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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。SPA的纯化、表达与鉴定-SPA的纯化、表达与鉴定中文摘要：该实验用大肠杆菌做表达载体，然后用IPTG诱导大肠杆菌表达SPA，破碎大肠杆菌提取SPA后用镍柱纯化，再运用SDS-PAGE、双向免疫扩散法、westernblotting等方法对表达的蛋白质进行鉴定，其中制备免疫血清（抗SPA免疫血清）选取的动物为雄性健康成年的家兔。中文关键词：SPA、SDS-PAGE、westernblotting、双向免疫扩散。前言1.SPA的背景SPA即(StaphylococcalproteinA,SPA)葡萄球菌A
2、蛋白，是葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白(单链多肽),能与人及某些哺乳类动物的IgG分子的Fc段发生非特异性结合,SPA与IgG结合后的复合物具有抗吞噬,促细胞分裂,致超敏反应和损伤血小板等活性.（一）SPA的主要存在部位SPA存在于大多数（90）金黄色葡萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中；并且主要存在于血浆凝固酶阳性菌株，而不存在于阴性菌株中。前者是致病的，后者是非致病的，但在体内研究中尚未发现SPA和菌株致病性之间有任何肯定的关系。不同菌株间的SPA含量有明显差异，以I株金黄色葡萄球菌含SPA量最高，和细胞壁的肽聚糖呈共价结合。抗二甲氧基苯青霉素突变株（methicillin-resistan
3、tstrain）能产生分泌SPA，它较之细胞壁所含的SPA在免疫学性质上相似，但易分离，损失少。（二）SPA的相对分子质量及等电点SPA为蛋白质成分，仅含少量或不含碳水化合物，其相对分子质量因提取方法不同而异，用脱氧核糖核酸酶消化细胞壁后超速离心或用加热抽提法，所测相对分子质量为1200015000。用沉淀平衡分析和在6molL鸟嘌呤盐酸中凝胶过滤，测出相对分子质量为42000。SPA为单链多肽，内含3个高度相似的Fc段结合区，每区由50个以上的氨基酸组成，不含色氨酸和半胱氨酸。其羧基末端是赖氨酸，氨基末端结构尚未肯定。SPA黏度高于球蛋白，等电点（pi）为51，其天然结构十分稳定，在应用6m
4、olL鸟嘌呤盐酸变性剂的条件下，尚能保存某些三级结构，如将变性剂除去，则能自然矫正而恢复原有结构。（三）SPA的免疫学特性SPA具有和人及许多动物（如豚鼠、猪、小鼠、猴等）IgG结合的能力。SPA结合部位是Fc段而不是Fab段，这种结合不会影响抗体的活性。SPA具有的结合力是双价的，每个SPA分子可以同时结合2个IgG分子，也可一方面同IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、酶（HRP、AKP和GO等）、胶体金和铁蛋白等相结合。还有一个饶有兴趣的事实是，与SPA结合后IgG可用4molL鸟嘌呤盐酸等使之解离。利用这一生物化学特性，可以将SPA交联在葡聚糖凝胶上，对抗原或抗体蛋白质进行纯化。SPA
5、对IgG免疫球蛋白亚型的结合有选择性，如SPA与人IgG亚型IgGl、IgGz和IgG4有结合力，唯独不结合IgG3；只结合IgH2，而不结合IgHl。SPA与人及大部分哺乳动物血清中的IgG结合，能反应的动物包括豚鼠、小鼠（纯种）、狗、猪、猴和经免疫的家兔等。其结合部位为免疫球蛋白的CH2和Cn3的交界处。另外，它还能与少数血清中的IgM结合。SPA还能激活和固定补体，激活B淋巴细胞，促使其成熟并分泌产生各类免疫球蛋白。（四）SPA的生物学特性1免疫原性与过敏原性：SPA做为免疫原能刺激免疫活性细胞合成Ig，又能与其相应抗体的Fab段结合呈现抗原抗体的特异性反应。SPAIgG注射家兔皮下可引
6、起Arthus样反应，还可引起豚鼠的迟发性超敏反应。SPA体外试验，能刺激豚鼠离体回肠收缩。2抗吞噬作用：由于IgG的Fc段结合点既是lgG调理活性结合点，又是SPA反应点。因此，SPA可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用，也可能是SPA阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。3固定补体：SPAIgG和免疫复合物一样可以固定人和某些动物(如豚鼠、猪、狗等)血清中的补体，主要是通过补体传统激活途径。4促有丝分裂因子：SPA是一种B细胞激活剂，固相SPA作用明显，并不需要T细胞辅助,可容性SPA作用微弱，必须有T细胞参与。5去封闭作用：固相SPA能部分去除肿瘤病人和带瘤动物血清中的封闭活性，
7、从而降低了血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。（五）SPA的应用1应用于免疫球蛋白的制备和分析：SPA是一种比较理想的提纯和分析免疫球蛋白的试剂。由于SPA与IgG及其某些亚型的Fc段有较强的结合力，可利用来提纯、分析免疫球蛋白制剂，结合后的PSAIgG可再用解离剂如4mol/L尿素、4mol/L，硫氰酸盐或6mol/L的鸟嘌呤盐酸盐使之解离，多用SPASepharose层析柱分离IgG或其亚型及断片如Fc、Fab等。2应用于免疫细胞化学：由于SPA具有双价结合力，在免疫细胞化学技术中可作为桥抗体或标记抗体。由于SPA能与多种动物的IgG的Fc段结合，因此，作为第二抗体或标记抗体，SPA的最
