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1、药品微生物检验特点及过程限制药品微生物检验特点及过程限制l药品因素l环境影响l培育视察l抽样检查l破坏试验方法验证过程限制1 1中国药品生物制品检定所无菌无菌/微生物限度检查理念微生物限度检查理念环境保证环境保证培养基保证培养基保证无菌性检查无菌性检查灵敏度检查灵敏度检查有效的方法有效的方法方法验证方法验证SOP操作操作有效的结果有效的结果可靠的结论可靠的结论结果判断结果判断2 2中国药品生物制品检定所微生物检查的过程限制微生物检查的过程限制l一、试验设施（硬件物质保障）l二、检验程序（软件有效的结果）l三、结果推断（调查牢靠的结论）3 3中国药品生物制品检定所一、试验设施l试验室系统l操作环
2、境l关键设备l比照培育基物质保障4 4中国药品生物制品检定所（一）、试验室系统（一）、试验室系统干净试验条件干净试验条件有效性：整体有效性：整体1000010000级、局部级、局部100100级。级。平安性：爱护样品、人员和环境。平安性：爱护样品、人员和环境。可操作性：便利、快捷、顺畅。可操作性：便利、快捷、顺畅。干净试验条件的维护、验证干净试验条件的维护、验证阳性菌试验室达到阳性菌试验室达到P2P2生物平安标准生物平安标准5 5中国药品生物制品检定所试验室改造示例：原布局图拟定布局图建议布局图1建议布局图2试验室系统中检所微生物试验室6 6中国药品生物制品检定所（一）、试验室系统试验室系统的
3、管理与维护：1、屏障系统的有效性压差、风速、微粒、照度（外包服务合同）2、清洁、静态与动态监控、熏蒸3、环境菌库酒精棉球分别微生物新洁尔灭分别微生物7 7中国药品生物制品检定所环境菌库干净环境常见菌（浮游菌）：头状葡萄球菌（Staphylococcuscapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）缓症链球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）藤黄微球菌（Micrococcusluteus）8 8中国药品生物制品检定所（二）、操作环境l1、隔离器l2、生物平安柜l3、超净工作台9 9中国药品生物制品
4、检定所（二）、操作环境1010中国药品生物制品检定所搽拭菌液稀释、分液的误差为：5.5%表面搽拭操作的回收率大于 99%1111中国药品生物制品检定所（三）、关键设备 微生物检查薄膜过滤仪微生物检查薄膜过滤仪 一次性薄膜过滤培育器一次性薄膜过滤培育器应急检验用一次性薄膜过滤培育器应急检验用一次性薄膜过滤培育器1212中国药品生物制品检定所（四）、比照培育基培育基适用性（灵敏度）；培育基性能稳定性（标准化）。比照培育基理化评价（可控性）生物学评价（有效性）回收率比较MPN比较生长曲线比较生态评价某些CRS原则固态培育基液态培育基琼脂加减法1313中国药品生物制品检定所二、检验程序环境保证环境保证
5、培养基保证培养基保证无菌性检查无菌性检查灵敏度检查灵敏度检查有效的方法有效的方法方法验证方法验证SOP操作操作有效的结果有效的结果可靠的结论可靠的结论结果判断结果判断1414中国药品生物制品检定所二、检验程序l接受任务l试验方案l试验准备l样品核对l试验操作l过程监控l培育视察有效的结果物质保障1515中国药品生物制品检定所试验室管理规范（软件）试验室管理规范（软件）中检所抗生素室微生物试验室质量管理体系中检所抗生素室微生物试验室质量管理体系编写说明及批准页编写说明及批准页1 试验室概况试验室概况1.1 试验室简介试验室简介 1.2 试验室通讯资料试验室通讯资料 1.3 试验室认可项目试验室认
6、可项目/参数表参数表1.4 试验室平面图及功能区域试验室平面图及功能区域 1.5 仪器设备总览仪器设备总览1.6 常备试剂耗材一览表常备试剂耗材一览表1.7 试验室发展目标试验室发展目标2 管理规范管理规范2.1 平安管理平安管理2.2 业务流程业务流程2.3 人员管理（人员管理（6个个SOP）2.4 样品管理（样品管理（3个个SOP）3 标准操作规程标准操作规程3.1 检验工作检验工作SOP（13个）个）3.2 仪器操作仪器操作SOP（30个）个）3.3 试验记录试验记录SOP（9个）个）4 试验室保障试验室保障4.1 试验室设施、设备及消耗品供应商确定原则试验室设施、设备及消耗品供应商确定
