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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。功能食品实验指导-功能食品评价原理与方法实验报告要求：一、要有封皮1课程名称，2姓名，3班级二、A4纸打印，左侧装订三、目录，项目如下：1.小鼠的捉持、给药、灌胃方法2.小鼠的麻醉、取血、处死方法3.小鼠的解剖实验4.急毒实验(LD50)5.抗疲劳作用实验6.抗肝损伤实验四、按照项目名称内容写报告五、原始数据进行整理，统计学处理，给出结论六、按照学号排序七、备注：抗疲劳作用实验用的保健品为氨基酸复合液，抗肝损伤实验（清舒宁胶囊）请按照实际药品内容写报告，与后面给的东方红豆的抗疲劳作用的实验研究，克劳可（
2、东方红豆）对CCL4诱导小鼠急性实验性肝损伤的保护作用的实验步骤基本一致实验1、鼠的抓取方法（一）小鼠一般不会咬人，但取用时动作也要轻缓。先用右手抓住鼠尾提起，放在实验台等粗糙表面，在其向前爬行时，用左手的拇指和食指抓住小鼠的两耳和头颈部皮肤。然后将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，用左手的无名指及小指按住尾巴和后肢，前肢可用中指固定，即可作注射或其他实验操作。（如图11小鼠抓取方法）实验2、小鼠的给药途径和方法使用注射器和吸取药液时的注意事项：1、注射器必须洗净，针头要尖锐、通气，大小合适。一般小鼠皮下、腹腔、肌肉注射用5.5-6号针头，静脉注射用4.5号或5号针头，口服灌胃用16号针头；大鼠所
3、用的针头均大1号，灌胃用静脉切开针；家兔与大鼠所用针头可相同。2、将针头的口用手指堵住，轻轻抽拉针栓，检查针头与针筒是否有漏气现象。3、先计算需用药量，再吸取药液。4、注射前需排除气泡，调整药液至准确的用量。5、注射器一般应平拿，否则需用手指轻扶针栓，以防滑落打碎或进入空气。21排除空气方法注射针在消毒前注意检查：1、针管与基部连接处，用手拉拔，不应有松动现象。2、针的刃口，用手指接触，不应有毛刺。3、注射针经使用后，发现针头严重弯曲，应捡出不宜继续使用。4、注射针套在注射器的接头上，经过90度旋转紧紧套上。当压缩注射器内液体时，应不漏水。（三）腹腔注射狗、猫、兔等动物腹腔内注射，可由助手抓住
4、动物，使其腹部向上，在腹部下1/3处略靠外侧（避开肝和膀胱）将注射器针头垂直刺入腹腔，然后将针筒回抽，观察是否插入脏器或血管，在准确断定已插入腹腔时，可固定针头，进行注射。大鼠、小鼠一般一人即可注射：以左手大拇指与食指执住鼠两耳及头部皮肤，腹部向上，将鼠固定在手掌间，必要时，以左手无名指及小指夹住鼠尾；右手持连有5号针头的注射器，将针头从下腹部朝头方向刺入腹腔，回抽无回血或尿液，表示针头未刺入肝、膀胱等脏器，即可进行注射。进行腹腔注射时应注意：1、针头刺入部不宜太近上腹部或太深，以免刺破内脏。2、针头与腹腔的角度不宜太小，否则容易刺入皮下。3、用的针头不要太粗，以免药液注射后从注射孔流出。注射
5、后用棉球按一下注射部位。4、为避免注射后药液从针孔流出，也可在注射时先使针头在皮下向前推一小段距离，然后再刺入腹腔。25小鼠腹腔注射方法实验3、小鼠灌胃给药法胃内注入方法（灌胃给药法）1、大鼠、小鼠用左手拇指和食指抓住鼠两耳和头部皮肤，其他三指抓住背部皮肤，将鼠抓持在手掌内，固定好动物，右手取注射器进行灌胃。所用针头小鼠为12号针头改制，大鼠用静脉切开针或兽用注射针改制。灌时针头沿鼠口角通过食管进入胃内，然后将药液灌入胃内。灌时如很通畅，则表示针头已进入胃内；如动物有呕吐动物或强烈挣扎，则表示针头未插入胃内，必须拔出后按上述方法重新操作。其要点在于动物要固定好，头部和颈部保持很平；进针方向正确
