分子技术在糖尿病足感染病原体鉴定中的应用进展.docx

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1、分子技术在糖尿病足感染病原体鉴定中的应用进展谭惠婷1安敏1李青华1李柳然1张桦11南方医科大学珠江医院内分泌代谢科，广州510280通讯作者:张桦,Email:【摘要】目前糖尿病足感染的病原体鉴定主要采取培养法，但由于存在生长缓慢、培养 条件苛刻以及未明确的病原体而易出现假阴性结果，以致抗感染疗效欠佳。近年，分子技术 的进步弥补了传统培养法的不足，让人类进一步认识糖尿病足感染病原体的多样性与复杂 性。现基于国内外已有文献，重点对16s rRNA测序、宏基因组测序、转录组测序三种分子 技术在糖尿病足感染中应用的研究进行总结，并对分子技术指导精准治疗糖尿病足感染的优 势进行分析。【关键词】糖尿病足

2、；病原体；16s rRNA测序；宏基因组测序；转录组测序基金项目：广东省自然科学基金项目（编号2018A； 2019A）Research progress of molecular techniques in the identification of pathogens of diabetic foot infection77777Tan Huiting ,An Min ,Li Qinghua ,Li Liuran .Zhang HuaDepartment of Endocrinology and Metabolism, Zhujiang Hospital of Southern Medic

3、al University,Guangzhou 510280, ChinaCorresponding auther:Zhang Hua, Email:AbstractCurrently, the culture-based method is the main approach to identify pathogens of diabetic foot infection. However, false-negative results are prone to occur because of the existence of slow-growing,fastidious and unk

4、nown pathogens, resulting in poor anti-infective efficacy. In recent years, advances in molecular technologies have overcome many inadequacies of the culture-based method, allowing us to further understand the diversity and complexity of pathogens of diabetic foot infections. This article mainly foc

5、uses on the research of 16S rRNA sequencing, metagenomic sequencing and metatranscriptomics in identification and precise treatment of diabetic foot infection based on existing literature at home and abroad.Key words Diabetic foot; Pathogens; 16S rRNA sequencing; Metagenomic sequencing; Metatranscri

6、ptomicsFund program: Guangdong Natural Science Foundation Project （No.2018A;2019A）根据国际糖尿病联盟（IDF）最新数据显示，2019年因糖尿病或其并发症死亡约占全球 全因死亡的11.3%1o其中，糖尿病足是重要原因之一。Armstrong等学者估计，糖尿病患 者其一生中糖尿病足溃疡的患病率高达19%-34%。糖尿病足溃疡处理不当会发展为糖尿病 足感染，15%的糖尿病足感染患者由于感染的恶化，最终不得不截肢。糖尿病足感染不仅 会影响患者生活质量、降低预期寿命，而且给患者及社会带来沉重的经济负担。因此对于糖 尿病足患

7、者来说，早期诊治、避免感染恶化及慢性化、减少复发较为关键。感染控制不彻底 则是慢性化和复发潜在的导火索，此问题主要归咎于病原微生物鉴定的不足以及缺乏对微生 物群落的全面认识。本文将对国内外现有的糖尿病足感染病原体的鉴定技术进行总结，重点 介绍相关分子技术及其在指导糖尿病足患者抗感染治疗中的优势。一、现有的糖尿病足感染病原体鉴定方法目前应用于糖尿病足感染的病原体鉴定主要包括两大类：培养法及分子技术。前者包括 传统的微生物培养技术及培养组学，后者主要包括16S rRNA测序、宏基因组测序、转录组 测序等。无论是以培养法还是分子技术鉴定糖尿病足感染的病原体，一般急性感染伤口检测 出较单一的微生物，主

8、要以革兰氏阳性球菌为主，特别是葡萄球菌属和链球菌属，而感染较 严重或慢性的糖尿病足感染伤口则定殖较为复杂的微生物菌群，通常混合了需氧细菌及厌氧 菌，容易产生耐药菌或毒力更强的细菌乐支二、培养法（一）微生物培养法众所周知，培养法在初步表征糖尿病足感染的微生物学信息中起到重要作用，是目前临 床上绝大多数研究糖尿病足感染的主流方法，在此不再赘述。培养法具有低成本、操作简易、 技术成熟等优点。但是，培养法在以下几种情况下容易产生假阴性结果，例如：生长缓慢或 培养条件苛刻的致病菌、厌氧菌、未知病原菌以及在接受抗生素治疗的患者中采样等，因此 不一定能真实反映出糖尿病足感染的重要生物学信息或微生物种群的全貌