8、大优点是不受种属特异性的限制，故在目前各种免疫细胞化学技术中已得到广泛的应用。除不受种属限制这一特点外，SPA法还具有染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等优点。据报告用国产酶联SPA代替酶标记抗体，应用间接染色，时间较PAP法省时一半。SPA分子量小（1300042000），易于穿透组织，而免疫球蛋白酶标记抗体为200000，PAP复合物为430000，均较SPA分子量大。3应用于多种细菌、支原体和病毒等病原体的简易快速诊断可应用SPA菌体作为载体，结合特异性抗体成为一种吸附原，作协同凝集剂，用于某些细菌和病毒的定群和分型。4可作为一种研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜Ig的固相吸附剂Hallg
9、sen用同位素标记SPA测定血IgG的凝集物，发现85%全身性红斑狼疮和42%类风湿病人血清中凝集物增高。SPA用于细胞膜抗原、表面IgG和Fc受体的研究最大特点是能研究活细菌。Ghetie（1976）用SPA致敏绵羊红血球，与经IgG处理的细胞形成玫瑰花环，来鉴定带Fc受体的细胞，反之，如用SPA抑制玫瑰花环形成，则可定量测定细胞表面的IgG。应用SPA与胶体金或铁蛋白相结合，可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位。特别是蛋白A胶体金技术（ProteinAGoldtechnique,PGA技术）自Pomano和Romano（1977）首次报告用于标记细胞表面抗原、包括淋巴细胞、血小板、大鼠肾脏细
10、胞及感染的病毒细胞获得成功以后，已得到愈来愈广泛的应用，是一种较为理想的免疫电镜技术。实验原理1SPA的原核表达大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等。通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。但是要小心，辗转多个实验室和
11、多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景？MCS是否还是原来那个MCS？是我们要特别注意的。E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵
12、下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性
13、的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。噬菌体DE3是噬菌体的衍生株，一段含有lac，lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、HMS174(DE3)等作为表
14、达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。2SDS-PAGE检测表达的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体（Acr）和少量的交联剂N,N”-甲叉双丙烯酰胺（Bis）,在催化剂（过硫酸铵或核黄素，前者为化学聚合，后者为光聚合）和加速剂TEMED（N，N，N，N，四甲基乙二胺）的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。改变单体的浓度或单体与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶（孔径大小可以通过改变单体Acr的浓度或单体与交联剂的比例而控制）。蛋白质分子是两性电解质分子，在直流电场内可以移动，PAGE过程中具有三种物理效应：（1）凝胶对样品分子的筛选效应（分子筛效应）颗粒小、呈
15、球形的样品分子移动快，颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶孔洞时的阻力大，移动慢；（2）不连续系统对样品的浓缩效应。凝胶层的不连续：浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小，在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时的阻力小，移动快，而在小孔径中，移动慢。因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。缓冲液离子成分及pH的不连续：在两层凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷（Tris）及HCI。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子，HCI在任何pH值溶液中均易解离出氯离子，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸（Gly）在pH8.
