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1、百度文库-让每个人平等地提升自我湖北省地方标准编制说明湖北省地方标准编制说明水产品中一甲基砷、二甲基砷、标准名称砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法起草单位湖北省农科院农业质量标准与检测技术研究所标准起草人姚晶晶1.项目背景及来源湖北是千湖之省，境内江河纵横，湖泊水库池塘星罗棋布，发展水产业具有得天独厚的资源优势。全省水域总面积 2500 万亩，宜养水面1360 万亩，居全国第一，其中湖泊养殖、池塘养殖、水库及河沟养殖约各占三分之一。我省水产资源十分丰富。淡水产品总量连续 16 年雄居全国榜首，适宜发展水产养殖的面积、已养殖面积、池塘养殖面积、人均占有量、淡水渔业科技实力等多项综
2、合性指标均居全国第一。砷广泛存在于地壳、土壤、海水、河水、大气及食物中。不同形态的砷毒性相差甚远，传统砷总量测定不能反映出有关毒性的确切信息，无法满足目前样品分析的需要。故砷的形态分析对于了解砷化物的生态影响及其在环境中迁移转化规律具有重要意义。而不同形态的砷化合物在稳定性上存在差异。故选用适当的预处理技术，以确保样品在分离和富集的过程中砷形态及其组成不发生变化，进而对各形态的砷进行分析检测。不同形态的砷化物对水产品生长及产量都有明显的影响。因此无论对环境样品、食品，还是对从事与砷有关的工作人员或砷中毒患者的体液进行砷的形态分析都是有必要的。传统方法中，只测定样品中的总砷量，不能给出有关毒性的
3、确切信息。因此，从正确估计砷对环境及人类的危害角度出发，需要建立一种有效地分离、测试各种形态砷化合物的手段。砷的主要几种形态为一甲基砷（MMA）、二甲基砷(DMA)、砷酸根（AsV）以及亚砷酸根（As）。我国目前现行的水产品中砷元素最大允许含量水平较高，而推荐执行的分析方法ICP-MS 法和原子荧光法，具体存在的最主要的问题是没有将有毒的无机砷和无毒的有机砷分开定量，难以符合当今社会对水产品安全的要求。针对砷形态的检测方法标准的空白，制定相应的砷形态检测方法就显得极为重要。随着我国经济水平和科技水平的发展，高效液相色谱仪与其他光谱仪器联用已成为我国各级实验室的基本配套仪器。基于液相色谱的分析方
4、法由于灵敏度高，重现性好，常作为仲裁方法。本标准在制定前，查阅了大量的国内外报道的砷形态联合检测方法，依据一甲基砷、二甲基砷、砷酸根、以及亚砷酸根理化性质，针对液相分离、联合提取以及检测条件等三个方面内容，制定了水产品中一甲基砷，二1百度文库-让每个人平等地提升自我甲基砷，砷酸根以及亚砷酸根的检测方法标准。本标准的实施将有效保障水产品和食品安全。该项目经湖北省卫生和计划生育委员会批准，由湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所起草。2.标准制定的主要过程成立标准编写小组。2013 年 1 月，成立了 水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法标准编写小组
5、，由彭立军副研究员、李书谦高级农艺师、袁友明副研究员、王明锐副研究员、姚晶晶助理研究员、路磊助理研究员等组成。完成查新和立项等工作。于 2013 年 3 月向湖北省质量技术监督局递交了湖北省地方标准水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法的查新报告。本课题组于 2013 年 4月向湖北省卫生和计划生育委员会递交了关于水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法地方标准制定的立项报告。查阅文献制定方法查阅砷形态分析方法的资料，在文献资料调研的基础上确定了本标准制定拟采用的原则、方法和技术依据。根据现有报道的砷形态检测方法，分
6、别制定了提取、液相-原子荧光联用分析以及检测条件等三个方面的分析方法。编写标准征求意见稿和编制说明2013 年 10 月至 2013 年 11 月，编写 水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法的标准征求意见稿和编制说明。方法验证2013 年 10 月至 11 月，组织了两家有资质的实验室进行方法验证，两家实验室都具备了分析 4 种砷形态的仪器设备和相应的前处理设备，统一派发了 4 种砷标准溶液和标准样品。与 2013 年 11 月收回全部的验证报告，2013 年 11 月，进行了数据的汇总和数据的数理的分析工作，并编写完成了水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷
7、酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法方法验证报告。3.标准制订的基本原则和技术路线基本原则本标准的制订依据中华人民共和国标准化法、中华人民共和国标准化法实施条例、湖北2百度文库-让每个人平等地提升自我省标准化管理办法的要求，通过查阅大量国内外文献，组织专家论证，拟定实验方案，开展实验，编制标准草案，通过标准验证试验，完成标准征求意见稿经过大量实验验证后编制而成。（1）本方法能够满足分析四种砷形态特性指标的要求。（2）本方法的准确度、精密度和灵敏度达到国内、外同类方法的同等水平；（3）建立的标准分析方法符合我国目前检测设备仪器和试剂、材料的供应条件；（4）建立的标准分析方法符合监测行
8、业人员的技术水平，能被国内主要的环境分析实验室所使用并达到所规定的要求；（5）本方法具有普遍适用性，易于推广使用。技术路线本标准制订的技术路线图，见图 1。湖北省卫生和计划生育委员会立项成立标准编制组查阅相关文献和资料国内外相关标准的调研查阅国内外相关分析方法编写标准制定草案和计划标准草案文本制定完善实施线路实验数据分析汇总征集专家修订意见方法验证国家相关标准确定标准内容地方和行业标准编制标准方法文本和编制说明（征求意见稿、征求意见并汇总处理、送审稿、技术审查以及完成报批稿）4.方法研究报告方法研究的目标适用范围3百度文库-让每个人平等地提升自我本方法标准适用于水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸
9、根和亚砷酸根的高效液相色谱-原子荧光光谱测定。本标准拟达到的特性指标：通过本标准的修订，使方法的检出限、测定下限、精密度和准确度等满足我国水产品卫生标准中对砷最大允许含量的要求。目标组分为满足我国水产品卫生标准中对砷最大允许含量的要求，本标准可以检测一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的含量。实现了四种砷形态的联合检测，在选定的色谱柱和分析条件下，各组分互不干扰，且有良好的分离度。方法原理试样中的一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根经由50%甲醇溶液提取，浓缩至干，以磷酸二氢铵溶液定容，通过液相色谱-原子荧光联用系统分析，保留时间定性，外标法定量。试剂与材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分
10、析纯的试剂和 GB/T 6682 中规定的二级水。甲醇：色谱纯。硼氢化钾。氢氧化钾。磷酸二氢铵。盐酸。硝酸。氨水。一甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的一甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成10-3g/L 的一甲基砷标准储备液，避光保存于 4冰箱备用。二甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的二甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成10-3 g/L 的二甲基砷标准储备液，避光保存于 4冰箱备用。砷酸根标准储备溶液：准确称取适量的砷酸根标准品，用5%（v/v）硝酸配制成10-3 g/L 的砷酸根标准储备液，避光保存于 4冰箱备用。亚砷酸根标准储备液：准确称取适量的亚砷酸根标准品，用5%（v/v）硝
11、酸配制成10-3 g/L 的亚砷酸根储备液，避光保存于 4冰箱备用。混合标准溶液工作液4百度文库-让每个人平等地提升自我取适量四种标准储备液至 10 mL 容量瓶中，加 5%（v/v）硝酸稀释至刻度，现配现用（见表 1），如需单独检测，可使用表 1 中的单一标准溶液。表 1 砷形态混合标准溶液（浓度：g/L）名称一甲基砷二甲基砷砷酸根亚砷酸根标准溶液 110-610-610-610-6标准溶液 210-510-510-510-5标准溶液 310-510-510-510-5标准溶液 410-510-510-510-5标准溶液 510-510-510-510-5流动相取磷酸二氢铵加入 1 000
12、mL 水中，用盐酸或者氨水调节 pH 值为。临用前，过 m 滤膜。仪器与设备分析天平，感量 g。分样筛：孔径 mm。粉碎机。漩涡混合器。超声波震荡仪。恒温水浴锅。1 mL 可调移液器。10 mL 棕色容量瓶。50 mL 具塞 PVC 离心管。2 mL 带盖 PVC 离心管。m 微孔滤膜（适用于水溶剂）。m 微孔滤膜（适用于有机溶剂）。离心机，配有 50 mL 离心管适配器，RCF 不小于 2 500g。氮吹仪。高效液相泵。原子荧光光谱仪，配有砷空心阴极灯。5百度文库-让每个人平等地提升自我试样制备对于鲜活或水分含量高的水产品，取有代表性可食用部分 500g，捣成匀浆，储存于18以下冰柜中备用。
