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1、第三章第三章 愈伤组织培育愈伤组织培育宜职院宜职院08.9 目的与要求目的与要求 了解胚状体概念，学习愈伤组织的离了解胚状体概念，学习愈伤组织的离体培育方式，驾驭愈伤组织继代培育的培体培育方式，驾驭愈伤组织继代培育的培育基和培育条件，了解继代培育物的分化，育基和培育条件，了解继代培育物的分化，驾驭愈伤组织培育的应用。驾驭愈伤组织培育的应用。具有胚状体概念、懂得愈伤组织诱导分具有胚状体概念、懂得愈伤组织诱导分化的阶段特点。具有愈伤组织的形态发生化的阶段特点。具有愈伤组织的形态发生规律知能。规律知能。第一节第一节 愈伤组织的培育愈伤组织的培育 愈伤组织培育是指将母体植株上的愈伤组织培育是指将母体植
2、株上的各个部分切下，形成外植体，接种到无各个部分切下，形成外植体，接种到无菌的培育基上，进行愈伤组织诱导、生菌的培育基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。长和发育的一门技术。一般状况下，植物组织均能诱发形成一般状况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织，由外植体形成愈伤组织，标愈伤组织，由外植体形成愈伤组织，标记着植物离体培育的起先。记着植物离体培育的起先。一、愈伤组织的诱导一、愈伤组织的诱导（一）诱导原理（一）诱导原理1 1、细胞全能性、细胞全能性 植物每一细胞具有全套遗传信息，在特植物每一细胞具有全套遗传信息，在特定环境下能进行表达，而产生一个独立完定环境下能进行表达，而产生一个独立完整
3、的个体。整的个体。只要有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使已经是只要有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使已经是高度分化的植物细胞，也还保持复原到分生状态的实力。其复原实高度分化的植物细胞，也还保持复原到分生状态的实力。其复原实力取决于该细胞原来所处的部位和生理状态。力取决于该细胞原来所处的部位和生理状态。2 2、脱分化现象、脱分化现象 一个已经停止分裂的成熟细胞转变为分一个已经停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象。生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象。植物离体培育中的脱分化过程植物离体培育中的脱分化过程:植物离体植物离体培育利用特定的条件，促进细胞脱分化，
4、使培育利用特定的条件，促进细胞脱分化，使原已分化并具有确定功能的细胞脱离原轨道，原已分化并具有确定功能的细胞脱离原轨道，失去其原有状态和功能，而复原到未分化的失去其原有状态和功能，而复原到未分化的愈伤组织状态。愈伤组织状态。3 3、诱导程度、诱导程度双子叶植物比单子叶植物简洁双子叶植物比单子叶植物简洁幼年细胞组织比成年细胞组织简洁幼年细胞组织比成年细胞组织简洁二倍体细胞比单倍体细胞简洁二倍体细胞比单倍体细胞简洁 （二）诱导方法（二）诱导方法1 1、依据不同的培育目的，获得不同的外植、依据不同的培育目的，获得不同的外植体。体。植株茎的切段、叶、根、花和种子，或某植株茎的切段、叶、根、花和种子，或