16、3的缓冲液中其解离度很小，仅为0.11，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。血清中，大多数蛋白质等电点在5.0左右，在pH8.3或6.7时均带负电荷，在电场中移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面出，被浓缩成极窄的区带。三者的有效迁移率为m氯氯m蛋白蛋白m甘甘（m为迁移率，为解离度），当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子及甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分成多个区带，因此分离胶之间pH的不连续性可控制其迁移率。在浓缩胶中要求慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使
17、样品在快慢界面之间被浓缩。进入分离胶后，慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。电位梯度的不连续性：电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关。电泳开始后由于快离子迁移率大，就会很快超过蛋白质，在快离子后面形成一个离子浓度低的区域即低电导区。低的电导区就具有较高的电位梯度，而高的电位梯度又使蛋白质和慢离子在快离子后面加速泳动。当三者的迁移率与电位梯度的乘积彼此相等时，三者的泳动速度就相等。在快慢离子的移动速度相等的文台建立后，二者之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。而蛋白质的有效迁移率在快慢离子之间，因此也就聚集在这个移动附近，被压缩成一个狭小的中间层。（3）电荷
18、效应当进入pH8.9的分离胶后，各种血清蛋白质所带静电荷不同，而有不同的迁移率。表面电荷越多，则迁移快；反之则慢。因此各种蛋白质按电荷少，分子量大小及分子形状以一定的顺序排列形成一个个区带。不连续聚丙烯酰胺凝胶系统所具备的电荷效应、分子筛效应和浓缩效应大大提高了它的分辨率。3蛋白的提取与纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。IMAC(ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatography)是Porathetal.1
19、975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smithetal.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochulietal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标
20、签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986年Porathetal.还发现Fe3+-IDA-sephadexG-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。4免疫血清的制备及检验免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂(如用于制备免疫标记抗体等)，也可供特异性
21、免疫治疗用。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定
22、簇的抗体混合物(即多克隆抗体)。另外，抗体的产生具有回忆应答的规律性，牨m现为初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆性B细胞参与再次应答所致。5westernblottingWestern免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多
23、肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。6双向免疫扩散法测定血清效价将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板中的相邻小孔中，使两者相互扩散，当扩散到它们的浓度达当量点时形成沉淀线。如果抗原-抗体浓度合适时，沉淀线在两孔的中间，如抗体过量，沉淀线靠近抗原孔。如抗原过量，沉淀线靠近抗体孔。用双扩散技术作定量测定时，应使用合适的沉淀条件。如抗原或抗体大大过量，由于溶解作用的改变和重新沉淀，可能产生沉淀迁移或多种沉淀物。为了研究合适的抗原和抗体浓度，将血清放在中间孔中，
24、一系列稀释的抗原放在中间孔的周围，此技术可以测定抗血清的效价。此外，根据沉淀融合的情况，还可以鉴定两种抗原是否完全相同。在琼脂中形成的沉淀线对相应的抗原和抗体是不可通过的，而对其它无关的抗原或抗体则可以通过。故两种相同的抗原从两孔扩散与第三孔扩散出来的相应抗体相遇时，将以一定的角度形成融合沉淀线。同样，两种不同的抗原与各自相同的抗体相遇时，则形成两条交叉的沉淀线。两种抗原部分相同的情况下，则形成部分交叉和部分融合的沉淀线。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1试剂1.5*M9盐溶液（V=100ml）：在去离子水中溶解以下盐类，终体积为100ml。Na2H2PO412H2O8.55gKH2PO4
25、1.5gNaCl0.25g(NH4)Cl0.5g2.LB培养基（固体培养基加1g琼脂）：在去离子水中溶解以下物质，终体积为100ml。胰蛋白胨1g酵母提取液0.5gNaCl1g3.M9培养基：在750ml无菌水中（冷却至50以下）加入5*M9盐溶液：200ml1mol/LMgSO4：2ml1mol/LCaCl2：0.1ml20%葡萄糖（细菌滤器除菌）：20ml4.2MTris-HCL(pH8.8),100mL称取24.2gTris碱，加50mL蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4mL），让溶液冷却至室温，pH将会升高。加蒸馏水至100mL。5.1MTris-HCL(pH6.8),100m