9、。而且培养法耗 时相对较长，阻碍了敏感性抗生素的及早应用，一定程度上影响患者有效治疗。（-）培养组学培养组学主要使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱以优化培养条件,促进传统培养 法难以培养的病原体生长，通过细菌蛋白质产生独特的“质谱指纹”来识别细菌的种属。 一项关于培养组学的研究显示，从43例中重度糖尿病足患者中分离出的需氧菌主要为金黄 色葡萄球菌（52.8% ）、葡萄球菌（18.7% ）、表皮葡萄球菌（11.3% ）；而粪肠球菌（45.2% ）、 阴沟肠杆菌（22.6%）、奇异变形杆菌（11.3%）和大芬戈尔德菌（9.4%）是最丰富的厌氧 菌，并且88.3%样品是混合性感染。另外，金黄色葡萄

10、球菌与伤口恶化相关，但伤口中某些 凝固酶阴性葡萄球菌（表皮葡萄球菌、沙门氏菌）与伤口愈合有关口”可见，培养组学描绘 相当丰富的细菌多样性，并且加深我们对细菌与宿主之间的认识。但是，此法需要通过质谱 仪分析较大数量的新鲜菌落，存在工作量大和无法进行大样本检测的局限。同时: 由于无法 识别尚未培养成功的微生物，从而造成一定的假阴性结果出现。更重要的是，培养组学不能 像分子技术那样直接提供有关基因表达和细菌潜在功能的数据。三、分子技术（）16S rRNA 测序法16S rRNA基因在细菌进化过程中高度保守，该基因具有9个高度可变的区域（V1-V9）, 不同细菌种群之间具有序列多样性，因此可通过该序列

11、鉴定细菌的特定属或种“。根据 序列的相似程度，通过计算机分析后分为可操作的分类单位（OTU） , OTU相似性为97%或 以上通常被认为属于同一种属水平16S rRNA测序法与传统培养法比较，不仅检出率更高，而且测出更多细菌物种数量。 例如，Dowd等人的研究显示传统细菌培养在55%的患者中显示有革兰氏阳性细菌生长，而 16S rRNA测序则为75%,而嗜冻菌属、厌氧球菌属以及棒状杆菌属只在16S rRNA测序中分 析出来;。同样，Gardner等人的研究也发现培养法极大地低估了微生物负荷和潜在病原体 的存在【均。此外，Banerjee等人将培养法及PCR法鉴定结果为阴性的10个样本以16S

12、rRNA 测序再次鉴定，结果显示其中6个样本存在变形杆菌属、产碱杆菌属、鞘氨醇单胞菌属。国 内胡萍等学者基于16S rRNA测序分析糖尿病足骨髓炎感染的病原微生物，与培养法相比， 16S rRNA测序除了阳性检出率较高、平均每个样本病原菌数较多以外，并且革兰氏阴性菌 所占的比例较高（67.16% vs 50.00% ）,甚至检测出不存在于培养法的菌属高达13种，其 中11种为专性厌氧菌或严格厌氧菌，证实16s rRNA测序更为准确全面，尤其对革兰氏阴性 菌和厌氧菌有显著的优势1。而在鉴定罕见细菌时，16S rRNA测序分析也显示独特的优势。通过16S rRNA测序方法 在糖尿病足中检测到了食酸

13、戴尔福特菌、嗜线虫沙雷氏菌、唾液链球菌、核粒梭杆菌、琥珀 酸杆菌、佩滕科费尔葡萄球菌等培养法较少培养出的菌种。不可忽略的是，16S rRNA测序同样存在一定的局限性。例如：基因的特定区域需要与 相应的引物结合以产生PCR产物，因此引物的应用不足也会导致假阴性结果的出现。此外, 相关性较大的物种之间，高度可变区的多样性会降低，需要设计多个引物组来扩增不同的高 度可变区以减少误差。同时，由于此法是扩增所有DNA,因此无法区分存活和死亡病原体, 以及人线粒体DNA的污染也可能会造成假阳性结果向。最后，16S rRNA测序仅限于测病原 体基因组的单个区域，缺乏对糖尿病足感染机制的认识，如细菌的功能途径