6、，一定要沿着右口角进针，再顺着食管方向插入胃内，决不可进针不顺硬向里插，否则会注入肺内，造成死亡。31大鼠灌胃方法32小鼠灌胃方法实验4、鼠的取血方法大鼠、小鼠1、尾静脉使鼠尾静脉充分充血后，用剪刀剪去尾尖，尾静脉知即可流出，用手轻轻从尾根部向尾尖部挤几下，可以取到数滴血。2眼眶动脉和静脉用左手抓住鼠，拇指和食指尽量将鼠头部皮肤捏紧，使鼠眼球突出。右手取一无钩弯小镊，在鼠右侧眼球根部将眼球摘去，关将鼠倒置，头向下，此法由于取过程动物未死，心脏不断在跳动，因此取血量比断头法多，一般约可取出4-5%鼠体重的血液量。127切破鼠尾静脉方法127切破鼠尾静脉方法128鼠尾静脉取血方法3后眼眶静脉丛连续
7、穿刺穿刺部位是在眼球和眼眶后界之间的后眼眶静脉丛。采用特制的硬玻璃吸管，管长15厘米，前端拉成毛细管。取血时，用手从背部捉住动物，同时用食指和拇指握住颈部，利用对颈部所加的轻压力，使头部静脉淤血，将消毒的吸管用抗凝剂湿润其内壁，从内侧眼角将吸管转向前，并轻压刺入，深约4-5mm就达到后眼眶静脉丛，血液自然进入吸管内。在得到所需血量后，除去加于颈部的压力，同时抽出吸管。129小鼠后眼眶静脉丛取血方法130大鼠后眼眶静脉丛取血方法4断头用大鼠断头器或粗剪刀在鼠颈部将鼠头剪掉，实验者立即将鼠颈向下，提起动物，对准准备好的容器，鼠血即可从颈部滴入容器内。如图1315心脏左手固定鼠，在左侧第3-4肋间，
8、用左手食指摸到心搏，右手取注射器选择心搏最强处穿刺。如图132131小鼠断头取血方法132小鼠心脏取血方法6颈静脉作一般颈外静脉分离手术。颈静脉暴露楚后，用注射器针头沿静脉平行方向刺入，抽取所需血量，采用此法取血，体重20克的小鼠可取0.6ml左右，体重300克的大鼠可取血8ml左右。133大鼠颈静脉取血方法实验5、生理学实验动物鼠的处死方法大鼠、小鼠1、脊椎脱臼法：右手抓住鼠尾用力向后拉，同时左手拇指与食指用力向下按住鼠头。将脊髓与脑髓拉断，鼠便立即死亡。135小鼠颈椎脱臼方法2、断头法用剪刀在鼠颈部将鼠头剪掉。详细方法可参考大、小鼠断头取血方法。鼠由于剪断了脑脊髓，同时大量失血，很快死亡。
9、3、击打法右手抓住鼠尾，提起，用力摔击其头部，鼠痉挛后立即死去。4、急性大失血法可采用鼠眼眶动脉和静脉急性大量失血方法使鼠立即死亡。实验6、小鼠的解剖实验一、生理学实验动物的麻醉方法（一）使用挥发性麻醉药1乙醚、吗啡合并麻醉方法乙醚麻醉的优点：深度易于掌握，比较安全，麻醉后恢复比较快。缺点：需要专人管理，麻醉初期出现强烈的兴奋现象，对呼吸道有较强的刺激性，需在麻醉前给一定量的吗啡和阿托品（基础麻醉）。通常在麻醉前20-30分钟，皮下注射盐酸吗啡或硫酸吗啡（每公斤体重5-10毫克）及阿托品（每公斤体重0.1mg）2氯仿、乙醚合并麻醉方法氯仿作吸入麻醉药，其麻醉作用比乙醚大，诱导期及兴奋期都极短，
10、吸入气体中含1-2%容量的氯仿即能使动物麻醉，达到外科麻醉期容易，但也易转入延髓麻醉期而危及生命。其麻醉剂量及致死量较为接近，使用时应加以注意。一般与乙醚混合成1：1或1：2比例进行麻醉。麻醉方法基本同乙醚。（二）使用非挥发性麻醉药1苯巴比妥钠：该药作用持久，应用方便，在普通麻醉用量下对动物呼吸、血压和其他功能无多大影响。通常在实验前0.5-1h用药。使用剂量和方法为狗、猫腹腔注射80-100mg/kg，静脉注射70-120mg/kg；家兔腹腔注射150-200mg/kg。2戊巴比妥钠：此药麻醉时间不很长，一次给药有效时间可延续3-5小时，所以十分适合一般实验要求。给药后对动物循环和呼吸系统无
11、显著抑制作用。用时配成1-3%生理盐水溶液，配好的药液的常温下放置1-2个月不失药效。静脉或腹腔注射后很快进入麻醉期。使用剂量为：狗、猫、兔静脉注射30-35mg/kg，腹腔注射40-45mg/kg，皮下注射40-50mg/kg。大小鼠静脉或腹腔注射35-50mg/kg.3氨基甲酸乙酯：此药是比较温和的麻醉药，安全程度大。多数动物都可以使用，更适合于小动物。一般作基础麻醉。使用时常配成20-25%水溶液。狗、猫、兔直肠灌注1.5g/kg，皮下、静脉、腹腔注射0.75-1g/kg。与水合氯醛按1：1合并麻醉效果更好。缺点是该药可致癌，大型动物应用后不可食用。4水合氯醛：此药有窜透性的臭气及腐蚀性