26、L称取12.1gTris碱，加50mL蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8mL），让溶液冷却至室温，pH将会升高。加蒸馏水至100mL。6.10（W/V）SDS,100mL称取10g的SDS,加蒸馏水至总量100mL7.50（V/V）甘油，100mL到取50mL100的甘油，加入50mL蒸馏水。8.1（W/V）溴酚蓝，100mL称取100mg溴酚蓝加蒸馏水至100mL，搅拌直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。9.A液：丙稀酰胺储存液，10030（W/V）丙稀酰胺，0.8（W/V）双丙稀酰胺。称取29.2g丙稀酰胺和0.8g双丙稀酰胺加水至100mL10.B液:4分离胶缓冲液，100mL75
27、mL2MTris-HCL(pH8.8)1.5M/L4mL10SDS0.421mL蒸馏水11.C液：4分离胶缓冲液，100mL50mL1MTris-HCL(pH6.8)0.5M/L4mL10SDS0.446mL蒸馏水12.10过硫酸铵，5mL0.5g过硫酸铵加到5mL蒸馏水,可在密封管内，4存放数月。13.电泳缓冲液，1L3gTris碱25mM14.4g甘氨酸192mM1gSDS0.1%加蒸馏水至1L，pH应该在8.3左右。14.5样品缓冲液，10mL0.6mL1MTris-HCL(pH6.8)60mM/L50（V/V）甘油25%2mL10SDS20.5mL2-巯基乙醇14.4mM/L1mL1溴
28、酚蓝0.10.9mL蒸馏水可在4存放数周，或在20保存数月。15.X分离胶的计算（该方案适用于灌制分离胶）A液X/3mLB液2.5mL蒸馏水（7.5X/3）mL10过硫酸铵50LTEMED5L总量10mL16.10过硫酸铵和TEMED可以根据实际情况添加。两块5堆积胶（6cm8cm0.75cm），4ml蒸馏水2.3mlA液0.67mlC液1.0ml10过硫酸铵30LTEMED5L17.考马斯亮蓝染液，1L(过滤)考马斯亮蓝R2501.0g甲醇450mL蒸馏水450mL冰醋酸100mL18.考马斯亮蓝脱色液，1L甲醇100mL冰醋酸100mL蒸馏水800mL19.30%丙烯酰胺/0.8%N,N-
29、亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37溶解之，补加水至终体积为100ml。0.45m微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。20.4TrisCl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91gTris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH至8.8,补加H2O至体积500ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入2gS
30、DS0.4%(w/v)，于4可保存1月。21.4TrisCl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05gTris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH至6.8,补加H2O至体积100ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入0.4gSDS0.4%(w/v)，于4可保存1月。22.4SDS电泳缓冲液Trisbase24.2gGlycerin115.3g20%SDS20ml加水至总体积1000ml。应用时稀释4倍即为1SDS电泳缓冲液(Tris0.05M,Glycerin0.38M,SDS0.1%)。23.TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)TEMED通过催化过硫酸铵形成自由
31、基而加速丙烯酰胺和N,N-亚甲丙烯酰胺的聚合。24.10%过硫酸铵过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%(w/v)的贮存液并保存于4。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。25.TBST配制：tris1.21g；MaCl8.8g；Tween200.5ml加水至1L或tris2.42g；NaCl80g；tween201ml，ph7.6，加水至1L。2.1.2药品IPTG、限制酶BamHI和HindIII溶菌酶、NaCl、磷酸缓冲液、镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF、吐温、巯基乙醇Tris、甘油、SDS、溴酚蓝、丙稀酰胺、双丙稀酰胺、2-巯
32、基乙醇、过硫酸铵、TEMED、甘氨酸、盐酸、考马斯亮蓝R250、甲醇、冰醋酸、标准蛋白marker活卡价苗(BCG)、弗氏不完全佐剂(FIA)、弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)丙烯酰胺、N,N-亚甲丙烯酰胺、Tris、SDS、Glycerin、TEMED、过硫酸铵、马斯亮蓝、氯化钠、氯化镁、甲醇、2-巯基乙醇、溴酚蓝、甘氨酸、BSA、吐温、羊抗兔IgG-HRP等2.1.3菌种大肠杆菌BL21(DE3)pLysS2.1.4仪器离心机、摇床超声波破碎仪、层析柱、紫外分光光度计、垂直板电泳槽、电泳仪垂直板电泳槽、电泳仪、移液器、微量移液器带盖搪瓷盘、凝胶成像系统。剪刀、镊子、注射器、量筒、动物
33、固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、塑料放血管等垂直板电泳槽、转移电泳槽、电泳仪、硝酸纤维素膜等2.2方法步骤2.2.1外源基因的诱导表达（1）将大肠杆菌划平板（LB-Amp+培养基），获取单菌落。（2）挑单菌落于试管（5mlLB-Amp+培养基）中，37，150rpm,振荡培养过夜。（3）次日，将5ml菌液接种入含100mlM9-Amp+培养基的锥形瓶中扩大培养，37，150rpm振荡培养4-5小时，至细菌达到对数生长期。（取样品A11mL置于EP管中，4，12000r/min离心10min收集细菌沉淀，弃去上清）(6）将扩大培养的菌种迅速进行低温（冰水浴）冷却5分钟，于15，
