生理学方法有行为学方法、神经递质释放量的测定等，其中行为学方法最为常用。7.4.2 行为学方法行为学方法是建立在条件反射根底之上。条件反射是有名
15、的俄国生理学家巴甫洛夫于20 世纪初提出的。条件反射是动物个体生活过程中适应环境的变化，在非条件反射根底上渐渐形成的。形成条件反射的根本条件就是无关刺激与非条件刺激在时间上的结合，这个过程称为强化。要形成条件反射除需要屡次强化外，还需要神经系统的正常活动。巴甫洛夫及其学派所争辩的条件反射，称为经典性条件反射。另一种条件反射叫操作性(工具性) 条件反射，美国心理学家斯金纳(BFskinner)把一只饿鼠放入试验箱内，当它偶然踩在杠杆上时， 即喂食以强化这一动作，经屡次重复，鼠即会自动踩杠杆而得食。在此根底上还可以进一步训练动 物只对某一个待定信号，如灯光、铃声消灭后，做出踩杠杆的动作，才给以食物
16、强化，这类必需通 过自己某种活动(操作)才能得到强化所形成的条件反射，称为操作性条件反射或工具性条件反射。操 作性条件反射和经典性条件反射的根本原理是一样的，它们都以强化和神经系统的正常活动为根本 条件，但它们之间也有不同之处。在形成操作性条件反射过程中，动物可以自由地活动，它通过主 动操作来到达肯定的目的；但在形成经典性条件反射时，动物往往被束缚着，是被动地承受刺激。 另外，在操作性条件反射中强化只同反响(操作)有关，并消灭在反响之后；而在经典性条件反射中， 强化是同刺激有关，而且消灭在反响之前。7.4.2 电生理学的方法电生理学的方法包括胞外记录、胞内记录、脑内电刺激、电压钳、膜片钳、脑电
17、图等技术。 电生理学发源于1791年。电流计的制造和应用于电生理学，初步满足了记录生物电活动的变化量小而变化速度快的特点。1922年Erlanger和Gasser用了电子管放大器和阴极射线示线器，才彻底满 足了记录生物电活动的根本特点。从今神经生理学得以迅猛进展。20世纪40年月以来，英国剑桥大 学Hodgkin学派利用微电极技术，而且选用了抱负的试验标本枪乌贼的巨轴突，在修正了Bernstein膜 学说的根底上，建立了动作电位的钠学说，说明白神经冲动的传导理论。约在同一时期，Forbes和Renshaw等运用微电极开头了争辩中枢神经系统神经元活动的工作。Hodgkin等人为准确测量神经活 动
18、中的离子运动，进展了电压钳试验技术。电压钳把单一的跨膜离子流从众多的离子流中分别出来， 通过离子流的测定来分析离子通道开放及关闭的动力学变化。双微电极电压钳技术是把两根尖端小 于0.5 m的玻璃电极插入细胞内分别作为电位记录电极和电流注入电极。电位记录电极引出的膜电位经电压钳仪的前置放大器放大后，输入至电压钳仪的运算放大器的负输入端，而人为把握的指令 电位输入其整输入端，两者的不断进展比较，将差值送入驱动放大电路，两者的任何差异都会被放 大电路放大，并通过电流注入电极将相反方向的电流注入细胞，是膜电位钳制在指令电位水平。此 时，注入细胞的电流值与标本兴奋时的跨膜电流值大小相等，方向相反。在此根
19、底上, Neher又进展了膜片钳技术。它是将尖端直径仅为1 m的玻璃电极吸附到细胞膜外表上，对微电极内施加负压，微电极与细胞膜形成10G 的高阻封接，可记录膜上的pA级的离子通道电流，为从分子水平了解生物膜离子单通道的开、关动力学，通透性和选择性供给了直接手段。 为此Neher获得1991年诺贝尔医学或生理学奖。在电生理技术中脑电图和诱发电位的描记反映了脑细胞群体活动的总和性电位，在临床诊断方面具有重要价值。神经系统的电生理方法，对神经科学的 理论进展起着重要作用。7.3 生物化学的方法经典的生物化学方法包括离心、电泳、层析、质谱等。由于生物化学方法与药理学、免疫学等 其他学科相结合，又进展了
20、放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)、放射受体和免疫印迹等方面。离心法是各种制备、鉴定方法的起始步骤，几乎没有一个试验没有离心法，也几乎没有一个试验仅用离 心法就能完成。各种层析法是用来制备、鉴定和分别物质的主要手段，通常需将几种不同的层析法 交替使用，才能到达预期的结果。由于HPLC和FPLC的使用，使分别的效率和区分率大大提高。RIA 是用来检测生物体内低含量物质如神经介质、激素的重要手段，也是对抗体进展检验的重要手 段。RIA主要用来分析争辩受体的特性，也可用于测定某一受体的配体的含量及分析比较各种配体 的作用强度。免疫印迹法结合了电泳及KIA的优点，是鉴定蛋白质及肽类分
