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1、乙肝表面抗原的乙肝表面抗原的ELISA法法定量分析方法学验证定量分析方法学验证 课程要求课程要求掌握：掌握：乙肝表面抗原的乙肝表面抗原的ELISA法定量检测方法；法定量检测方法；ELISA法方法学评价的方法。法方法学评价的方法。熟悉：熟悉：定量检测的酶标仪操作要领；定量检测的酶标仪操作要领；各种缓冲液的配制。各种缓冲液的配制。了解：了解：ELISA检测中的影响因素和注意事项。检测中的影响因素和注意事项。试验目的 n n进行乙肝表面抗原进行乙肝表面抗原ELISA法定量分析的方法法定量分析的方法学验证。学验证。试验材料试验材料 1 1 试剂盒试剂盒试剂盒试剂盒n n乙肝表面抗原乙肝表面抗原ELIS
2、AELISA法定量分析试剂盒，福州蓝法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。图生物工程有限公司出品。2 2 仪器及酶标板仪器及酶标板仪器及酶标板仪器及酶标板n n酶标仪：酶标仪：Bio-Rad 680 Bio-Rad 680；n n洗板机：洗板机：Bio-Rad 1575Bio-Rad 1575；n n超纯水系统：超纯水系统：Millipore Elix Millipore Elix；n n电热恒温培养箱电热恒温培养箱(DNP-9052):(DNP-9052):上海精宏实验设备有上海精宏实验设备有限公司。限公司。3 溶液配制溶液配制n n0.01M pH7.4的的PBS缓冲液：缓冲液：
3、称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。n n质控品：质控品：用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml三个质控品，每质控品1ml。试验方法试验方法 1 标准曲线各浓度的配制标准曲线各浓度的配制n n用用PBS缓冲液将标准品配制成缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625ng/ml。2 测定方法测定方法 设计标准品、质控品及空白分配方案；设计标准品、质控品及空白分配方案；取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，按取出
4、试剂盒中已包被酶标板，取出板条，按需要重新配制；需要重新配制；在相应孔中加入系列标准品、质控品及空白在相应孔中加入系列标准品、质控品及空白对照，每孔对照，每孔50ul；37温育温育30min，洗板，洗板4次；次；加入酶标抗体，生物素二抗，加入酶标抗体，生物素二抗，50 ul/孔；孔；37温育温育30min，洗板，洗板4次；次；加入加入A、B液液,50 ul/孔，孔，37温育温育15分钟。分钟。加入终止液，加入终止液，50 ul/孔。孔。3 标准曲线制作及结果计算标准曲线制作及结果计算n n酶标板放入酶标仪，盖上盖子；n n在电脑上打开Microplate Manager 5.2软件n n选择4
5、50nm波长（参照波长630nm），设置LAYOUT和报告模式，测定各孔吸收值；n n输入标准品各浓度值，以双对数法制备标准曲线，获取各孔的浓度值，打印标准曲线图和计算结果。ELISA法标准曲线示意图法标准曲线示意图4 准确度（回收率）计算准确度（回收率）计算 n n按示例表按示例表1样式列表并计算回收率。样式列表并计算回收率。VEGFR2-FcVEGFR2-FcVEGFR2-FcVEGFR2-Fc(ng/ml)(ng/ml)(ng/ml)(ng/ml)测测测测定定定定值值值值(ng/ml)(ng/ml)(ng/ml)(ng/ml)回收率回收率回收率回收率(%)(%)(%)(%)平均回收率平均
6、回收率平均回收率平均回收率RRRR(%)(%)(%)(%)SD(%)SD(%)SD(%)SD(%)2020202021.76521.765108.825108.825103.159103.159103.159103.1599.159.159.159.1517.78917.78988.94588.94520.30120.301101.505101.50522.61222.612113.06113.0620.69220.692103.46103.461010101011.27911.279112.79112.79116.092116.092116.092116.0923.823.823.823.8
7、211.14811.148111.48111.4811.73911.739117.39117.3911.82811.828118.28118.2812.05212.052120.52120.525 5 5 56.4676.467129.34129.34102.528102.528102.528102.528 15.88 15.88 15.88 15.884.6954.69593.993.94.4194.41988.3888.385.1235.123102.46102.464.9284.92898.5698.565 按示例表列表并计算精密度。板内精密度板内精密度VEGFR2-FcVEGFR2-F