5、某些组织切成片或块状，均可接种到培育基上。些组织切成片或块状，均可接种到培育基上。接种时需考虑材料的一样性，来源、产地、接种时需考虑材料的一样性，来源、产地、大小、形态、生理部位。常选组织块较大的材大小、形态、生理部位。常选组织块较大的材料。料。获得外植体材料消毒处理修整除去获得外植体材料消毒处理修整除去坏死组织切成坏死组织切成5mm的圆柱形或方形小块的圆柱形或方形小块直放或倒放到培育基上每直放或倒放到培育基上每9cm培育基接培育基接种种56块外植体培育。块外植体培育。2、操作程序、操作程序 选用较大组织做材料时，可用打孔器从块茎和块根中钻取一批圆柱型组织，切成相同厚度的小圆片进行培育。接受圆
6、形的缘由：接受圆形的缘由：能得到外形简洁结构相同的材料能得到外形简洁结构相同的材料 圆形的表面积大圆形的表面积大 圆柱形的外植体有利于组织块与外界进圆柱形的外植体有利于组织块与外界进行物质和气体交换；也使外植体表面促进愈行物质和气体交换；也使外植体表面促进愈伤组织形成的分泌物较多，诱导率增高。伤组织形成的分泌物较多，诱导率增高。培育基培育基 MS培育基培育基 激素激素 IAA、NAA、2,4-D、BA 椰子汁、番茄汁、酵母提取物。椰子汁、番茄汁、酵母提取物。二、愈伤组织细胞的分化二、愈伤组织细胞的分化 单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤组织，大致经验三个时期，
7、这三个时期中细组织，大致经验三个时期，这三个时期中细胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别。胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别。（一）诱导期（一）诱导期 诱导期是细胞正在准备分裂的时期。诱导期是细胞正在准备分裂的时期。1 1、诱导期特征、诱导期特征 细胞质增加，出现活跃的原生质流淌，细胞质增加，出现活跃的原生质流淌，贮藏物质淀粉等消逝；随着组织的活化，细胞贮藏物质淀粉等消逝；随着组织的活化，细胞内核糖体增加并形成大量多聚核糖体；内核糖体增加并形成大量多聚核糖体；RNARNA快快速合成和累积；但细胞大小无多大变更。速合成和累积；但细胞大小无多大变更。诱导期诱导期2 2、影响愈伤组织诱导的因素
8、、影响愈伤组织诱导的因素 植物种类、生理状况、外部因素不同，植物种类、生理状况、外部因素不同，诱导期不同。诱导期不同。弱光下植株比强光下的植株外植体易于弱光下植株比强光下的植株外植体易于诱导分裂诱导分裂 二氧化碳抑制诱导分化二氧化碳抑制诱导分化 生长调整剂诱导细胞起先分裂生长调整剂诱导细胞起先分裂 损伤剌激能加速脱分化进行，有时还是损伤剌激能加速脱分化进行，有时还是某些材料能否脱分化的确定条件。某些材料能否脱分化的确定条件。离体培育后细胞变更：离体培育后细胞变更：气体交换快速增加；气体交换快速增加；RNA RNA出现；出现；蛋白质发生周期性变更；蛋白质发生周期性变更；酶水平变更。酶水平变更。（
9、二）分裂期（二）分裂期 分裂期是指细胞脱分化，细胞通过分裂期是指细胞脱分化，细胞通过分裂不断增生子细胞而形成愈伤组织的分裂不断增生子细胞而形成愈伤组织的过程。过程。植物分裂期脱分化规律：植物分裂期脱分化规律：胡萝卜等脱分化较禾谷类简洁胡萝卜等脱分化较禾谷类简洁 茎叶较花器脱分化茎叶较花器脱分化 幼嫩茎组织比老组织较简洁幼嫩茎组织比老组织较简洁分裂期分裂期2 2、分裂期愈伤组织特征：、分裂期愈伤组织特征：细胞数目增加、体积变小、核和核细胞数目增加、体积变小、核和核仁变大、仁变大、RNARNA含量持续上升。从培育外植含量持续上升。从培育外植体的形态变更来看，表现为外层细胞快速体的形态变更来看，表现