13、对于冷冻水产品，解冻后取有代表性可食用部分500g，捣成匀浆，储存于18以下冰柜中备用。分析步骤仪器条件与校准仪器条件按照仪器说明书的要求进行调试仪器，推荐分析条件：色谱柱：阴离子交换柱色谱 Hamilton PRP-X100（长 250 mm，内径 mm，粒径 10m）；流速：1mL/min;进样体积：100L;还原剂：%KBH4和%KOH；载流：7%HCl;蠕动泵速：70 r/min;原子荧光条件：灯电流：100mA；负高压：270V;载气流量：300mL/min;屏蔽气流量：600mL/min;辅阴极电流：30mA。标准曲线的绘制移取适量的 4 种砷的标准溶液，以5%（v/v）硝酸为溶剂
14、配制成5 个不同浓度的混合标准溶液，具体浓度见表 1。分别移取各标准使用液 100L，注入液相色谱中，得到各不同浓度的砷形态色谱图。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。6百度文库-让每个人平等地提升自我图 24 种砷形态工作曲线标准样品的色谱图图 3 为亚砷酸根（As）、二甲基砷（DMA）、一甲基砷（MMA）、砷酸根（AsV）四种砷标准样品色谱图样品测定取 100L待测样品注入液相泵中。记录色谱峰的保留时间和峰面积，根标准方法计算出样品中的7百度文库-让每个人平等地提升自我待测物含量。实验条件的选择和方法验证的初步方案实验条件的选择（1）色谱条件的选择流动相的 pH 与混合标准溶液砷
15、形态的分离有关，选取流动相 pH 为，来考察其对分离结果的影响，在 pH=时，As(III)和 DMA 两峰出现重叠；PH=时，DMA、MMA 分离度下降，并出现严重拖尾现象；在 pH=时，4 种形态砷物质均能完全分离，且峰形较好，因此流动相 pH 选取。（2）载流条件的选择选取盐酸浓度 1%，3%，7%，10%来考察其对结果的影响，HCl 浓度越大砷的荧光响应值越大，但基线不稳，噪声较大。当盐酸浓度为 10%时，其基线噪声已经严重的干扰样品，而盐酸浓度为 7%时，则影响很小。故由实验得当 HCl 浓度为 7%时噪声较小且能够提供较大的响应值。（3）载气流速的影响选取载气流速 200，300，
16、400 mL/min 来考察其对信噪比的影响。当载气流速在200 mL/min 时，信噪比较高，灵敏度较高，但背景干扰也较大，稳定性低。载气流速在 400 mL/min 时，由于载气流速过大导致待分析物质被稀释，灵敏度较低。流速为 300mL/min 时，灵敏度和稳定性均较适宜，故载气流速选择 300 mL/min。（4）蠕动泵速的影响选取蠕动泵速 60，70，80 r/min 来考察其对结果的影响，泵速改变会使经色谱柱分离后的砷与还原剂和载流反应的速度发生改变。泵速越大，氢化反应越完全，其灵敏度也越高，但当泵速达到 80r/min后，较 70r/min 而言，其灵敏度没有明显的提高，而且泵速
17、越高还原剂与载流消耗的量也越大，容易造成试剂的浪费，故综合以上分析选取蠕动泵速为 70r/min。（5）提取条件的影响在本标准的制定初期，实验依据现有的各类分析标准，比较了甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃、乙酸乙酯、三氯甲烷和二氯甲烷等不同溶剂对四种砷形态的联合提取效果，经多次实验，提取液（50%甲醇）可以满足四种砷形态的联合提取。针对液液分配提取操作复杂，环境污染大的缺点，课题组随后在前期液液分配提取的基础上，查阅了大量外文文献，开发建立了四种砷形态提取技术，比较了甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯等有机溶剂对水产品中一甲基砷（MMA）、二甲基砷(DMA)、砷酸根（AsV）以及亚砷酸根（As）的提取效果，
18、研究了超声提取、氮吹浓缩的净化效果。实验结果表明，50%甲醇水溶液对四种砷的提取效果较好。8百度文库-让每个人平等地提升自我方法检出限的确定方法和验证方案按照水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法样品分析的全部步骤，称取经粉碎、混合均匀的鱼肉样品5g（精确至）于 50mL 的离心管中，加 10mL50%甲醇溶液，涡旋震荡均匀之后，70超声萃取 15min，3000r/min 离心 15min，取其上清液于 25mL的比色管中，将其沉淀重复上次萃取 1 次，合并两次上清液，用50%甲醇定容至 25mL，取其上清液用滤纸过滤，取滤液 5mL，于 70下吹氮（
