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1、Central Laboratory of Biology水体(shu t)中大肠菌群的测定微生物学(wi shn w xu)实验第一页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University【课前预习课前预习】1.典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？2.食品食品(shpn)中大肠菌群数测定的意义是什么中大肠菌群数测定的意义是什么？第二页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,H
2、ubei Normal University【目的目的(md)要求要求】1.学习和掌握大肠菌群的测定方法（多管学习和掌握大肠菌群的测定方法（多管发酵法）发酵法）2.了解测定过程中每一步了解测定过程中每一步(y b)的反应原理。的反应原理。3.了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性第三页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University【实验实验(shyn)(shyn)原理原理】大肠菌群是一群能在大肠菌群是一群能在37培养培养(piyng)48h内发酵
3、乳糖产酸、内发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼氧革兰氏染色阴性无芽抱杆菌。以大产气的需氧或兼氧革兰氏染色阴性无芽抱杆菌。以大肠杆菌为主，包括肠细菌属、柠檬酸细菌属、埃希氏肠杆菌为主，包括肠细菌属、柠檬酸细菌属、埃希氏菌属和克雷伯氏菌属等。菌属和克雷伯氏菌属等。大肠菌群在肠道和粪便中数量非常高，且与肠道和粪大肠菌群在肠道和粪便中数量非常高，且与肠道和粪便中的病原菌生活习性相近，可作为判断样品是否被便中的病原菌生活习性相近，可作为判断样品是否被人、畜粪便污染的标志。人、畜粪便污染的标志。第四页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Scien
4、ces,Hubei Normal University 发酵法：发酵法：又称多管发酵法或三步发酵法又称多管发酵法或三步发酵法(此法是此法是根据根据(gnj)大肠菌群具有发酵乳糖产酸产气的特性，利用含乳糖大肠菌群具有发酵乳糖产酸产气的特性，利用含乳糖的培养基培养不同稀释度的样品经初发酵、平板分离和复发酵的培养基培养不同稀释度的样品经初发酵、平板分离和复发酵3个检测步骤，最后根据结果查最大自然数（个检测步骤，最后根据结果查最大自然数（most probable number）表，算出食品中的大肠菌群数。）表，算出食品中的大肠菌群数。)第五页，共二十页。Central Laboratory of B
5、iologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University1)初发酵（推测试验）：初发酵（推测试验）：将不同稀释度的水样，分别将不同稀释度的水样，分别(fnbi)接种于含有乳糖等糖接种于含有乳糖等糖类的培养液中（类的培养液中（3倍或倍或1倍乳糖培养基，视所加的水样倍乳糖培养基，视所加的水样体积和培养基体积而定），经体积和培养基体积而定），经37 C培养培养24 h，观察产，观察产酸产气情况，以初步判断是否有大肠菌群存在。酸产气情况，以初步判断是否有大肠菌群存在。第六页，共二十页。Central Laboratory of BiologyColl
6、ege of Life Sciences,Hubei Normal University发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏杜氏小套管小套管。乳糖乳糖能起选择作用，因为能起选择作用，因为(yn wi)很多细菌不能很多细菌不能发酵乳糖，而发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便。为便于观察细菌的于观察细菌的产酸产酸情况，培养基内加有情况，培养基内加有溴甲酚紫作为溴甲酚紫作为pH指示剂，指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。黄
7、色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。第七页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University2）平皿分离）平皿分离(fnl)（证实试验）（证实试验）水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实类发酵，因此需要进一步证实(zhngsh)。将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，养基，37 C培养培养24 h，根据菌落特征，挑取可能，根据菌落特征，挑取可能为大肠菌群
8、的菌落制片，经革兰氏染色，进一步为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。证实是否为大肠菌群。第八页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University平平板板培培养养基基使使用用伊伊红红美美蓝蓝琼琼脂脂（eosin methyleneblue agar，EMB agar）。伊伊红红美美蓝蓝琼琼脂脂平平板板含含有有伊伊红红和和美美蓝蓝染染料料，在在此此亦亦作作为为指指示示剂剂，大大肠肠菌菌群群发发酵酵乳乳糖糖造造成成酸酸性性环环境境时时，该该两两种种染染料料即即
9、结结合合成成复复合合物物，使使大大肠肠菌菌群群产产生生带带核核心心(hxn)的的、有有金金属属光光泽泽的的深深紫紫色色（龙龙胆胆紫紫的的紫紫色色）阳阳性性菌菌落落。初初发发酵酵管管24h内内产产酸酸产产气气和和48h产产酸酸产产气气的的均均需需在在以以上上平平板板上上划划线线分分离离菌菌落落。第九页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University3）复发酵试验复发酵试验(完成完成(wn chng)实验）实验）将上述可能为大肠菌群的菌落将上述可能为大肠菌群的菌落(jnlu)再次转