10、为外层细胞快速分裂。当细胞体积最小，细胞核和核仁最分裂。当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，大，RNARNA含量最高时，标记着细胞处于分含量最高时，标记着细胞处于分裂高峰时期。裂高峰时期。魔芋愈伤组织（分裂期）魔芋愈伤组织（分裂期）分化期主要变更为分化期主要变更为 1 1、细胞分裂部位和方向发生变更、细胞分裂部位和方向发生变更 2 2、分生组织瘤状结构和维管组织形成、分生组织瘤状结构和维管组织形成 3 3、细胞体积不再减小、细胞体积不再减小 4 4、出现各种类型细胞、出现各种类型细胞 5 5、颜色变更、颜色变更愈伤组织分化期愈伤组织分化期其次节其次节 愈伤组织的继代培育愈伤组织的继代培育一、培育
11、基和培育条件一、培育基和培育条件（一）培育基（一）培育基 常用于愈伤组织继代培育的培育基有常用于愈伤组织继代培育的培育基有MSMS、N6N6。细胞分裂素细胞分裂素/生长素比例限制器官发生的模式：生长素比例限制器官发生的模式：IAA/KTIAA/KT高，利于根形成高，利于根形成IAA/KTIAA/KT低，利于芽的分化低，利于芽的分化IAA/KTIAA/KT适中，则产生愈伤组织适中，则产生愈伤组织 GA3GA3乙烯利乙烯利PP333PP333自然提取物：自然提取物：椰乳，浓度椰乳，浓度10%10%番茄汁，浓度番茄汁，浓度5-10%5-10%香蕉汁香蕉汁5 5，浓度，浓度-10%-10%留意：留意：
12、-植物离体培育中，刚好更换植植物离体培育中，刚好更换植物生长物质的种类和浓度，才能有效物生长物质的种类和浓度，才能有效限制器官的分化。限制器官的分化。-生长物质用量影响器官分化。生长物质用量影响器官分化。IAAIAA、IBAIBA处理根比较壮，处理根比较壮，2,4-D2,4-D对生根对生根不利。不利。BABA比比KTKT诱导芽效果强，诱导芽效果强，ZTZT作用作用窄。窄。3 3、有机成分、有机成分 酪氨酸明显增加烟草组织的器官形成酪氨酸明显增加烟草组织的器官形成 酰胺类促进器官形成酰胺类促进器官形成 水解酪蛋白、水解乳蛋白为多种氨基酸混合物水解酪蛋白、水解乳蛋白为多种氨基酸混合物 腺嘌呤促进茎
13、切段培育中芽的形成腺嘌呤促进茎切段培育中芽的形成 糖供应外植体能量，维持确定水势糖供应外植体能量，维持确定水势 4 4、物理性质、物理性质培育基形式、水势，对形态发生有明显影响培育基形式、水势，对形态发生有明显影响 诱导愈伤组织诱导愈伤组织-固态培育基固态培育基 细胞和体细胞胚增值细胞和体细胞胚增值-液态培育基液态培育基 胚状体发育成苗胚状体发育成苗-固态培育基固态培育基培育基培育基PHPH值对芽分化有影响值对芽分化有影响 （二）培育条件（二）培育条件1 1、光照、光照 愈伤组织培育中，某些植物诱导要求在愈伤组织培育中，某些植物诱导要求在黑暗中生长，大多数都须要光。黑暗中生长，大多数都须要光。
14、有的葡萄品种对短日照敏感，烟草愈伤有的葡萄品种对短日照敏感，烟草愈伤组织须要蓝光。组织须要蓝光。2 2、温度、温度 一般一般24282428，有些植物须要确定昼，有些植物须要确定昼夜温差。夜温差。1 1、生理因素、生理因素 多次继代后不加多次继代后不加IAAIAA也可达到同样生长量。也可达到同样生长量。不同培育物保持分化潜力不同。不同培育物保持分化潜力不同。丢失分化实力的组织，加入腺嘌呤、酪蛋白、丢失分化实力的组织，加入腺嘌呤、酪蛋白、酵母汁后，可复原确定分化实力。酵母汁后，可复原确定分化实力。2 2、遗传因素、遗传因素 继代培育中易出现染色体紊乱，分化实力丢继代培育中易出现染色体紊乱，分化实