21、子的抱负方法。7.4 分子生物学的方法分子生物学技术同神经生物学结合产生了分子神经生物学，分子生物学技术在神经生物学中的 应用有基因的分子克隆及表达、聚合酶链反响Polymerase Chain Reaction，PCR、遗传连锁分析、反向遗传学等。7.4.2 PCRPCR 是利用耐高温的DNA 聚合酶体外快速扩增DNA 的技术。通过PCR 可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核酸，并具有很高的灵敏度和特异性，可用于微量核酸样品的检测。PCR 技术原理是将欲扩增的DNA 做模板，以和模板正链和负链互补的两种寡聚核苷酸做引物，经过模板DNA 的变性、模板与引物结合复性及在 DNA 聚合
22、酶作用下发生引物链延长反响的三步循环来扩增两引物间的DNA 片段。每一循环的DNA 产物经变性后又成为下一个循环的模板 DNA。这样，目的 DNA 的数量将以 2n 指数形式累积，短时间内的 30 个循环， DNA 量就可到达原来的上百万倍。7.4.2 神经与精神性遗传疾病的基因定位、分别克隆与突变检测基因定位是基于基因的连锁分析和关联分析。在家系中，位于同一染色体上的两个位点致病基因和遗传坐标在减数分裂的过程中会发生交换和重组。重组率越高，两个位点在一起传给后代的时机就越少，反之，越高。通过用掩盖密度适当的遗传图中的遗传坐标在家系中进展连锁分析， 以此找到与某以作标严密连锁的致病基因，从而确
23、定该基因在染色体上的粗略位置。常用的遗传坐标有 RFLP、小卫星坐标、微卫星坐标及单核苷酸多态坐标等。关联分析是在可能的候选致病基因四周选择遗传坐标等位片段多态性，在正常人和病人之间进展比较，得到某一坐标等位片段和引起疾病基因关联的相对危急度。基因的分别与克隆的根本原理是在克隆有人基因组的YAC或 BAC 或 cosmid 等文库中找到对应于基因定位的染色体区域，通过STS 是载有该区域片段的文库按正确方向排列成重叠群。查找到存在这些片段上的基因，再用适宜的限制性内切酶进展切割分别，并克隆到按设计要求的载体上。7.5 影像技术在神经生物学争辩中的应用7.5.1 计算机断层扫描术CTCT 技术的
24、关键是 X 光源，X 光检测器和计算机系统。位于头颅一侧的X 光源发出一束平行的X 光束，X 光束透过头颅后由位于头颅另一侧的X 光检测器接收。X 光源和X 光检测器可围绕头颅作 180 度旋转，在每个旋转角度上都可以得到一组放射密度测量数据。计算机把成千上万的不同位点的放射密度换算成相应的衰减系数，然后依据每一个位点的衰减系数大小用不同的黑白亮度来显 示。CT 可清楚地显示颅骨、脑组织和脑脊液，但不能用于检测大脑的功能。7.5.2 正电子放射计算机断层扫描Positron Emission Tomography，正电子放射计算机断层扫描Positron Emission Tomography
25、，是核医学进展的一项技术，代表了当代最先进的无创伤性高品质影像诊断的技术，是高水平核医学诊断的标志，也是 现代医学必不行少的高技术。 的独特作用是以代谢显像和定量分析为根底，应用组成人体主要元素的短命核素如11、13 、15、18等正电子核素为示踪剂，不仅可快速获得多层面断层影象、三维定量结果以及三维全 身扫描，而且还可以从分子水平动态观看到代谢物或药物在人体内的生理生化变化，用以争辩人体 生理、生化、化学递质、受体乃至基因转变。可以说是同位素放射计算机关心断层 的一种。正电子放射是放射性元素衰变的方式之一。这类核素在自发地从不稳定状态向基态衰变过程中， 从核内释放出与一般电子一样但电荷相反的
26、粒子，即正电子。正电子是一种反物质，从核内放出后 很快于环境中自由电子碰撞湮灭，转化为一对方向相反、能量为511kev 的光子。假设在这对光子飞行方向上对置一对探测器，便可以几乎在同时承受到这两个光子，并可推定光子发源即正电子 放射点在两控头间连线上。通过围绕 360排列的多组配对探头，经探头对间符合线路检验判定每只探头信号时间耦合性，排解其它来源射线的干扰，得到探头对连线上的一维信息，再用滤波反 投射方式，将信号按探头对的空间位置向中心点反投射，便可形成与探头组连线轴平行的断层面正 电子放射示踪剂分布图像。这种探测方式一次只反映一个层面的信息，与 CT 探测方式很接近，有用中常用多层排列的探
27、头对，协作层间符合线路，以利探测并重建更多层面的图像。在临床中，当由正电子放射性核素所标记的示踪剂显像剂注入血流后，到达全身，聚拢在特定的器官或某一部位，通过对应的探头，承受符合线路技术，探测器从 360方向检测不同部位的光子，记录释放出光子的时间、位置数量及方向。显像装置绕人体旋转，多角度采集，信息经计算机贮存，再通过影像重建原理获得人体各部位横断、冠状断面和矢状断面影像。显像仪的构造与线、或根本相像，由探头、数据处理系统、图像显示及检查床组成。大多数PET 使用放射性 2-18 氟-2-D-脱氧葡萄糖作为示踪剂，这种类型的葡萄糖与普 通葡萄糖化学性质相像，可在人体中产生有标记的代谢物，并且