10、接入再次转接入1倍乳糖培养液中，经倍乳糖培养液中，经37 C培养培养24 h，产酸产气者即，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。最后确证为存在大肠菌群。产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产气则产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产气则记为阴性反应；记为阴性反应；根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。第十页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University1.被检样品被检样品根据不同需要选择检检样品（如自来水、湖水等）2.培养基培
11、养基乳糖(r tn)胆盐发酵培养基，伊红美蓝固体培养基，乳糖(r tn)发酵培养基3.试剂试剂革兰氏染色液，芽孢染色液4.其它其它显微镜，天平，培养箱，水浴锅，研钵，平皿，试管，刻度吸管，涂布器【实验实验(shyn)(shyn)材料材料】第十一页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University【操作步骤操作步骤】1水样的采取水样的采取(ciq)（青山湖水，应取距水面（青山湖水，应取距水面10-15cm的深的深层水样，用灭菌带玻璃塞的瓶子，瓶口向下侵入水中，层水样，用灭菌带玻璃塞
12、的瓶子，瓶口向下侵入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水既流入瓶中，盛满后，然后翻转过来，除去玻璃塞，水既流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出）将瓶塞盖好，再从水中取出）第十二页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University2湖水的检查湖水的检查（1）初（步）发酵实验）初（步）发酵实验 水样的稀释：水样的稀释：10-2、10-3、10-4（用无菌水稀释）（用无菌水稀释）接种：取接种：取0.5ml上三个稀释度的水样接入装有上三个稀释度的水样接入装有4.5ml三倍浓缩乳糖三倍
13、浓缩乳糖(r tn)蛋白胨发酵管（水样的体积和培养蛋白胨发酵管（水样的体积和培养液的体积由试管而定）液的体积由试管而定），混匀后，混匀后，37 培养培养24 h。第十三页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University水样接种于发酵管内，水样接种于发酵管内，37下培养：下培养：（1）24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌改变，说明水中存在大肠杆菌(d chn n jn)，疑为阳性结果；，疑为阳性结果；
14、（2）在量少的情况下，也可能延迟）在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此后才产酸产气，此时应视为可疑结果。时应视为可疑结果。以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。大肠菌群。（3）48h后仍不产气的为阴性结果。后仍不产气的为阴性结果。第十四页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University（2）平板分离）平板分离 将经将经24 h培养后产酸产气的发酵管，分别划线培养后产酸产气的发酵管，分别划线接
15、种接种(jizhng)于伊红美蓝琼脂平板上，再于于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 培养培养1824 h，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。深紫黑色，有金属光泽；深紫黑色，有金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深。淡紫红色，中心颜色较深。第十五页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University（3）复发酵试验）复发酵试验 将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复初步发将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌
16、株重复初步发酵试验酵试验(利用乳糖蛋白胨培养液利用乳糖蛋白胨培养液)。仍为产酸产气者为大。仍为产酸产气者为大肠杆菌阳性肠杆菌阳性(yngxng)。（4）结结果果计计算算：根根据据三三个个稀稀释释度度中中阳阳性性管管数数组组成成一一个数量指标，查个数量指标，查MPN计数表计数表10-1第十六页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University10ml1001ml1001ml10-11ml10-231111支支各各3支支第十七页，共二十页。Central Laboratory of
17、BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University【实验实验(shyn)结果结果】1.将实验测出的各样品大肠菌群数以报表方将实验测出的各样品大肠菌群数以报表方式报告结果。式报告结果。2.对样品大肠菌落数作出是否对样品大肠菌落数作出是否(sh fu)符合卫生符合卫生要求的结论。要求的结论。第十八页，共二十页。Central Laboratory of BiologyCollege of Life Sciences,Hubei Normal University【思考题思考题】1.在进行食品中大肠杆菌群数的测定时，为在进行食品中大肠杆菌群
18、数的测定时，为什么要进行复发酵什么要进行复发酵(f jio)试验？试验？2.典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？3.食品中大肠菌群数测定的意义是什么？食品中大肠菌群数测定的意义是什么？生物学实验教学中心(zhngxn)第十九页，共二十页。内容(nirng)总结Central Laboratory of Biology。3.了解大肠菌群的数量(shling)在饮水中的重要性。类的培养液中（3倍或1倍乳糖培养基，视所加的水样。根据阳性管数量(shling)，查表求得水体大肠菌群的数量(shling)。1.被检样品根据不同需要选择检检样品（如自来水、湖水等）。3.试剂革兰氏染色液，芽孢染色液。1.在进行食品中大肠杆菌群数的测定时，为什么要进行复发酵试验。生物学实验教学中心第二十页，共二十页。