15、力丢失与倍性不稳定有关。失与倍性不稳定有关。二、继代培育物的分化潜力二、继代培育物的分化潜力三、继代培育物的体细胞变异三、继代培育物的体细胞变异后生遗传变异：后生遗传变异：即离体培育组织在培育中获得激素的自主即离体培育组织在培育中获得激素的自主性（有外源激素才能生长的组织，后期自身产性（有外源激素才能生长的组织，后期自身产生激素）。生激素）。影响后生遗传变异产生的因素主要有：影响后生遗传变异产生的因素主要有：1 1、组织自然倾向、组织自然倾向2 2、培育基化学成分和物理状态、培育基化学成分和物理状态 第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生 概念：概念：极性极性植物细胞分化中的一个基
16、本现象，植物细胞分化中的一个基本现象，指植物的器官、组织、甚至单个细胞在指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同轴向上存在的某种形态结构以及生不同轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。理生化上的梯度差异。细胞无性系细胞无性系植物离体培育中，任何形植物离体培育中，任何形式的细胞培育所产生的植株，即称细胞式的细胞培育所产生的植株，即称细胞无性系。无性系。植物愈伤组织离体培育中，脱分化形植物愈伤组织离体培育中，脱分化形成无极性或无明显形态的愈伤组织块。成无极性或无明显形态的愈伤组织块。当条件适合时，愈伤组织发生再分化而当条件适合时，愈伤组织发生再分化而产生芽或根的分生组织，甚至体细胞胚，产
17、生芽或根的分生组织，甚至体细胞胚，进而发育成苗或完整植株。进而发育成苗或完整植株。愈伤组织的形态发生有以下两种状况：愈伤组织的形态发生有以下两种状况：一、不定芽和根的发生（器官发生）一、不定芽和根的发生（器官发生）是愈伤组织培育物或细胞培育中常见是愈伤组织培育物或细胞培育中常见的器官发生方式。的器官发生方式。（一）愈伤组织通过不定芽和根形成（一）愈伤组织通过不定芽和根形成器官的阶段器官的阶段1 1、外植体脱分化、外植体脱分化-愈伤组织愈伤组织 2 2、愈伤组织、愈伤组织-瘤状结构瘤状结构3 3、瘤状结构、瘤状结构-器官原基器官原基 叶片愈伤组织的形成叶片愈伤组织的形成（二）愈伤组织的器官发生依
18、次（二）愈伤组织的器官发生依次1 1、无芽的根或无根的芽、无芽的根或无根的芽 愈伤组织仅有芽或根器官的分别形成，愈伤组织仅有芽或根器官的分别形成，不能形成完整植株。不能形成完整植株。2 2、先芽后根、先芽后根 愈伤组织先形成芽，芽生长后，其基愈伤组织先形成芽，芽生长后，其基部发出根，进而形成小植株，是大多数植部发出根，进而形成小植株，是大多数植物的器官发生方式。物的器官发生方式。如苹果、葡萄、柑橘、番茄、菊花、如苹果、葡萄、柑橘、番茄、菊花、小麦、水稻小麦、水稻3 3、先根后芽、先根后芽 先形成根，再从根的基部分化出芽先形成根，再从根的基部分化出芽形成小植株，双子叶植物中普遍。形成小植株，双子
19、叶植物中普遍。如颠茄、枸杞、苜蓿如颠茄、枸杞、苜蓿4 4、分别形成芽和根、分别形成芽和根 愈伤组织邻近不同部位分别形成芽愈伤组织邻近不同部位分别形成芽和根，两者结合起来形成一株小植株，类和根，两者结合起来形成一株小植株，类似根芽的自然嫁接。似根芽的自然嫁接。如胡萝卜、石刁柏如胡萝卜、石刁柏二、体细胞胚的发生二、体细胞胚的发生（一）胚状体的概念（一）胚状体的概念 胚状体胚状体-离体培育下没有经过受精过离体培育下没有经过受精过程，但经验了胚胎发育过程所形成的胚的程，但经验了胚胎发育过程所形成的胚的类似物，统称为体细胞胚或胚状体。类似物，统称为体细胞胚或胚状体。胚状体可以从花药或花粉培育、愈伤胚状体