19、）浓缩至约，冷却后用流动相定容至，再用过滤膜（）过 2次膜。上机检测。以产生仪器信噪比 25 倍响应值所对应浓度（含量）的样品进行重复 7 次平行测定，计算测定结果的标准偏差，按照公式（1）计算方法检出限，并以3 倍方法检出限作为方法的测定下限。MDL=t(n-1,S（1）式中：MDL 为方法检出限；n 为样品平行测定的次数；t 为自由度为 n-1，置信度为 99%时的 t 分布（单侧）；S 为 n 次平行测定的标准偏差。其中，当自由度为 n-1，置信度为 99%时的 t 值可参考表 2 取值。表表 2 t2 t 值表值表平行测定次数（n）789101116自由度（n-1）67891015T（
20、n-1，）如果样品的浓度（含量）超过计算出的方法检出限 10 倍，或者样品浓度（含量）低于计算出的方法检出限，则都需要调整样品浓度重新进行测定。配制含四种一定浓度的标准溶液，平行测定 7 次，结果见表 3：表表 3 3 方法检出限及测定下限方法检出限及测定下限平行号MMADMAAsAs9百度文库-让每个人平等地提升自我12测定结果（g/kg）67平均值X（g/kg）标准偏差 Si（g/kg）t 值检出限（g/kg）测定下限（g/kg）345注：一甲基砷（MMA）；二甲基砷（DMA）；亚砷酸根（As）；砷酸根（As）方法精密度的确定按照表 4 分别在鱼肉样品中添加三个水平的 MMA、DMA、As
21、和 As标准品，按照标准步骤处理后，取其样品提取液做精密度测定，每个水平测定 6 次，结果见表 5。表表 4 4 测定精密度的各个加标水平（单位：测定精密度的各个加标水平（单位：g/kgg/kg）水平加标水平 1加标水平 2加标水平 3MMA204060DMA102030表表 5 5 精密度测试结果精密度测试结果MMA 浓度平行试验水平 1123456平均值X标准偏差 Si相对标准偏差 RSD（%）（ng/mL）水平 2水平 3水平 1DMA 浓度（ng/mL）水平 2水平 3水平 1As浓度（ng/mL）水平 2水平 3水平 1As浓度（ng/mL）水平 2水平 3As255075As102
22、030方法准确度的确定10百度文库-让每个人平等地提升自我加标回收实验按照表 6 分别在鱼肉样品中添加三个水平的 MMA、DMA、As和 As标准品，每水平设三个平行，按照标准方法的分析步骤进行回收率实验，计算其标准偏差和相对标准偏差，结果见表 7。表表 6 6 测定准确度的各个加标水平（单位：测定准确度的各个加标水平（单位：g/kgg/kg）水平加标水平 1加标水平 2加标水平 3MMA102030DMA102030As102030As102030表表 7 7 不同加标水平的回收率（单位：不同加标水平的回收率（单位：%）平行试验123平均值X标准偏差 Si相对标准偏差 RSD（%）加标水平
23、1 的回收率MMA加标水平 2 的回收率As加标水平 3 的回收率AsDMAAsMMADMAAsMMADMAAsAs与其它标准对比试验取 4 种水产品，分别用本方法以及 GB/T23372-2009 中的样品处理方法，按照分析步骤进行样品测定，结果如表 8：表表 8 28 2 种方法的测试结果（单位：种方法的测试结果（单位：g/kgg/kg）样品HPLC-AFSHPLC-ICP-MS绝对差值算术平均值草鱼AsAsAs虾AsAs三文鱼AsAs莲藕As由 4 种水产品的 2 种方法的数据对比知，其算术平均值均小于绝对差值的 10%，满足方法准确度的要求。结果计算按式（2）计算试样中检测目标物的含量
24、（g/kg）：X C V1 000(2)m1 00011百度文库-让每个人平等地提升自我式中：X试样中检测目标物的含量，以质量分数表示，单位为微克每千克（g/kg）；C由标准曲线计算得到的上机试样溶液中目标物浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V浓缩至干后试样的定容体积，单位为毫升（mL）；m试样的质量，单位为克（g）。平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。样品的种类，以及部分样品回收率实验通过对三文鱼、鲳鱼、白鱼、带鱼、鲻鱼、多宝鱼、大黄鱼、虾、鳊鱼、草鱼、财鱼、鲫鱼、白鲢、刁子鱼、胖头鱼、鲇鱼、莲藕以及海带等 18 种水产品进行方法实验，均能得到满意的结果。其中部分回收率的结果
25、见表 9。表表 9393 种水产品的加标回收率汇总表（种水产品的加标回收率汇总表（%）样品带鱼草鱼海带平行一平行二平行一平行二平行一平行二回收率亚砷酸%二甲基砷%一甲基砷%砷酸根%5.方法验证方法验证过程通过筛选确定方法验证单位。按照方法验证方案准备实验用品，与验证单位确定验证时间。在方法验证前，参加验证的操作人员应熟悉和掌握方法原理、操作步骤及流程。方法验证过程中所用的试剂和材料、仪器和设备及分析步骤应符合方法相关要求。具体结果见附件 1、附件 2 和附件 3。方法验证数据汇总方法检出限、测定下限汇总按照水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法中样品分析