12、苦味。其溶解度较小，常配成1%水溶液。使用前先在水浴锅中加热，促其溶解，但加热温度不宜过高，以免影响药效。使用剂量及方法：狗、猫静脉注射80-100mg/kg体重；腹腔注射100-150mg/kg；兔：直肠灌注180mg/kg；静脉注射50-75mg/kg。以上麻醉药种类虽较多，但各种动物作用的种类多有所侧重，如作慢性实验的动物常用乙醚吸入麻醉（用吗啡和阿托品作基础麻醉）；包性动物实验对狗、猫和大鼠常用戊巴比妥钠麻醉；对家兔和蛙、蟾蜍常用氨基甲酸乙酯；对大鼠和小鼠常用硫喷妥钠或氨基甲酸乙酯麻醉。（三）使用全身麻醉剂的注意事项1、麻醉剂的用量，除参照一般标准外，还应考虑个体对药物的耐受性不同，而
13、且体重与所需剂量的关系并不是绝对成正比的。一般说，衰弱和过胖的动物其单位体重所需剂量较小。在使用麻醉剂过程中，随时检查动物的反应情况，尤其是采用静脉注射，绝不可将按体重计算出的用量匆忙进行注射。2、动物在麻醉期体重容易下降，要采取保温措施。3、静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张性、角膜反射和对皮肤夹捏的反应，当这些活动明显减弱或消失时，立即停止注射。配制的药液浓度要适中，不可过高，以兔麻醉过急，但也不能过低，以减少注入溶液的体积。4、做慢性实验时，在寒冷的冬季，麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平。（四）麻醉过量的处理方法麻醉过量时，应按过量的程度采取不同的处理方法。如动物呼吸极慢而不规则，但血
14、压和心搏仍正常时，可施行人工呼吸（人工呼吸机），并给苏醒剂（常用的苏醒剂有咖啡因、苯丙胺、尼克刹米等）。若动物呼吸停止，血压下降，但心搏仍可摸到时，应迅速施行人工呼吸，同时注射50%温热的葡萄糖溶液5-10ml，并给肾上腺素和苏醒剂。若动物呼吸停止，心搏极弱或刚停止时，应用5%CO2和60%O2的混合气体进行人工呼吸，同时注射温热葡萄糖溶液、肾上腺素和苏醒剂，必要时打开胸腔直接按摩心脏。（五）动物局部麻醉方法1、普鲁卡因：1%溶液，局部浸润麻醉。2、利多卡因：2%溶液，局部浸润麻醉。3、的卡因：表面麻醉。（六）实验动物用药量的确定和计算方法1实验动物用药量的计算方法动物实验所用的药物剂量，一般
15、按毫克/公斤或克/公斤体重计算，应用时须从已知药液的浓度换算出相当于每公斤体重应注射的药液量（毫升数），以便给药。2人与动物的用药量换算方法人与动物对同一药物的耐受性是相差很大的。一般说来，动物有耐受性要比人大，也就是单位体重的用药量动物比人要大。人的各种药物的用量在很多书上可以查到，但动物用药量可查的书较少，而且动物用的药物种类远不如人用的那么多。因此，必须将人的用药量换算成动物的用药量。一般可按下列比例换算：人用药量：1小鼠、大鼠：50-100兔、豚鼠：15-20狗、猫：5-10以上系按单位体重口服用药换算。如给药途径为静脉、皮下、腹腔注射，换算比例应适当减小些。有人介绍狗和猴剂量比人大1
16、0-20倍，小鼠、大鼠剂量比人大25-30参考进行换算。二、小鼠的解剖实验1切开皮肤实验7克劳可（东方红豆）对CCL4诱导小鼠急性实验性肝损伤的保护作用实验前准备工作（生理学实验动物分组及编号的标记方法）科学研究中为了观察每个动物的变化情况，就必须在实验前进行随机分组和编号标记。（一）分组实验动物的分组原则为按照性别、体重进行随机平均分组。一般小型动物（如小鼠、大鼠、豚鼠等）为每组10只，大型动物如兔、狗、猫等可酌减，每组4-6只。如实验方法另有规定者除外。（二）编号的标记方法1大鼠、小鼠常采用化学药品涂染法。经常应用的涂染化学药品有：涂染红色：0.5%中性红或品红溶液；涂染黄色：3-5%苦味
