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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。基因工程作业题及答案-第二章1.名词解释：核酸内切酶、核酸内切限制酶、同裂酶、同尾酶、核酸外切酶、末端脱氧核苷酸转移酶答：核酸内切酶：是一类从多核苷酸链的内部催化磷酸二酯键断裂的酶。核酸内切限制酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。核酸外切酶：是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。末端脱氧核苷酸转移酶：可以不需要模板，在单链DNA或突出的双
2、链DNA3-OH端随机添加dNTPs的酶2.限制性内切核酸酶的命名原则是什么？答：限制性内切核酸酶按属名和种名相结合的原则命名的，即：属名+种名+株名+序号；首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母：取种名的第一个字母，斜体小写；第三字母：(1)取种名的第二个字母，斜体小写；(2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、等，用正体。3部分酶切可采取的措施有哪些？答：1）缩短保温时间2）降低反应温度3）减少酶的用量4.在序列5-C
3、GAACATATGGAGT-3中含有一个6bp的类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么?答：回文序列是：5-CATATG-3，5什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影响?答：类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星活性。概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(5,vv)；(2)限制性内切核酸酶用量过高(100Uug
4、DNA)；(3)低离子强度(25mmolL)；(4)高pH(80以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。第三章1如何将野生型的l噬菌体改造成为一个理想的载体?答：删除l噬菌体的非必需区，留出插入空间；并在余下的非必须区内制造限制酶切点引进某些突变表型，作为选择标记突变某些基因，使它成为安全载体删除lDNA必须区段上常用的限制酶切点2什么是蓝白斑筛选法?答：这种方法是根据互补的原理来筛选重组体。主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌b半乳糖苷酶的基因片段（LacZ），携带有lac基因片段的载体转入Lac
5、Z的宿主菌后，在IPTG（异丙基硫代-D半乳糖）诱导下，载体表达的b半乳糖苷酶的肽段和宿主菌表达的b半乳糖苷酶的b肽段互补，形成有活性的b半乳糖苷酶，该酶可以分解无色的5溴4氯3引哚bD半乳糖苷(X-gal)得到蓝色的5溴4氯靛蓝，因此在含有X-gal平板上形成浅蓝色的菌斑。外源基因插人LacZ(或LacZ基因部分被取代)后，重组的克隆将丧失分解X-gal的能力，在含有X-gal的平板上形成白色的菌斑，非重组的克隆则为蓝色菌斑。3M13系列载体具有哪些优缺点?答：（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2）Xgal显色反应，可供直接选择（3）可以克隆双链DNA分子中的每一条链4辅助噬菌体DNA
6、和相应的噬菌粒是如何协同工作的?答：虽然噬菌粒载体携带有M13的IG区，能够合成单链DNA，但是它没有M13的功能基因，没有M13基因2的产物存在，所以不能合成单链DNA。而辅助噬菌体具有M13的所有功能基因，但是IG区是缺陷的，辅助噬菌体本身的DNA不能进行单链复制，于是就可以为噬菌粒提供基因2产物和包装蛋白。5某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一BglI的切点。现用BglI切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体?答：(1)加四环素；(2)Te
7、trKans和TetrKanr；(3)重新点种在含Tet、Kan和只加Tet的平板上，选择只在Tet平板上生长的菌落，即为所需的重组体。第四章1.目的基因的获取方法有哪些？各有什么优缺点？答：1）鸟枪法克隆：优点是可以随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段；缺点是工作量较大，需要了解目的基因的背景知识，不能获得最小长度的目的基因，不能除去真核生物目的基因的内含子结构2）cDNA法：优点是能获得最小长度的目的基因能除去真核生物目的基因的内含子结构；缺点是仅限于克隆mRNA分子具有polyA结构的蛋白质编码基因mRNA分离纯化困难3）PCR法：优点是高效快速的体外合成目的基因；缺点是已知待扩增目的基
8、因或DNA片段两侧的序列4）化学合成法：优点是适于合成引物、接头等多种DNA短片段；缺点是必须已知基因的DNA序列，直接合成较大的基因成本较高2.什么是基因组文库(genomiclibrary)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?答：基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作为载体，包括下列过程：(1)高分子量染色体DNA的制备；(2)体外重组连接；(3)包装蛋白的制备；(4)重组体的体外包装；(5)将重组DNA导人寄主细胞；(6)筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基
9、因库(genepool)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。3.什么是cDNA文库(complementDNAlibrary)?同基因组文库有何差别?答：同mRNA互补的DNA称为cDNA。cDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成一互补的DNA,即第一链，破坏RNA模板后，再以第一链为模板合成第二链，得到的双链DNA称为cDNA。选用适合的载体，将合成的cDNA重组导人寄主细胞，经筛选得到韵cDNA克隆群称为
10、cDNA文库。由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的，具有发育的阶段性和时间性有些则需要特殊的环境条件。所以，cDNA文库是不可能构建得十分全，也就是说任何一个cDNA文库都不可能包含某生物全部编码基因。第五章1.你在做Southern印迹分析，为了节省时间，你电泳后直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上，然后用标记探针杂交，最后发现放射自显影片是空白。错在哪里?答：错在电泳后直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上，而没有先将凝胶中的DNA变性成为单链，从而导致目标DNA未能与探针杂交；另外如果你的杂交探针是双
11、链的，在加人杂交混合物之前忘记将探针变性也可能得到空白的放射自显影结果。2什么是Western印迹?它与Southern印迹有什么不同?答：Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)，而Southern印迹中使用的探针是核酸（DNA或RNA）。3.蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性?答：b半乳糖苷酶的N末端是非必需的，可以进行修饰，并不影响酶的活性或a肽的互补性。如果插入的外源DNA引起a肽的可读框的改变，或者插入片段在正确的可读框中含有终止密码的话，
12、就会形成白色噬菌斑。如果插入DNA的碱基数正好是3的倍数，且不含有终止密码的话，仍然会形成蓝色噬菌斑。这种插入物的长度可达几百个碱基对。4.重组体克隆的筛选和鉴定方法有哪些？答：1）载体表型选择法2） 根据插入基因的表型选择3） DNA电泳检测法4） 核酸杂交检测法5） 免疫化学检测法转译筛选法第六章1如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因，并使之在大肠杆菌中进行表达?简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。答：要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达，通常遇到的问题有：(1)细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。(2)大多数真核基因有内含子，这些内含子在转录后从
13、前体mRNA中被切除而形成成熟mRNA。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分于加工而来的，例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的33个氨基酸残基而来，剩下的两段肽链分别形成胰岛素的a、b链。(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。针对上述可能出现的问题，建议在克隆的过程中采取以下措施：应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG的细菌强启动子的附近(含有这种序列的载体称表达载体)。可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基因。这种DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外，如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到
14、该基因。合成的基因应含起始密码ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列，以及12个终止密码：ATG编码序列TGATAG现在，这个合成基因可被插入载体中。有时加工过程可以在离体条件下进行。如果加工有困难，可以用合成基因，从而免除加工过程。选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解。如果用酵母作为宿主上述许多问题都可以较容易地解决，尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。说明：1)ATG,TAG和TGA是对应mRNA中的转录起始信号AUG和终止信号UAG,UGA的DNA序列。2)克隆生长素释放抑制因子基因时采用化学合成基因的方法。生长索释放抑制因子是一种由下丘脑分泌的激素，长14个氨基酸残基，因此人工合成的基因，包括在宿主菌中表达所需的转录的起始和终止信号，仅51bp长。-