26、的全部步骤，进行 7 次平行测定。计算 7 次平行测定的标准偏差，计算方法检出限，当自由度为 6，置信度为 99%时，t 值为。在 3 家国家认可实验室对方法检出限和测定下限进行了验证，方法检出限和测定下限的汇总情况，见表 10。12百度文库-让每个人平等地提升自我表表 1010 方法检出限、测定下限数据汇总表（单位：方法检出限、测定下限数据汇总表（单位：g/kgg/kg）实验室号MMA检出限123平均值标准偏差检出下限DMA检出限检出下限As检出限检出下限As检出限检出下限各实验室的方法精密度在 3 家国家认可实验室进行了方法精密度的验证工作。在空白饲料样品中分别加入四种砷形态的混合标准溶液
27、，按照水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法中样品分析的全部步骤，进行分析测定，数据汇总见表 11-1表 11-4。表表 11-111-1 实验室间方法精密度验证数据汇总表（实验室间方法精密度验证数据汇总表（MMAMMA）水平 1实验室号Xi(ng/mL)123Si(ng/mL)RSD(%)Xi(ng/mL)Si(ng/mL)RSD(%)Xi(ng/mL)Si(ng/mL)RSD(%)水平 2水平 3表表 11-211-2 实验室间方法精密度验证数据汇总表（实验室间方法精密度验证数据汇总表（DMADMA）水平 1实验室号Xi(ng/mL)123Si(ng
28、/mL)RSD(%)Xi(ng/mL)Si(ng/mL)RSD(%)Xi(ng/mL)Si(ng/mL)RSD(%)水平 2水平 3表表 11-311-3 实验室间方法精密度验证数据汇总表（实验室间方法精密度验证数据汇总表（AsAs）13百度文库-让每个人平等地提升自我水平 1实验室号Xi(ng/mL)123Si(ng/mL)RSD(%)Xi(ng/mL)Si(ng/mL)RSD(%)Xi(ng/mL)Si(ng/mL)RSD(%)水平 2水平 3表表 11-411-4 实验室间方法精密度验证数据汇总表（实验室间方法精密度验证数据汇总表（AsAs）水平 1实验室号Xi(ng/mL)123Si(
29、ng/mL)RSD(%)Xi(ng/mL)Si(ng/mL)RSD(%)Xi(ng/mL)Si(ng/mL)RSD(%)水平 2水平 3实验室间方法回收率汇总在 3 家国家认可实验室进行了方法准确度的验证工作，其数据汇总见表12。表表 1212 实验室间方法回收率验证数据汇总表实验室间方法回收率验证数据汇总表MMA实验室号水平 1123水平 2水平 3水平 1水平 2水平 3水平 1水平 2水平 3水平 1水平 2水平 3DMAAsAsX(ng/mL)Si(ng/mL)RSD（%）6.方法验证结论本方法验证采用水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法，方法
30、的检出限、精密度和准确度是评价方法水平的主要技术指标，方法验证的结果如下：（1）共 4 家单位参加了方法验证工作，所得数据均能满足方法要求，没有异常情况。（2）方法检出限和测定下限：一甲基砷的方法检出限为 g/kg，测定下限为 g/kg；二甲基砷的方法检出限为 g/kg，测定下限为g/kg；砷酸根的方法检出限为g/kg，测定下限为 g/kg；亚砷酸根的方法检出限为g/kg，测定下限为g/kg。14百度文库-让每个人平等地提升自我（3）方法精密度：精密度通常采用标准偏差或相对标准偏差来表示，方法验证所得测定下限浓度的测得相对标准偏差在 26%以内。（4）方法准确度：主要用加标回收率表示，目前测定
31、要求加标回收率 7494%范围内，方法验证的空白样品加标回收率均在 70%以上，同时，对比其他标准方法，其绝对差在10%以内，也符合要求。附 115百度文库-让每个人平等地提升自我验证报告验证报告标准名称：标准名称：水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱原子荧光光谱法起草单位：起草单位：湖北省农科院业质量标准与检测技术研究所验证单位：验证单位：农业部微生物产品质量监督检验测试中心（武汉）2013 年 11 月 21 日本试验按照湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所提供的水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根16百度文库-让每个人平等地提升自我和亚砷酸根的测定高效液相
