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1、大鼠皮质醇(Cortisol)酶联免疫分析试剂盒使用说明书厦门慧嘉生物科技有限公司本试剂盒仅供体外讨论使用！预期应用ELISA法定量测定大鼠血清、血浆或其它相关生物液体中皮质醇(Cortisol)含量。试验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗皮质醇(Cortisol)抗体的微孔中依次 加入标本或标准品、生物素化的抗皮质醇(Cortisol)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤 后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终 的黄色。颜色的深浅和样品中的皮质醇(Cortisol)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定 吸光度(0D值)，计算样
2、品浓度。试剂盒组成及试剂配制1 .酶联板：一块(96孔)2 .标准品(冻干品)：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml ,盖好后静置10分钟 以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为180 ng/ml ,做系列倍比稀释(注：不要直接 在板中进行倍比稀释）后，分别稀释成180 ng/ml ,90 ng/ml ,45 ng/ml ,22.5 ng/ml ,11.25 ng/ml , 5.63 ng/ml , 2.82 ng/ml ,样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml ,临用前15分 钟内配制。如配制90 ng/ml标准品：取0.5ml （不要少于0.5ml） 180 ng/ml的上述标准
3、品 加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。3 .样品稀释液：1x20ml。4 .检测稀释液A: 1x10ml。5 .检测稀释液B : 1x10mL6 .检测溶液A : lxl20|jl（ 1:100 ）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前依据预先 计算好的每次试验所需的总量配制（100W/孔），实际配制时应多配制e如lOpI 检测溶液A加9903检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。7 .检测溶液B : 1x1203/瓶（I。）临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同 检测溶液A。8 .底物溶液：1x10ml/瓶。9
4、 .浓洗涤液：1x30ml/瓶，使用时每瓶用蒸储水稀释25倍。10 .终止液:1x10ml/瓶（2N H2so4 11 .覆膜：5张12 .使用说明书：1份1.1.酶标仪(建议参考仪器使用说明提前预热)2.微量加液器及吸头，EP管3.蒸储水或去离子水，全新滤纸标本的采集及保存1 .血清：全血标本请于室温放置2小时或4(过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清 即可检测，或将标本放于-2(rc或-8(rc保存，但应避开反复冻融。2 .血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8 1000 x g离 心15分钟，或将标本放于-2CTC或-8CTC保存，但应避开反复冻融。3
5、.细胞培育物上清或其它生物标本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将 标本放于-2CTC或-8CTC保存，但应避开反复冻融。注：以上标本置4。(:保存应小于I周，2(rc或-8(TC均应密封保存，2(rc不应超过i 个月，80。(:不应超过2个月；标本溶血会影响最终检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检 测。操作步骤试验开头前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37（溶解）；试剂或样品稀释时, 均需混匀，混匀时尽量避开起泡。试验前应猜测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进 行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。1 .加样：分别设空白孔、标准
6、孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100川，余孔分别 加标准品或待测样品lOOpI ,留意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔 壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37乙反应120分钟。为保证明验结果有效性，每 次试验请使用新的标准品溶液。2 .弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液lOOpI （在使用前一小时内配 制），酶标板加上覆膜,37V反应60分钟。3 .温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约4003/ 每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干X4 .每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）lOOpI ,酶标板加上覆膜37。（：反应
7、60 分钟。5 .温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350川/每孔, 甩干（也可轻拍将孔内液体拍干X6 .依序每孔加底物溶液90川，酶标板加上覆膜37（避光显色（30分钟内，此时肉眼可 见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止X7 .依序每孔加终止溶液50kli，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入挨次应尽量与底物液的加入挨次相同。为了保证明验结果的精确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。8 .用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（0D值%在加终止液后马上进行检 测。注：1 .试剂预备：全部试剂都必需在使用前达到室温，使
8、用后请马上依据说明书要求保存试 剂。 试验操作中请使用一次性的吸头，避开交叉污染。2 .加样：加样或加试剂时，请留意在吸取标本/标准品，酶结合物或底物时，第一个 孔与最终一个孔加样之间的时间间隔假如太大，将会导致不同的预孵育时间，从而明显 地影响到测量值的精确 性及重复性。一次加样时间（包括标准品及全部样品）最好掌握 在10分钟内，如标本数量多，推举使用多道移液器加样。3 .孵育：为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖 或覆膜，以避开液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避开酶标板处于干燥 状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。4 .洗涤:洗涤过程中反
9、应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入 反应孔中吸水，同时要消退板底残留的液体和手指印，避开影响最终的酶标仪读数。5 .试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使 管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请精确配置标准品及工作液，尽量不 要微量配置（如吸取检测溶液A时，一次不要小于10pl ）,以避开由于不精确稀释而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。6 .反应时间的掌握：加入底物后请定时观看反
10、应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟）, 如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避开反应过强从而影响酶标仪光密度读数。7 .底物：底物请避光保存，在储存和温育时避开强光直接照耀。建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的精确性。如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最终乘以稀释倍数。洗板方法1 .手工洗板方法：吸去（不行触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在试验台上铺垫几层 吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推举的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟, 依据需要，重复此过程数次。2 .自动洗板：假如有自动洗板机，应在娴熟使用后再用到正式试验过程中。特异性本试剂盒可同时检测重
11、组或自然的大鼠皮质醇（Cortisol）,且与其它相关蛋白无交叉反 应。计算以标准物的浓度为纵坐标（对数坐标）,0D值为横坐标（对数坐标）,在对数坐标纸上绘 出标准曲线。推举使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3，依据样品的0D 值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与0D值计算出标准曲 线的回归方程式，将样品的0D值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样 品的实际浓度。检测范围：2.82 ng/ml - 180 ng/ml最低检测限：1.41 ng/mL说明1 .只有全部使用试剂才能保证检测效果，由于全部试剂都是有关联的，不能混用其
12、他制 造商的产品。只有严格遵守试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果。2 .在储存及孵育过程中避开将试剂暴露在强光中。全部试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污 染，试剂避开受到微生物的污染，由于蛋白水解酶的干扰将导致消失错误的结果。3 .试剂盒保存：请收到试剂盒后尽快将标准品、检测溶液A和检测溶液B保存于-2（TC , 其余试剂短期保存请置于4,长期保存则置于-20。匚4 .浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。5 .刚开启的酶联板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对试验结果造成任何影响。6,全部的样品都应管理好，依据规定的程序处理样品和检测装置。7 .有效期：6个月。8 .本操作说明适用于48T试剂盒，但48T试剂盒全部试剂减半。