34、150rpm振荡培养45分钟后。加IPTG（终浓度为80mmol/L）诱导，继续于15，150rpm振荡培养4天。（取样品A21mL置于EP管中，4，12000r/min离心5min收集细菌沉淀，弃去上清）(7）将上述培养液4，8000r/min离心20min，收集细菌沉淀4贮藏备用。2.2.2大肠杆菌细胞破碎样品的处理对纯化是很重要的，重要的原则是破碎要温和，不能使蛋白断裂或者降解，否则一些片段同样也带有标签，这样增加了纯化的难度。需要注意的问题是超声破碎温度，强度，时间。破碎方法如下：（1）将收集的菌体沉淀加20ml破碎缓冲液(pH8.0的lys缓冲液)在冰上混合45分钟，如果pH不在7-
35、8，需要用0.5MNaOH一边搅拌一边滴加.（2）把混合菌体在冰水中用超声探头破碎3min,检测pH,如果不在7-8,还是用0.5MNaOH一边搅拌一边滴加去调.（3）破碎的液412000g离心20分钟，这时候可以把上清和沉淀分别留样，留作跑电泳检验。2.2.3SPA蛋白的纯化（1）平衡缓冲液(pH值8.0的lys缓冲液)：pH8.0的50mM磷酸缓冲液含0.5MNaCl。（2）洗脱缓冲液1：pH值8.0的lys缓冲液含20mM咪唑。（3）洗脱缓冲液2：pH值8.0的lys缓冲液含200mM咪唑。（4）取1ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10ml平衡缓冲液平衡，然后取破碎
36、上清10ml样品以0.5ml/min上样，然后2ml/管分管收集。（5）用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集（6）用5ml洗脱缓冲液1洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集（7）用5ml洗脱缓冲液2洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。（8）再用10ml0.5mol/L的NaOH洗柱后，用平衡缓冲液平衡至pH值8.0，以备下次使用。（9）收集的部分可以用紫外分光光度仪测定蛋白的浓度，再取有蛋白的部分电泳检测纯度。2.2.4SDS-PAGE检测表达的蛋白质一、灌制分离胶（1）组装凝胶模具可按照使用说明书。装配好灌胶用的
37、模具。（2）将A液，B液及蒸馏水在一个小烧杯或试管中混合，丙稀酰胺（A液中）是神经毒素，操作时必须戴手套。（3）加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀（过量气泡的产生会干扰聚合）。凝胶很快会聚合，操作要迅速。（4）小心将凝胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内，这样可以避免在凝胶内产生气泡。（5）当加入适量的分离胶溶液时（对于小凝胶，凝胶液加至约距离前玻璃板顶端1.5cm或距梳子约0.5cm，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层15mm的水层，这使凝胶表面变得平整。（6）等待3060min,使凝胶聚合。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面，可以微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合。二、灌制堆
38、积胶（1）吸尽覆盖在分离胶上的水。（2）将A液，C液和蒸馏水在三角烧瓶或小试管中混合。（3）加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀。（4）将堆积胶溶液用吸管加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。（5）将梳子插入凝胶内，直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。必须确保梳子齿的末端没有气泡。胶梳子稍微倾斜插入可以减少气泡的产生。（6）约30min凝胶聚合。（7）凝胶聚合后，小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂。（8）将凝胶放入电泳槽内，如果使用Bio-Rad的微型凝胶系统，可预先接好电极。（9）将电泳缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。三、制备样品和上样（1）样品制
39、备a.取培养物100ul于EP管，5000g5min离心，弃上清，菌体加入40ul上样缓冲液，100水浴3min，待冷却后10000g10min离心，小心吸取上清，转入另一标记好的EP管，室温保存备用（如长期放置，则置于-20保存，电泳前再煮沸2分钟）。b.将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20l5l）在一个Ep管中混合。放入100加热510min，离心，取上清点样。（2）上样用微量注射器将样品加入样品孔中。将蛋白质样品加至样品孔的底部。并随着染料水平的升高而升高注射器针头。同时加入标准蛋白marker，避免带入气泡，气泡易使样品混入到相邻的加样孔中。四、电泳（1）将电源插头与适当的电极相接。电流
40、应流向阳极。（2）将电压调至200V（保持恒压;对于两块0.75mm的胶来说，电流开始时为100mA，在电泳结束时应为60mA；对于两块1.5mm的胶来说，开始应为110mA，结束时应为80mA）；（3）对于两块0.75mm的凝胶，染料的前沿迁移至凝胶的底部约需3040min(1.5mm的凝胶则需4050min)；（4）关闭电源。（5）从电极上拔掉电极插头。（6）从电泳槽中取除凝胶玻璃板。（7）小心移动两块玻璃板之间的隔片，将其插入两块玻璃板的一角。轻轻撬开玻璃板，凝胶便会贴在其中的一块板上。五、考马斯亮蓝染色（1）戴上手套避免将手指印留在电泳胶上，将胶移如一个小的盛有少量考马斯亮蓝的容器内（