20、可以从花药或花粉培育、愈伤组织培育、离体器官培育、单细胞悬浮培组织培育、离体器官培育、单细胞悬浮培育中产生。育中产生。（二）胚状体的发育过程（二）胚状体的发育过程 细胞分化细胞分化持续细胞分裂增殖持续细胞分裂增殖原胚期原胚期球形胚球形胚心形胚心形胚鱼雷形胚鱼雷形胚子叶期子叶期（三）胚状体的类别（三）胚状体的类别1 1、体细胞胚、体细胞胚 来源于根、茎、叶和它们的组织和细胞，来源于根、茎、叶和它们的组织和细胞，经离体培育而发生的类胚结构，染色体组为经离体培育而发生的类胚结构，染色体组为两套，可发育成为正常植物体。两套，可发育成为正常植物体。2 2、生殖细胞胚、生殖细胞胚 来源于大小孢子细胞，经离
21、体培育而形来源于大小孢子细胞，经离体培育而形成的类胚结构，染色体为单套，可发育成单成的类胚结构，染色体为单套，可发育成单倍体植物体，经染色体加倍成为可育植物。倍体植物体，经染色体加倍成为可育植物。3 3、三倍体胚、三倍体胚 来源于胚乳细胞的胚状体，具三套染色来源于胚乳细胞的胚状体，具三套染色体组。三倍体植物具不育性。体组。三倍体植物具不育性。魔芋体细胞胚魔芋体细胞胚（四）胚状体形成植株的特征（四）胚状体形成植株的特征1 1、具有两极性、具有两极性 细胞发育早期阶段，从其相反的两端分细胞发育早期阶段，从其相反的两端分化出芽端与根端，而不定芽和不定根都是单化出芽端与根端，而不定芽和不定根都是单向极
22、性。向极性。2 2、胚状体的维管组织与外植体的维管组织、胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽和不定根往无解剖结构上的联系，而不定芽和不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系往总是与愈伤组织的维管组织相联系3 3、胚状体的维管组织的分布是独立的、胚状体的维管组织的分布是独立的“”形，而不定芽和不定根的维管组织无此现形，而不定芽和不定根的维管组织无此现象。象。（五）胚状体发生影响因素：（五）胚状体发生影响因素：铵态氮对胚状体的发生有利，也可同铵态氮对胚状体的发生有利，也可同时运用铵态氮和硝态氮时运用铵态氮和硝态氮 赤霉素、细胞分裂素抑制胚状体发生赤霉素、细胞分裂素抑制胚状
23、体发生 生长素类对胚状体的发生有重要作用生长素类对胚状体的发生有重要作用 （六）胚状体形成植株的优点（六）胚状体形成植株的优点 1 1、胚状体的数量比不定芽多、胚状体的数量比不定芽多2 2、胚状体可制成人工种子，便于运输、胚状体可制成人工种子，便于运输和贮藏和贮藏3 3、胚状体的有性后代遗传性更接近母、胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。体植株。第四节第四节 愈伤组织培育的应用愈伤组织培育的应用 外植体不经愈伤组织发育成器官两种状况：外植体不经愈伤组织发育成器官两种状况：1 1、外植体中已存在器官原基，进一步形成、外植体中已存在器官原基，进一步形成相应的组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖相应
24、的组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培育。分生组织培育。2 2、外植体某些部位的细胞，在重新分裂后，、外植体某些部位的细胞，在重新分裂后，干脆形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成干脆形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。器官原基。除茎尖分生组织培育和部分器官培育外，除茎尖分生组织培育和部分器官培育外，全部培育形式最终都要经验愈伤组织才能产生全部培育形式最终都要经验愈伤组织才能产生再生植株，愈伤组织也常是悬浮培育的细胞和再生植株，愈伤组织也常是悬浮培育的细胞和原生质体的来源。原生质体的来源。（一）愈伤组织培育多种用途：（一）愈伤组织培育多种用途：1 1、探讨植物生长发育与分化的机