32、色谱-原子荧光光谱法地方标准草案方法，对其进行验证，验证内容为：检出限和测定下限；方法精密度；准确度等。1 1试剂试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682 中规定的二级水。甲醇：色谱纯硼氢化钾氢氧化钾磷酸二氢铵盐酸硝酸氨水一甲基砷标准品：GBW08668二甲基砷标准品：GBW08669砷酸根标准品：GBW08667亚砷酸根标准品：GBW08666一甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的一甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成10-3g/L 的一甲基砷标准储备液，避光保存于 4冰箱备用。二甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的二甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成10
33、-3g/L 的二甲基砷标准储备液，避光保存于 4冰箱备用。砷酸根标准储备溶液：准确称取适量的砷酸根标准品，用5%（v/v）硝酸配制成10-3g/L 的砷酸根标准储备液，避光保存于 4冰箱备用。亚砷酸根标准储备液：准确称取适量的亚砷酸根标准品，用5%（v/v）硝酸配制成10-3g/L 的亚砷酸根储备液，避光保存于 4冰箱备用。流动相：取磷酸二氢铵加入1 000 mL 水中，用盐酸或者氨水调节 pH 值为。临用前，过 m滤膜。2 2样品样品取市售鲫鱼肌肉部分，纯水冲洗至表面无血污，匀浆后待测。3 3仪器设备仪器设备分析天平：感量 g。粉碎机漩涡混合器超声波震荡仪恒温水浴锅1 mL 可调移液器17百
34、度文库-让每个人平等地提升自我10 mL 棕色容量瓶50 mL 具塞 PVC 离心管2 mL 带盖 PVC 离心管m 微孔滤膜（适用于水溶剂）m 微孔滤膜（适用于有机溶剂）离心机：配有 50 mL 离心管适配器，最大转速为 4 000 r/min氮吹仪高效液相泵原子荧光光谱仪：配有砷空心阴极灯4 4方法方法按照标准草案中提供的方法进行提取、净化；测定5 5结果结果检出限与测定下限的确定检出限与测定下限的确定按照水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法样品分析的全部步骤，以产生仪器信噪比 25 倍响应值所对应浓度（含量）的样品进行重复 7 次平行测定，计算测
35、定结果的标准偏差，按照公式（1）计算方法检出限，并以3 倍方法检出限作为方法的测定下限。MDL=t(n-1,S式中：MDL 为方法检出限；n 为样品平行测定的次数；t 为自由度为 n-1，置信度为 99%时的 t 分布（单侧）；S 为 n 次平行测定的标准偏差。其中，当自由度为 n-1，置信度为 99%时的 t 值可参考表 1 取值。表表 1 t1 t 值表值表平行测定次数（n）789101116自由度（n-1）67891015T（n-1，）如果样品的浓度（含量）超过计算出的方法检出限 10 倍，或者样品浓度（含量）低于计算出的方法检出限，则都需要调整样品浓度重新进行测定。18百度文库-让每个
36、人平等地提升自我配制含四种一定浓度的标准溶液，平行测定7 次，结果见表 2：表表 2 2 方法检出限及测定下限方法检出限及测定下限平行号12测定结果（g/kg）67平均值X（g/kg）标准偏差 Si（g/kg）t 值检出限（g/kg）测定下限（g/kg）345MMADMAAsAs注：一甲基砷（MMA）；二甲基砷（DMA）；亚砷酸根（As）；砷酸根（As）方法精密度的确定方法精密度的确定按照表 3 分别在鱼肉样品中添加三个水平的MMA、DMA、As和 As标准品，按照标准步骤处理后，取其样品提取液做精密度测定，每个水平测定6 次，结果见表 4。表表 3 3 测定精密度的各个加标水平（单位：测定精
37、密度的各个加标水平（单位：g/kgg/kg）水平加标水平 1加标水平 2加标水平 3MMA102030DMA153045As154070As204060表表 4 4 精密度测试结果精密度测试结果19百度文库-让每个人平等地提升自我MMA 浓度平行试验水平 1123456平均值X标准偏差 Si相对标准偏差 RSD（%）DMA 浓度（ng/mL）水平 3水平 1水平 2水平 3水平 1As浓度（ng/mL）水平 2水平 3水平 1As浓度（ng/mL）水平 2水平 3（ng/mL）水平 2方法准确度的确定方法准确度的确定按照表 5 分别在鱼肉样品中添加三个水平的 MMA、DMA、As和 As标准品
38、，每水平设三个平行，按照标准方法的分析步骤进行回收率实验，计算其标准偏差和相对标准偏差，结果见表6。表表 5 5 测定准确度的各个加标水平（单位：测定准确度的各个加标水平（单位：g/kgg/kg）水平加标水平 1加标水平 2加标水平 3MMA102030DMA102030As102030As102030表表 6 6 不同加标水平的回收率（单位：不同加标水平的回收率（单位：%）平行试验123平均值X标准偏差 Si相对标准偏差 RSD（%）加标水平 1 的回收率MMA加标水平 2 的回收率As加标水平 3 的回收率AsDMAAsMMADMAAsMMADMAAsAs结论结论灵敏度灵敏度本方法中一甲基