41、小心不将胶撕破）。或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直至凝胶脱落。（2）对于0.75mm的凝胶，可在摇床上缓慢振荡510min。对于1.5mm的凝胶，则需1020min，在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器口。（3）弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次。戴手套以避免将双手染色。（4）加入考马斯亮蓝（约50mL），清晰的条带很快会显现出来，大部分凝胶脱色需要1小时，使用过的脱色液则可用水冲洗掉。为了脱色完全，需要数次更换脱色液并振荡过夜。2.2.5免疫血清的制备及检测一、制备家兔抗SPA免疫血清（1）用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；（2）第一次免疫:用2ml注射器吸取弗
42、氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(SPA)下称FCA-IgG液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。（3）第二次免疫：间隔10-14天后，于两侧窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧窝及鼠蹊部皮下。（4）间隔7-10天后，从耳静脉采血0.51.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到一定比例时才能放血。二、心脏采用血法（1）家兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；（2）剪去左胸部兔毛，消毒皮肤；（3）用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指
43、放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位；（4）用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死；（5）将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。三、分离血清将三角烧瓶的血置37温箱1小时，再置4冰箱内34小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01硫柳汞或0.02叠氮钠，最终浓度)，分装后置4冰箱中保存备用。四、结果鉴定以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价，并用琼指免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量，应产生单一的沉淀弧线。（1）将盛有3
44、ml生理盐水琼脂的小试管置水浴中熔化。（2）将熔化好的琼脂小心倒入已调好水平的培养皿中，厚度为1mm。（3）琼脂凝固后，按模板打孔，孔内的琼脂如未被吸出则可用牙签挑出，中心孔为加抗原的孔，四周的个孔为加抗体的孔，孔径3mm，孔距4mm。打孔后将培养皿于酒精灯上烤背面（温度不宜过高，以不烫手为宜），使琼脂与玻片粘紧。（4）将兔抗人IgG按二倍稀释法稀释成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32的不同浓度。（5）从上到右到下到左的顺时针方向将不同浓度的抗体定量加入周围五孔，第六孔加生理盐水作为对照（千万不要溢出或漏在琼脂胶上）。（6）小心将培养皿放入湿盒内，置37温箱，经24小时扩散，第二天观察
45、。（7）观察沉淀带的出现情况并拍下照片，在有沉淀出现的稀释抗体中，稀释倍数最大的一孔的抗体稀释倍数即为抗体效价。2.2.6westernblotting一、westernblotting实验试剂配制方法：1）30%丙烯酰胺/0.8%N,N-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37溶解之，补加水至终体积为100ml。0.45m微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操
46、作，因为它还可能含有少量未聚合材料。2）4TrisCl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91gTris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH至8.8,补加H2O至体积500ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入2gSDS0.4%(w/v)，于4可保存1月。3）4TrisCl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05gTris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH至6.8,补加H2O至体积100ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入0.4gSDS0.4%(w/v)，于4可保存1月。4）4SDS电泳缓冲液Trisbase24.2gGlycerin115.3
47、g20%SDS20ml加水至总体积1000ml。应用时稀释4倍即为1SDS电泳缓冲液(Tris0.05M,Glycerin0.38M,SDS0.1%)。5）TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N-亚甲丙烯酰胺的聚合。6）10%过硫酸铵过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%(w/v)的贮存液并保存于4。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。7）TBST配制：tris1.21g；MaCl8.8g；Tween200.5ml加水至1L或tris2.42g；NaCl80g；tween201ml，ph7.6，加水至1L。二、SDS-PAGE、转膜及显色1）按厂商的使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