14、、生物膜、毒力 因子、抗菌药敏感性等。（-）宏基因组测序法宏基因组测序利用非靶向测序来测定样品中所有微生物的基因组1电191,能够弥补培养 法和16S rRNA测序法的不足。这种新兴的技术使微生物群落的潜在功能、种群之间的相互 作用更加清晰，甚至对复杂伤口的遗传潜力进行全局表征。随着测序通量的增加和测序成 本的下降，宏基因组测序逐渐在临床上崭露头角。Kalan等研究者利用宏基因组测序法对100例无感染症状的糖尿病足溃疡患者标本进行 分析，在菌株水平研究样本的微生物群落，并鉴定微生物的毒力和致病性。这项研究显示, 糖尿病足患者中最丰富的细菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、纹带棒杆菌和粪便产碱杆

15、菌，此外还有疏螺旋体属、产酸克雷伯菌、不解糖吓咻单胞菌等少见物种。为了分析糖尿病足感染微生物组的基因功能，研究者通常利用SEED数据库口以预测微 生物的作用途径，Kalan的研究表明：较深且氧合不良的伤口与微生物高代谢密切相关，包 括荚膜、细胞外多糖和糖酵解的产生等。创面的不愈合及严重性与金黄色葡萄球菌菌株相关 联，且首次提出金黄色葡萄球菌7372和金黄色葡萄球菌10757菌株是糖尿病足溃疡的优势 菌株，通过基因组比对分析显示，两者以不同的噬菌体依赖性方式控制毒力相关的基因座。 金黄色葡萄球菌7372株还富含与免疫逃逸相关的不同毒力因子、扩散感染的葡萄球菌激酶、 抑制人类免疫调理作用和吞噬作用

16、的sen基因等致病因子。然而，葡萄球菌肠毒素02、肠 毒素A则为金黄色葡萄球菌10757株所独有的L正是基于基因组检测出致病菌的多样化 导致不同的宿主反应和临床结果。宏基因组测序虽能提供样本中微生物群落基因的“全景图但它无法区分基因是表达 还是沉默，因此可能会造成假阳性结果，对结果分析造成一定的干扰。另外，宏基因组测序 产生巨大而复杂的数据库，可多达数百Gb的数据序列，而回收的DNA序列是片段性的，因 此在宏基因组测序数据中发现新的非编码RNA （neRNA）和核糖开关比在单个基因组中更加 困难网。（三）转录组测序法转录组测序法是利用样品中分离出的mRNA挖掘群落中活性基因的多样性及表达谱。

17、转录组测序已经成为一种研究代谢活性菌群和宿主微生物转录组的更加精确的技术，能识别 基因表达的生物特征，同时避免了微阵列的基因鉴定、交叉杂交、背景噪声等缺点阿。KaiP Leung等人对感染肺炎克雷伯菌或铜绿假单胞菌的伤口进行转录组分析发现伤口周围细胞 的特异性转录产物的下调以及浸润性白细胞特征转录物的上调，这些特异性转录产物可作为 伤口愈合不良或伤口特异性治疗的标志物阿。Kama等人发现伤口从感染到愈合的过程中， 不同类别的neRNA的调节遵循连续且协调的模式，该研究评估了伤口在对抗铜绿假单胞菌 感染时的转录组变化，在伤口接种细菌后的2小时，伤口边缘下调的基因包括几乎所有的 neRNA （包括

18、snoRNA, miRNA）和RNU6假基因，这些下调先于皮肤富集的编码基因表达的 下调。但随着感染的加剧，在下调的基因中，neRNA的表达仍然过多。感染5天和9天后， 对照组neRNA数量减少，而仍存在感染或愈合欠佳的伤口 neRNA数量增加另外，值得注意的是蛋白组学在病原体鉴定方面也能识别基因表达的生物特征。虽未见 使用蛋白组学对糖尿病足病原体鉴定以及其致病机制的研究，但有Klein. Rianey等人利用 蛋白组学解释口腔疾病中变形链球菌的致病机制区29,表明蛋白组学在研究病原体致病方 面具有一定的潜力。目前，关于糖尿病足感染方面尚未有将宏基因组测序与转录组测序或蛋白质组学结合使 用的研