39、砷的检出限为g/kg，检出下限为g/kg；二甲基砷的检出限为g/kg，检出下限为g/kg；砷酸根的检出限为 g/kg，检出下限为 g/kg；亚砷酸根的检出限为g/kg，检出下限为 g/kg。精密度精密度本方法中一甲基砷在各浓度水平下相对标准偏差为%；二甲基砷在各浓度水平下相对标准偏差为%；砷酸根在各浓度水平下相对标准偏差为%；亚砷酸根在各浓度水平下相对标准偏差为%。20百度文库-让每个人平等地提升自我准确度准确度本方法中一甲基砷在各浓度水平下回收率在%范围之内；二甲基砷在各浓度水平下回收率在%范围之内；砷酸根在各浓度水平下回收率在%范围之内；亚砷酸根在各浓度水平下回收率在%范围之内。方法评价方
40、法评价本方法利用液相色谱原子荧光联用技术，能够实现对水产品中四种形态的砷同时检测，减少分析时间，降低检测成本。附 221百度文库-让每个人平等地提升自我验证报告验证报告标准名称：标准名称：水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱原子荧光光谱法起草单位：起草单位：湖北省农科院业质量标准与检测技术研究所验证单位：验证单位：湖北省农产品质量安全检测中心2013 年 11 月 20 日本试验按照湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所提供的水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法地方标准草案方法，对其进行验证，验证内容为：检出限、测定下限
41、、精密度、准确度等。22百度文库-让每个人平等地提升自我1 1试剂试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682 中规定的二级水。甲醇：色谱纯硼氢化钾氢氧化钾磷酸二氢铵盐酸硝酸氨水一甲基砷标准品：GBW08668二甲基砷标准品：GBW08669砷酸根标准品：GBW08667亚砷酸根标准品：GBW08666一甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的一甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成10-3g/L 的一甲基砷标准储备液，避光保存于 4冰箱备用。二甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的二甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成10-3g/L 的二甲基砷标准储备液，避光保存于 4
42、冰箱备用。砷酸根标准储备溶液：准确称取适量的砷酸根标准品，用5%（v/v）硝酸配制成10-3g/L 的砷酸根标准储备液，避光保存于 4冰箱备用。亚砷酸根标准储备液：准确称取适量的亚砷酸根标准品，用5%（v/v）硝酸配制成10-3g/L 的亚砷酸根储备液，避光保存于 4冰箱备用。流动相：取磷酸二氢铵加入1 000 mL 水中，用盐酸或者氨水调节 pH 值为。临用前，过 m滤膜。2 2样品样品取市售鲫鱼肌肉部分，纯水冲洗至表面无血污，匀浆后待测。3 3仪器设备仪器设备分析天平：感量 g。粉碎机漩涡混合器超声波震荡仪恒温水浴锅1 mL 可调移液器10 mL 棕色容量瓶50 mL 具塞 PVC 离心管
43、23百度文库-让每个人平等地提升自我2 mL 带盖 PVC 离心管m 微孔滤膜（适用于水溶剂）m 微孔滤膜（适用于有机溶剂）离心机：配有 50 mL 离心管适配器，最大转速为 4 000 r/min氮吹仪高效液相泵原子荧光光谱仪：配有砷空心阴极灯4 4方法方法按照标准草案中提供的方法进行提取、净化；测定5 5结果结果检出限与测定下限的确定检出限与测定下限的确定按照水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法样品分析的全部步骤，以产生仪器信噪比 25 倍响应值所对应浓度（含量）的样品进行重复 7 次平行测定，计算测定结果的标准偏差，按照公式（1）计算方法检出限，
44、并以3 倍方法检出限作为方法的测定下限。MDL=t(n-1,S式中：MDL 为方法检出限；n 为样品平行测定的次数；t 为自由度为 n-1，置信度为 99%时的 t 分布（单侧）；S 为 n 次平行测定的标准偏差。其中，当自由度为 n-1，置信度为 99%时的 t 值可参考表 1 取值。表表 1 t1 t 值表值表平行测定次数（n）789101116自由度（n-1）67891015T（n-1，）如果样品的浓度（含量）超过计算出的方法检出限 10 倍，或者样品浓度（含量）低于计算出的方法检出限，则都需要调整样品浓度重新进行测定。配制含四种一定浓度的标准溶液，平行测定7 次，结果见表 2：24百度