8、cVEGFR2-FcVEGFR2-Fc（ng/mlng/mlng/mlng/ml）测测测测定定定定值值值值RSD(%)RSD(%)RSD(%)RSD(%)1 1 1 12 2 2 23 3 3 34 4 4 45 5 5 52020202021.76521.76521.76521.76517.78917.78917.78917.78920.30120.30120.30120.30122.61322.61322.61322.61320.69220.69220.69220.69220.63220.6321.831.838.878.871010101011.27911.27911.27911.279
9、11.14811.14811.14811.14811.73911.73911.73911.73911.82811.82811.82811.82812.05212.05212.05212.05211.60911.6090.380.383.273.275 5 5 56.4676.4676.4676.4674.6954.6954.6954.6954.4194.4194.4194.4195.1235.1235.1235.1234.9284.9284.9284.9285.1265.1260.790.7915.4115.41板间精密度板间精密度VEGFR2VEGFR2VEGFR2VEGFR2-Fc-Fc-
10、Fc-Fc（ng/mlng/mlng/mlng/ml）测测测测定定定定值值值值RSD(%)RSD(%)RSD(%)RSD(%)2020202021.76421.76421.76421.76419.26219.26219.26219.26221.51921.51921.51921.5197.7897.7897.7897.78914.76014.76014.76014.76015.63015.63015.63015.63020.30120.30120.30120.30116.95516.95516.95516.95517.86217.86217.86217.86222.61222.61222.61
11、222.61219.64319.64319.64319.64322.16022.16022.16022.16020.69220.69220.69220.69218.14418.14418.14418.14420.43920.43920.43920.43919.30219.30219.30219.3022.392.392.392.3912.3812.3812.3812.381010101011.27811.27811.27811.27810.09010.09010.09010.09012.17312.17312.17312.17311.14811.14811.14811.1489.9289.92
12、89.9289.92811.86911.86911.86911.86911.73911.73911.73911.73910.45910.45910.45910.45912.55812.55812.55812.55811.82811.82811.82811.82810.47910.47910.47910.47912.45512.45512.45512.45512.05212.05212.05212.05210.70910.70910.70910.70912.58412.58412.58412.58411.42311.42311.42311.4230.910.910.910.917.977.977
13、.977.975 5 5 56.4766.4766.4766.4765.6885.6885.6885.6886.7346.7346.7346.7344.6954.6954.6954.6954.0634.0634.0634.0634.7864.7864.7864.7864.4174.4174.4174.4173.7883.7883.7883.7884.4934.4934.4934.4935.1235.1235.1235.1234.4634.4634.4634.4635.3245.3245.3245.3244.9284.9284.9284.9284.2734.2734.2734.2735.1355
14、.1355.1355.1354.9594.9594.9594.9590.830.830.830.8316.73716.73716.73716.7376 检测限检测限（LOD）计算：n n取空白孔的取空白孔的OD值的均数加值的均数加2倍标准差。倍标准差。注意事项注意事项n n标准品和质控品配制要准确。标准品和质控品配制要准确。n n实验各个环节都很重要，每步操作都要认实验各个环节都很重要，每步操作都要认真。真。讨讨 论论1.实验背景介绍（目的、采用的方法、检测原理、方法学验证的基本知识介绍）2.本实验的设计及实施特点3.实验结果分析4.临床应用及分析本实验报告要求本实验报告要求n n按科研论文格式n n有摘要和关键词n n字数不限n n以WORD形式打印，元月18日前集体上交。