19、究报道。但Lassek等研究者将宏基因组测序与蛋白质组学分析结合起来，很好地分 析生物膜相关的尿路感染的致病机制。通过宏基因组测序进行群落分析，铜绿假单胞菌和摩 根氏摩根菌均被鉴定为主要微生物。蛋白质组学分析随后在功能水平上明确铜绿假单胞菌上 调了参与红细胞降解、铁载体系统、生物膜、抗生素耐药和致病性等相关的蛋白质形成皿。 另外，蛋白组学数据的质量与宏基因组学分析的质量密不可分，蛋白组学需要根据宏基因组 学来预测蛋白质数据库。可见，宏基因组发挥优势的同时，若结合其它分子技术（如转录组 学、蛋白质组学）研究糖尿病足感染，可能会达到事半功倍的效果。四、基于分子技术对糖尿病足感染进行精准治疗目前糖尿

20、病足的抗菌治疗主要依赖药敏试验，一般采用细菌培养或基于PCR的方法，但 这两者仅限于常见的细菌和抗生素，且采样和运送过程也会极大地影响结果皿。使用宏基因 组学鉴定糖尿病足的病原体耐药基因可以克服以上局限性，并提供有关耐药的所有基因信息 3lo Kalan等人进行的宏基因组测序研究表明超过50%的样本含有氨基糖昔、大环内酯、0- 内酰胺、四环素类的耐药基因，其中金黄色葡萄球菌10757菌株含有大环内酯类、四环素和 氨基糖昔类耐药基因，这可能解释糖尿病足溃疡中多药耐病原体的增加31。宏基因组测序 仅表明存在编码耐药的基因，而转录组测序可以帮助我们了解耐药基因的表达与否。如Hall 等研究者利用转录

21、组测序技术，鉴定了 PA3225调控的基因产物（如ABC转运蛋白PA3228）, 发现其可能与铜绿假单胞菌抗生素耐药性有关血。更重要的是这些分子技术可以帮助我们对 新耐药细菌在临床出现之前进行预测。糖尿病足抗感染的精准治疗，除了确保抗生素的有效性外，常常被忽视的是使用抗生素 的必要性。欧洲伤口管理协会已禁止对未感染的伤口使用抗生素网，但临床工作中，以防发 生感染或为了促进伤口愈合，临床医生经常对未感染的糖尿病足溃疡患者也使用不同种类的 抗生素。这无疑加剧了耐药菌株甚至多耐药的“超级细菌”的出现。Messad等人通过基因 组比对发现一个有趣的现象：含有ROSA样噬菌体的金黄色葡萄球菌菌株并无毒性

22、，这可能 解释了该细菌在慢性糖尿病足伤口中的定殖能力以及它们与宿主的共生关系。该研究建议我 们尽可能利用有效的方法检测慢性伤口中是否存在增加或降低细菌毒力的噬菌体，以明确使 用抗生素的必要性未来分子技术将会在糖尿病足抗感染的精准治疗上提供更多有力证 据，做到因“证”施药，有充分且必要的证据才合理、准确应用抗生素。五、总结与展望分子技术让我们对糖尿病足感染的微生态也有了更广阔的认识，尤其是罕见的、培养条 件苛刻的病原体。然而，目前国内关于分子技术在糖尿病足感染中的应用较少，仅有个别的 样本量较小的临床研究，其中有以下几个客观原因：1.相比传统培养法花费高；2.测序技术 要求高；3.对测序结果的解

23、读需要较强的专业知识；4.目前数据库仍需进一步完善。另一方 面，也存在一定的主观因素：我们对分子技术的认识不够深入，仅将分子技术作为一种科研 工具。随着高通量测序技术的出现和测序成本的下降，临床医生认识微生物的方法不能局限 于传统的培养法，应合理利用分子技术进行更多更完善的系统性临床研究，为梳理糖尿病足 宿主与病原体错综复杂的关系、发现更有效的抗感染方法等提供更全面可靠的依据、以提高 糖尿病足感染的治愈率，减少复发率。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献1 IDF_Atlas_9th_Edition_2019 Available online:J.2 DG A, AJM B, SA B

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