7、原则4.2 试验室设施服务商试验室设施服务商4.3 试验设备供应商试验设备供应商4.4 试验室消耗品供应商试验室消耗品供应商1616中国药品生物制品检定所（一）、试验准备l试验准备应坚持“平战结合”，物质准备有备无患，应随时保证“来之能战”。l尤其留意常备有效期要求的物品：培育基、冲洗液、滤器、小型试验器材等。1717中国药品生物制品检定所试验准备无菌室专用酒精棉球制备试验准备场地清洁试验准备台面清洁1818中国药品生物制品检定所（二）、样品核对l尽快取得样品，确保样品传递过程中的完整性、平安性、有效性；l细致核对样品及样品资料，高度关注媒体公布样品（问题样品），同时尽量获得非问题样品及同类样
8、品，进行比较试验、比较分析；l样品外观检查、完整性检查。1919中国药品生物制品检定所样品外观检查欣弗样品外观检查刺五加样品外观检查双黄连样品完整性真空检漏2020中国药品生物制品检定所（三）、试验操作l不断完善标准化操作规程（SOP），严格避开试验室污染。实验人员实验人员 培养基培养基实验器材实验器材实验环境实验环境检验结果检验结果待检样品待检样品原料原料 辅料辅料 设备设备环境环境药品（食品）药品（食品）人员人员 药品食品生产过程中可能污染微生物的主要环节药品食品微生物检查过程中可能污染微生物的主要环节2121中国药品生物制品检定所试验操作物料进场消毒液搽拭物品外表面干净传递（风淋、紫外照
9、射）双层无菌包装核心区外围试验操作人员进场一更二更核心操作区试验操作无菌操作技术2222中国药品生物制品检定所（四）、试验过程监控样品监控手指监控沉降菌监控无菌检验框架示意图无菌检验框架示意图2323中国药品生物制品检定所三、结果推断l长菌与否l分别鉴定l溯源调查l结果报告牢靠的结论有效的结果物质保障2424中国药品生物制品检定所三、结果推断 是不是微生物？是什么微生物？微生物来自哪里？几点思索 参见：FTIR法用于药品检出菌与药品微生物检验干净室环境菌的相像性考 察药学学报，2007，42（11）：11891194 推断无菌检查阳性结果有效性的试验探讨药物分析杂志，2008，28（05）：6
10、671 2525中国药品生物制品检定所1、长菌与否？l浑不浑浊?l物理变更、化学变更还是生物变更？一靠阅历二靠试验三靠严格程序限制避开干扰2626中国药品生物制品检定所是不是微生物？（1）、液体培育基浑浊 物理变更？化学变更？生物学变更？（2）、平板上的菌落 琼脂表面、琼脂中、琼脂和平皿夹层 菌落or药渣？2727中国药品生物制品检定所菌落or药渣？l经经60Co60Co射线大剂量照射再检验射线大剂量照射再检验l延长培育时间到延长培育时间到7 7天天l重新划线培育重新划线培育l镜检镜检2828中国药品生物制品检定所2、分别鉴定l（1）马上转接2ml该培育物至相同的培育基中接着培育；l（2）取5
11、支冻存管，每管分装1ml浑浊培育物，-80保存；l（3）取浑浊培育物在TSA平板/血琼脂上划线，分别污染微生物；l（4）假如发觉硫乙醇酸盐流体培育管变浑浊，还应增加血平板划线，并在厌氧条件下培育分别厌氧菌。由平板分别到的菌落应进一步鉴定，并逐一保藏。2929中国药品生物制品检定所是什么微生物？宏观：生长形态微观：镜检鉴定：生化鉴定（API、BD）核酸鉴定（16sRNA、DNA）3030中国药品生物制品检定所3、溯源调查l样品阳性培育物分别菌株l检验过程监控菌株l环境菌（近期、远期）l现场调查收集菌株鉴定与相像性分析相结合传统方法与新技术相结合不同方法的交叉验证3131中国药品生物制品检定所微生
