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1、线粒体膜通透性转换在铅致细胞凋亡中的作用刘刚，罗通旺，刘宗平*,王林*扬州大学 兽医学院 临床兽医学 内科实验室江苏省临床兽医学重点学科(;*责任作者：*责任作者：摘要：【目的】研究线粒体膜通透性转换(MPT)及其组成蛋白在铅(Pb)诱导原代大鼠 肾小管上皮细胞(rPTcells)凋亡过程中的作用机制。【材料与方法】取80-120g SD大鼠， 无菌条件剖取肾脏，去被摸，PBS洗涤，采用筛网研磨法结合酶消化法建立原代大鼠仔小管 上皮细胞模型，在传一代细胞对数生长期进行Pb处理12h。实验分组：对照组、0.25pM Pb 组、0.5W Pb组和l.OjiM Pb组。Pb处理12h后，利用倒置相差
2、显微镜观察细胞形态学变化: 利用激光共聚焦显微镜结合钙黄绿素淬灭法检测线粒体膜通透性转换孔(MPTP)开放情况: 透射电子显微镜(TEM)观察Pb处理后线粒体形态学改变并通过western blot技术检测线 粒体凋亡途径关键蛋白如细胞色素C (CytC)和cleaved caspase-3表达变化，同时检测线粒 体膜通透性转换孔组成蛋白Cyp-D、VDAC和ANT表达变化；添加CsA (Cyp-D抑制剂)、 DIDS (VDAC抑制剂)和BA( ANT抑制剂)后分别检测cleaved caspase-3表达变化、细胞 核形态学变化和细胞凋亡率变化。【结果】随铅处理浓度升高细胞变圆、皱缩和破碎
3、增多， MPTP开放依次下降至81.2%. 48.6%和33.9% (P 0.01),线粒体膜破裂和脊溶解现象加剧， niito-CytC 表达水平依次卜降至 65.3%、41.2%和 20.6% (P 0.01), cleaved caspasc-3 表达 水平依次升高至165.3%、251.6%和379.8% (P0.01 添加CsA、DIDS和BA后显著抑 制MPTP开放(P0.01),其中CsA抑制效果最强而DIDS效果次之。Pb与CsA共处理后， cleaved caspase-3 表达水平下降 95.6% (P0.01), FCM 及 Hoechst 33258 染色结果显示凋 亡
4、率分别下降16.7%和13.2% (P 0.01), western blot检测发现随Pb剂量升高Cyp-D表达 水平分别下降至68.1%、22.4%和18.3%。添力口 DIDS后，cleaved caspase-3表达水平从293.1% 下降至124.6% (P0.01), FCM及Hoechst 33258染色结果显示凋亡率分别下降11.5%和 10.2%,发现随Pb剂量升高VDAC-1表达水平显著增加，VDAC-2表达水平显著下降，而 VDAC-3 无明显变化c Pb 处理后，ATP 水平从 I0.9nmol ATP/mg prot 下降至 4.4nmol ATP/mg proi (
5、P0.0l), ADP/ATP比值显著升高(P0.0l)。添加BA组ATP水平显著恢复，而ADP/ATP比值显著下降(P 0.01 )oBA与Pb共处理后，cleaved caspase-3表达水平从246.3% 下降至144.2%(尸0.01),凋亡率分别下降10.4%和8.7%oANT-l表达水平依次增加至115% (P0.05)、204.7% 和 315.3% (P0.01),而 ANT-2 依次下降至 58.4%、46.8% 和 27.1% (P 0.01)。【结论】丁参与Pb诱导的大鼠肾小管.上皮细胞凋亡过程,MPTP组成蛋白Cyp-D、 VDAC-2和ANT-2发挥抑制凋亡作用，VDAC-1与ANT-1促进细胞凋亡的发生，而VDAC-3 无显著作用。关键词：铅，线粒体，凋亡，线粒体膜通透性转换