28、在人体中存留时间较长，便于测量。正常脑组织、心肌组织、肾脏及膀胱组织由于高糖代谢的需要因而对摄取较多。其它一些组 织如肝脏、肌肉和肠壁由于其糖代谢水平低，则对的摄取量较少，显示出的活性水平也较低。其它用于 PET 争辩的示踪剂如15OH O 可用来测量局部脑组织、心脏或肾脏的血流量，218F-DOPA、18F-UDR 可用于评价受体的部位、密度及活动水公平。FDG PET 中病人所承受的放射线剂量与CT 根本相像。7.5.3 磁共振成像Magnetic rexonance imaging, MRI磁共振成像从原理的觉察到目前临床各种先进成像技术的应用，是基于科学家们对原子构造的 不断生疏。19
29、24 年Pauli 觉察电子除对原子核绕行外，还可高速自旋，有角动量和磁矩。1946 年美 国哈佛大学的Percell及斯坦福大学的Bloch分别独立地觉察磁共振现象并接收到核子自旋的电信号， 同时将该原理最早用于生物试验，在物理学、化学方面作出了较大的奉献。1952 年荣获诺贝尔物理奖。磁共振成像的设想出自 Damadian。1971 年觉察了组织的良、恶性细胞的 MR 信号有所不同。1972 年P. C. Lauterbur 用共轭摄影法产生一幅试管的MR 图象。1974 年作出第一幅动物的肝脏图象。核子的自旋和磁矩的存在，使其能够在强大的磁场中旋进。Radi 测出不同核子的角动量和磁矩。
30、不同核子在同一磁场中其磁矩和角动量各不一样。同一核子在不同场强的磁场中，其振荡频率也不 一样。磁共振是共振现象的一种，是指原子核在进动中吸取外界能量产生的一种能量跃迁现象。这种跃迁只能消灭在相邻两个能量级之间。所谓外界能量是指一个鼓励电磁场射频磁场，它的磁矢量在某一个平面上旋转，因此，除其旋转频率正好与原子核回转频率一样外，其自旋方向必需和核磁矩一样，原子核才会吸取到能量，这是磁共振现象的必要条件。磁共振成像技术的进展产生了很多成像技术方法，但总的设计思想是如何用磁场值来标记受检体中共振核子的空间位置。发生共振的频率与它所在的位置的磁场强度成正比。假设能使空间各点的磁场值互不一样，各处的共振频
31、率也就不同，把共振吸取强度的频率分布显示出来，实际就是共振核子的分布，即核磁共振自旋密度图象。但不行能使同一时刻的三维空间中各点具有不同的磁场值， 所以需设计突出各特定点信息的方案。要到达此目的，首先可对观测的对象进展空间编码，把争辩对象简化为由nx，ny，nz 个小体积体素的组成，然后承受依次测量每个体素或由体素排列的线或面的信息量，再依据个体素的编码与空间位置的一一对应关系实现图象重建。由于成像的灵敏度、区分率、成像时间和信噪比S/N等要求不同，产生了多种成像方法，归纳起来可分为两大类：一是投影重建法；二是非投影重建法，包括线扫描成像法和直接傅立叶变换fourier transform成像
32、法。Step of stereotaxic surgerya) The stereotaxic instrument is fixed.b) To achieve the flat skull position, the incisor bar was adjusted above interaural zero.according to the instruction of brain maps.c) Mice were anesthetized with sodium pentobarbital (40 mg/kg body weight, i.p.) for stereotaxic su
33、rgery. Compared to a rat, the skull of a mouse is paper thin. The airways run through the centerline directly between the two ears. Thus, it is very easy to strangle a mouse with even lightly applied ear bars. If ear bars are used on a mouse, the surgeon must be very watchful to see that they are in
34、 firmly enough to hold the head stable, and that the animal continues to be able to breath through the entire procedure. To avoid this, most researchers working on mice use a nose only holder, and not ear bars. This, however, introduces serious instability, particularly if the surgery is back toward