12、物来自哪里？相像性分析 同源性分析 脉冲场电泳（PFGE）、傅立叶红外（FTIR）3232中国药品生物制品检定所SamplePreparationAutomated measurement after drying of the samples!2.Suspending1.Harvesting3.LoadingFT-IRSpektrumofmicroorganisms图图 不同来源的阴沟肠杆菌红外图谱聚类关系不同来源的阴沟肠杆菌红外图谱聚类关系3333中国药品生物制品检定所TheInfraredSpectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercellw
13、allcapsulesDNA,RNAflagellates,piliribosomevacuoles.FT-IR spectrum is a fingerprint of the cellsBiochemicalStructureofCells3434中国药品生物制品检定所3535中国药品生物制品检定所溯源性分析例溯源性分析例11欣弗事务欣弗事务 图图29 欣弗培育物欣弗培育物图30 欣弗培育物分别菌株镜检3636中国药品生物制品检定所3737中国药品生物制品检定所溯源性分析例溯源性分析例11欣弗事务欣弗事务 头状葡萄球菌头状亚种头状葡萄球菌头状亚种（Staphylococcuscapitis
14、sspcapitis）溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）缓症链球菌缓症链球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌科氏亚种科氏葡萄球菌科氏亚种（Staphylococcuscohniisspcohnii）藤黄微球菌藤黄微球菌（Micrococcusluteus）溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）。监测到的环境菌株监测到的环境菌株3838中国药品生物制品检定所溯源性分析例溯源性分析例2 2 双黄连注射液双黄连注射液 利巴韦林注射液利巴韦林注射液 FTIR FTIR相像性分析相像性分析 DuP
15、ont RiboPrinter DuPont RiboPrinter基因指纹分析基因指纹分析3939中国药品生物制品检定所几点思索（1）、怎样才算是同一株菌？须要深化相识微生物本身 微生物变异与保守的相对性；分析方法的可变性与微生物本身的可变性；生物学先锋琳恩马古利斯(Lynn Margulis)曾表示：“假如将一个特殊的质粒植入大肠杆菌，大肠杆菌便会突然间变成克雷伯氏杆菌”。4040中国药品生物制品检定所几点思索（2）、什么是最适宜的技术？须要深化相识分析微生物的技术和手段 形态学分析与相像性分析（生化反应谱、片段相像性、FTIR光谱相像性等），在权衡方法本身的边界和微生物变异性边界的基础上
16、，似乎更适合对亲缘关系下一个否定的结论，即解除法，在这个意义上是否可以引入化学分析的3概念、精密度概念？4141中国药品生物制品检定所4、几点思索（2）、什么是最适宜的技术？16sRNA cDNA序列，须要探讨，太保守不利于区分；变异率太高（高到一般传代、培育难以限制）则没有意义。但一般来说16sRNA cDNA序列水平具有确定意义，困难在于确定足够长。溯源分析不仅仅是鉴定到种，而是到株，对菌株的稳定性相识？与之相关的技术粗放性问题。4242中国药品生物制品检定所4、几点思索（3）、怎样下结论？分析的根本目的是要下一个结论 以检验活动为中心、以检验过程为线索、以实 验事实为依据，依据全部信息的
17、综合分析实力。对阳性检出菌的技术分析最终要回到检验活动本身，技术分析结论 4343中国药品生物制品检定所4、结果报告l综合分析l慎下不合格结论l不放过任何一个阳性信息4444中国药品生物制品检定所无菌无菌/微生物限度检查理念微生物限度检查理念环境保证环境保证培养基保证培养基保证无菌性检查无菌性检查灵敏度检查灵敏度检查有效的方法有效的方法方法验证方法验证SOPSOP操作操作有效的结果有效的结果可靠的结论可靠的结论结果判断结果判断4545中国药品生物制品检定所l试验操作的标准化l验证试验的系统化l制定标准的严谨化l完备的试验室保障系统l最终目标：一次检验即可得到精确结果。4646中国药品生物制品检定所精品课件精品课件！47精品课件精品课件！48l感谢大家！4949中国药品生物制品检定所