25、制、探讨植物生长发育与分化的机制、遗传变异规律，对植物遗传育种有特殊意遗传变异规律，对植物遗传育种有特殊意义义 2 2、大规模工厂化生产有用化合物，或、大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培育筛选工业、农业、医药生产用于细胞培育筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体来源。上有用的无性系，或用于原生质体来源。实践证明，愈伤组织不仅是一种植物快实践证明，愈伤组织不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是品种改良，种质资繁的新手段，同时也是品种改良，种质资源保存和有用化合物生产的志向途径。源保存和有用化合物生产的志向途径。（二）在园艺植物育种中的应用：（二）在园艺植物育种中的应用：1 1
26、、加快园艺植物新品种和良种繁育速度，、加快园艺植物新品种和良种繁育速度，快速高效低成本快速高效低成本 2 2、培育无病毒苗木、培育无病毒苗木 3 3、获得倍性不同植株，易染色体核内加、获得倍性不同植株，易染色体核内加倍育种有利用价值倍育种有利用价值 4 4、克服远缘杂交困难、克服远缘杂交困难 5 5、利于种质资源长期保存、利于种质资源长期保存 6 6、供应育种中间材料、供应育种中间材料 7 7、诱发和离体筛选突变体、诱发和离体筛选突变体 8 8、制造人工种子、制造人工种子 植物离体培育中的器官发生类型：植物离体培育中的器官发生类型：不定芽型不定芽型诱导顶端分生组织产生不定诱导顶端分生组织产生不
27、定芽，再生成植株的方式。顶芽、腋芽培育。芽，再生成植株的方式。顶芽、腋芽培育。多数植物培育接受。多数植物培育接受。特点：繁殖率高、遗传稳定性好特点：繁殖率高、遗传稳定性好 器官型器官型从器官外植体诱导不定芽，再从器官外植体诱导不定芽，再生成植株的方式。茎、叶、花器、鳞片培育。生成植株的方式。茎、叶、花器、鳞片培育。特点：繁殖速度慢，遗传性状较稳特点：繁殖速度慢，遗传性状较稳器官发生型器官发生型从器官外植体诱导愈伤组织，从器官外植体诱导愈伤组织，经愈伤组织细胞的分化再生成植株的方式。经愈伤组织细胞的分化再生成植株的方式。特点：繁殖速度快、遗传性状不稳定特点：繁殖速度快、遗传性状不稳定类胚体发生类
28、胚体发生由植物体器官、组织和细胞培由植物体器官、组织和细胞培育而干脆发生类胚结构，最终以胚状体成苗育而干脆发生类胚结构，最终以胚状体成苗的方式。的方式。特点：遗传性一样，体细胞发生数量大特点：遗传性一样，体细胞发生数量大原球茎型原球茎型兰属特有的器官发生方式，种子兰属特有的器官发生方式，种子培育发生原球茎，原球茎干脆长成植株。培育发生原球茎，原球茎干脆长成植株。特点：遗传较稳、繁殖率不高特点：遗传较稳、繁殖率不高思索：1、叙述愈伤组织培育的诱导方法。2、继代培育物的分化潜力的影响因素如何。3、愈伤组织器官发生依次的状况有哪些？4、说明愈伤组织培育的多种用途。课后查阅：课后查阅：1、植物愈伤组织形成中激素的作用有、植物愈伤组织形成中激素的作用有什么规律？什么规律？2、环境条件对植物细胞的脱分化和再、环境条件对植物细胞的脱分化和再分化有什么影响？分化有什么影响？