35、 the brainstem, asthe leverage to move increases the further back the work is being done. Instability means reduced accuracy, and more animals needed. An alternative is the Cunningham head holder for mice (or neonatal rats, where a similar situation applies) that employs light, small plastic earbars
36、 that allow the surgeon to feel the pressure of application better than with the heavy stainless steel ear bars commonly used. These allow ear bars to be used successfully on adult mice.d) Stainless-steel guide cannulas are implanted into nucleus according to brain maps. Guide cannulas were fixed to
37、 the skull with three screws and dental cement.NotesEarbar zero vs. BregmaEar bar zero is the point atwhich the ear bars meet inthe center of the stereotaxic instrument when no animal is installed. Bregma is a naturally occurring point on the skull where four skull plates meet in development. Bregma
38、 is where an AP and an anterior ML suture line cross. Its positionrelative to brain landmarks has been shown to be quite constant in the rat. Lamda is a similar point located more caudally over brainstem, where a second ML suture line crosses the midline suture. An atlas of stereotaxic coordinates m
39、ust employ an agreed-upon reference frame. Early atlases used ear bar zero, and the tooth bar 5 mm below the ear center, as the zero reference point and plane. It was noticed that this tilted older rats heads less than younger rats, and that most of the brain was far away from the zero point where t
40、he ear bars met. A few published studies found greater accuracy using bregma and skull flat (bregma and lamda at the same vertical coordinate) as the frame of reference, and the bregma/skull flat reference coordinate system is used in virtually all stereotaxic atlases available today. ( the users gu
41、ide of myneurolab )6. 思考题4.1 什么是神经核团，请列举几个神经核团。4.2 如何提高定位的准确性？7. 参考书徐叔云 等，药理试验方法学，人民卫生出版社包民 等，大鼠脑立体定位图谱，人民卫生出版社徐科 等，神经生物学纲要，科学出版社 mbl.org，关于小鼠脑图谱的网站 brainmapping.org，关于人脑图谱的网站试验二 显微冷冻切片机Microtome Cryostat的使用和大小鼠脑组织切片操作How to operate a microtome cryostat and cut the brain section1. 试验目的：把握显微冷冻切片机的使用，