45、文库-让每个人平等地提升自我表表 2 2 方法检出限及测定下限方法检出限及测定下限平行号12测定结果（g/kg）67平均值X（g/kg）标准偏差 Si（g/kg）t 值检出限（g/kg）测定下限（g/kg）345MMADMAAsAs注：一甲基砷（MMA）；二甲基砷（DMA）；亚砷酸根（As）；砷酸根（As）方法精密度的确定方法精密度的确定按照表 3 分别在鱼肉样品中添加三个水平的MMA、DMA、As和 As标准品，按照标准步骤处理后，取其样品提取液做精密度测定，每个水平测定6 次，结果见表 4。表表 3 3 测定精密度的各个加标水平（单位：测定精密度的各个加标水平（单位：g/kgg/kg）水平
46、加标水平 1加标水平 2加标水平 3MMA102030DMA103560As104070As204060表表 4 4 精密度测试结果精密度测试结果平行试验MMA 浓度（ng/mL）DMA 浓度（ng/mL）As浓度（ng/mL）As浓度（ng/mL）25百度文库-让每个人平等地提升自我水平 1123456平均值X标准偏差 Si相对标准偏差 RSD（%）水平 2水平 3水平 1水平 2水平 3水平 1水平 2水平 3水平 1水平 2水平 3方法准确度的确定方法准确度的确定按照表 5 分别在鱼肉样品中添加三个水平的 MMA、DMA、As和 As标准品，每水平设三个平行，按照标准方法的分析步骤进行回
47、收率实验，计算其标准偏差和相对标准偏差，结果见表6。表表 5 5 测定准确度的各个加标水平（单位：测定准确度的各个加标水平（单位：g/kgg/kg）水平加标水平 1加标水平 2加标水平 3MMA102030DMA102030As102030As102030表表 6 6 不同加标水平的回收率（单位：不同加标水平的回收率（单位：%）平行试验123平均值X标准偏差 Si相对标准偏差 RSD（%）加标水平 1 的回收率MMADMAAsAs加标水平 2 的回收率MMADMAAsAs加标水平 3 的回收率MMADMAAsAs结论结论灵敏度灵敏度本方法中一甲基砷的检出限为g/kg，测定下限为g/kg；二甲基
48、砷的检出限为g/kg，测定下限为g/kg；砷酸根的检出限为 g/kg，测定下限为 g/kg；亚砷酸根的检出限为g/kg，测定下限为 g/kg。精密度精密度本方法中一甲基砷在各浓度水平下相对标准偏差为%；二甲基砷在各浓度水平下相对标准偏差为%；砷酸根在各浓度水平下相对标准偏差为%；亚砷酸根在各浓度水平下相对标准偏差为%。准确度准确度26百度文库-让每个人平等地提升自我本方法中一甲基砷在各浓度水平下回收率在%；二甲基砷在各浓度水平下回收率在%；砷酸根在各浓度水平下回收率在%；亚砷酸根在各浓度水平下回收率在%。方法评价方法评价本方法利用液相色谱原子荧光联用技术，能够实现对水产品中四种形态砷的同时检测
49、，减少了分析时间，降低了检测成本。、附 327百度文库-让每个人平等地提升自我验证报告验证报告标准名称：标准名称：水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱原子荧光光谱法起草单位：起草单位：湖北省农科院业质量标准与检测技术研究所验证单位：验证单位：华中农业大学资源与环境学院2013 年 12 月 27 日本试验按照湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所提供的水产品中一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的测定高效液相色谱-原子荧光光谱法地方标准草案方法，对其进行验证，验证内容为：检出限、测定下限、精密度、准确度等。1 1试剂试剂28百度文库-让每个人平等地提升自我除非另
50、有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682 中规定的二级水。甲醇：色谱纯硼氢化钾氢氧化钾磷酸二氢铵盐酸硝酸氨水一甲基砷标准品：GBW08668二甲基砷标准品：GBW08669砷酸根标准品：GBW08667亚砷酸根标准品：GBW08666一甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的一甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成10-3g/L 的一甲基砷标准储备液，避光保存于 4冰箱备用。二甲基砷标准储备溶液：准确称取适量的二甲基砷标准品，用5%（v/v）硝酸配制成10-3g/L 的二甲基砷标准储备液，避光保存于 4冰箱备用。砷酸根标准储备溶液：准确称取适量的砷酸根标准品，用5%（v/v）硝