17、酸溶液；涂染黑色：煤焦油的酒精溶液。实验目的：研究克劳可（东方红豆）对CCL4诱导小鼠急性实验性肝损伤的保护作用。实验步骤：取60只实验小鼠，按性别和体重随机分为6组：空白对照组、CCL4模型组、中药对照组（护肝胶囊1.8g.kg-1）、克劳可（东方红豆）高、中、低剂量组（分别含生药3、1.8、0.6g.kg-1）。实验室饲养2天后，按上述剂量灌胃给药，给药容积为0.2ml.10g-1，每日一次，空白对照组和模型组给予等体积蒸馏水，连续6天。第6天于给药1h后，各剂量组小鼠0.1%的CCL4一次性口服，空白组给予等体积蒸馏水，禁食不禁水。16h后，各组小鼠眼眶取血，分离血清。按试剂盒说明书步骤
18、测定各组小鼠血清中GPT和GOT的活性,结果以U(106cell)-1表示。组名注射药品剂量ALT（u/l）空白组蒸馏水0.2ml/10g36.2+8.56阴性对照组0.1%CCL溶液0.1ml/10g43.3+8.6阳性对照组保肝剂5mol/L0.2ml/10g36.4+7.4实验组(1)东方红豆3%0.2ml/10g34.2+5.4实验组(2）东方红豆5%0.2ml/10g35.8+2.3实验组（3）东方红豆8%0.2ml/10g36.3+4.3注解：正常小白鼠体内谷丙转氨酶含量为1642u/l结论：东方红豆具有抗肝损伤的疗效，剂量在5%时疗效最好。实验9东方红豆的抗疲劳作用的实验研究实验
19、目的：研究东方红豆的抗疲劳作用实验步骤：将实验动物随机分组成四组，雌雄各半，每组10只。空白对照组及高、中、低三个给药剂量组，剂量分别为：2.0g/kg、1.0g/kg、0.5g/kg。空白对照组每日灌胃给予生理盐水0.2ml/10g，连续给药10天；柞蚕蛹虫草粉三个剂量组均为每日灌胃给药，连续10天。10天后对各组进行抗疲劳实验：1）小鼠游泳实验末次给药30min后进行小鼠游泳实验，使小鼠负荷是小鼠体重的0.5，放入水深40厘米、水温301的缸中，迫使小鼠进行游泳挣扎，记录各个小鼠自开始游泳至体力耗竭下沉6秒内不再浮出水面这段时间，作为小鼠游泳时间。2）生化指标测定小鼠捞起烘干后（眼周皮毛沾
20、水无法取血），拔眼球取血，4000rpm离心10min,按试剂盒要求测定乳酸脱氢酶的活性。抗疲劳作用的评价标准与空白对照组相比：1）负重游泳时间长；2）乳酸脱氢酶值高。且差异有显著性，则可判断为受试物有抗疲劳作用。实验10、急性毒性实验LD50的测定预试验：目的是找出0及100估计致死量。更确切地说是找到个0死亡的最大剂量和100死亡的最小剂量的估值以决定实验中采用的最大剂量(Dm)和最小剂量(Dn)，这在测定中非常重要，是实验成败的关键。可用雌或雄性动物，设四组以上，每组3-4只，先用1；10的剂量比给药(如5mgkg、50mgkg、500mgkg、5000mgkg固定剂量)。观察7日，记录
21、死亡动物数。然后在死亡数44和04两组之间按1；2(如50mg/kg、100mg/kg、200mgkg、400mgkg)以下的剂量比进行重复试验，以此测得近似的0和100死亡率。正式试验：在预试验Dn和Dm剂量范围内按等比设三个以上剂量组，其组间剂量的比值，一般在1：06至1：09范围内。购入动物试验前应驯化1星期，随机或按体重分组，每组10只以上，雌雄各半，分别编号，给药前应禁食(不禁水)过夜。各给药组和溶剂对照组按体重给药后，试验当日应多次观察，第二日至最后日应每日有二人以上同时观察1次并及时详细记录毒性反应症状，症状出现和消失的时间，死亡时间，第七日全部动物测量体重处死并剖检，肉眼观察病变情况。有毒性反应、体重减轻或脏器有病变的动物应在剖检后，立即进行主要脏器的病理组织学观察。LD50和最小致死量及其可信限的记算可采用Bliss法，改进寇氏法、点斜法、简化概率单位法或其他的计算方法。记算结果对比表明，不同的记算方法，结果间一般无明显差异，而不同实验室对同一样品试验结果却常见有显著差异。因此，采用较简单的计算方法完全以满足LD50计算的准确性。-