42、区分重要核团SON，PVN，海马，PVN。了解大，小鼠脑立体定位图谱。2. 试验器械和材料：大、小鼠大脑，手术器械，显微冷冻切片机，包埋剂胶水代替，大、小鼠立体图谱。3. 试验步骤：3.1. 安装刀具，移上安全杆。调整切片机温度到-20(右手边 up 和 down 二个按钮调整, up 调高温度, down,降低温度)。3.2. 从-80冰箱取出脑组织在切片机或-20冰箱中放 1 小时左右，目的为了平衡组织温度，太冷会在切片时消灭脑片裂开的状况。3.3. 用包埋剂胶水代替把组织固定在载物盘上Blocker，留意肯定要把脑放正。3.4. 后退样品固定器(specimen holder),固定载物
43、盘，并适当调整摇杆, 使的上下左右都正。3.5. 翻开安全杆，.前进载物盘，到适当位置不要离的太近，以免不留神损坏刀，也不要离的太远。3.6. 调整刀距切片厚度，section thickness and trim thickness，摇动把手handwheel，开头切片 sectioning 。开 始的时候可以选择大一点的刀距 trim thickness, 10-500um，到肯定位置时使用调到需要的最终切片厚度(section thickness, 1-20um)。3.7. 到适当时候，贴几张脑片以确定上下左右是否正，并比照图谱找出或许位置。留意： 贴片时手放在载玻片的两头，一端靠在切片
44、机刀尾的位置轻轻往下压。3.8. 比照图谱找到所要找到的核团并各留具有SON，PVN，海马CA1，CA2，CA3 的典型脑片，并作上标记。*PVN 确实定：确定 SON 后，依据图谱算出所剩刀数，切去几刀后，贴片，用伊文斯蓝染色一分钟左右，倒去染液，放在显微镜下观看，开头消灭 PVN 时呈芽状，然后芽变大, 并向上向外扩, 成伞状。3.9. 把脑片保存到-20或-80冰箱，以待以后使用。3.10. 清洁切片机，复原。留意：切片机格外昂贵，请好好疼惜，并且全部操作严格依据示范来，并在有教师的状况下操作。4. 试验总结：确定SON，PVN 和海马, 描绘PVN 外形。5. 问题：在切片过程中，视束
45、有什么变化？ 并画出消灭 SON，PVN 和海马时视束的外形。6. 参考文献：1. Joachim, F.R. Knig and Dipl. Biol. Renate A. Klippel. The rat brain: A stereotaxic atlas of the forebrain and lower parts of the brain stem. The Williams and Wilkins company Baltimore, 1963.2. Paxinos, G., Watson, C., 1986. The Rat Brain in Stereotaxic Coord
46、inates. Orlando: Academic Press.3. Sidman, R. L. Angevine J. B. Jr. Pierce, E.T. Atlas of the mouse brain and spinal cord. Harvard Univ. Press,1971.4. 包民，舒斯云 大鼠脑立体定位图谱 人民卫生出版社。显微切片机把握面板2.调整 section thickness, 右:增大, 左:减小3.调整 thim thickness, 右:增大,左:减小4,5.指示灯:何处亮表示选择何处6,7.前进,后退载物盘8. 切换 section thicknes
47、s 和 thim thickness9. 选择(select) : 计数(count),总数(sum) 或者 travel 10.显示屏: 显示计数(count),总数(sum) 或者 travel 11.重置(reset) : 重设置,使计数从 0 开头up 和down: 调整切片机温度 ABA. Bregma: -0.94mm， Interaural: 3.10mm 示 PVNB. Bregma: -1.28mm， Interaural: 2.52mm 示海马Operating Instruction:1. Set up the cryostat and cool of microtome chamber to -20.2. Take the brain out of the -80 and leave it at -20 for 1 h. to balance the temperature.3. Fix the brain on the Blocker