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1、PCR 引物设计PCR primer express 聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)体外核酸扩增技术体外核酸扩增技术 l l能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一DNADNA片片片片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍段于数小时内扩增至十万乃至百万倍段于数小时内扩增至十万乃至百万倍段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察使肉眼能直接观察使肉眼能直接观察使肉眼能直接观察和判断。和判断。和判断。和判断
2、。l l PCRPCR使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的DNADNA片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要技术体系，其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在技术体系，其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在技术体系，其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在技术体系，其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在DNA
3、DNA重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应用价值用价值用价值用价值。PCRPCR技术的创建技术的创建KaryKary B.Mullis B.Mullis（穆利斯（美）（穆利斯（美）Khorana(1971)等提出在体外经等提出在体外经DNA变性变性,与适当引物杂交与适当引物杂交,再用再用DNA聚合酶延伸聚合酶延伸,扩增扩增DNA的设想。的设想。1983年年,Mullis发明了发明了PCR技术技术,使使Khorana的设想得到实现。的设想得到实现。1
4、988年年Saiki等将耐热等将耐热DNA聚合酶（聚合酶（Taq）引入了）引入了PCR技术。技术。1989年美国年美国Science杂志列杂志列PCR 为十余项重大科学发明为十余项重大科学发明之首之首,比喻比喻1989年为年为PCR爆炸年爆炸年,Mullis荣获荣获1993年度诺贝尔年度诺贝尔化学奖。化学奖。1.PCR的基本原理PCR的原理是根据待测的原理是根据待测DNA片段两端的核苷酸序列，设计并片段两端的核苷酸序列，设计并人工合成两个分别与人工合成两个分别与DNA片段两端互补的寡聚核苷酸引物，片段两端互补的寡聚核苷酸引物，在有过量的引物、过量的底物（在有过量的引物、过量的底物（4种种dNT
5、P）、）、DNA聚合酶聚合酶以及模板的反应体系中，经过高温变性、低温退火和适温以及模板的反应体系中，经过高温变性、低温退火和适温延伸三个阶段的循环周期，对延伸三个阶段的循环周期，对DNA分子进行扩增。分子进行扩增。由于新合成的由于新合成的DNA双链能够作为下一循环的模板，所以模板双链能够作为下一循环的模板，所以模板DNA以几何级扩增。一般经过以几何级扩增。一般经过30-35次扩增循环，可使目次扩增循环，可使目的基因的基因DNA片段放大数百万倍。片段放大数百万倍。2.PCR体系的主要成分模板模板DNA（靶基因）（靶基因）特异引物特异引物底物底物dNTP耐热性耐热性DNA聚合酶（如聚合酶（如Taq
6、DNA聚合酶）聚合酶）Mg2+缓冲液缓冲液 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。（1）模板）模板单、双链单、双链DNA均可。均可。不能混有蛋白酶，特别是染色体中的组蛋白、核酸酶、不能
7、混有蛋白酶，特别是染色体中的组蛋白、核酸酶、DNA聚合酶抑聚合酶抑制剂、制剂、DNA结合蛋白类。结合蛋白类。一般一般100ng DNA模板模板/100 L。模板浓度过高会导致反应的非特异性模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。增加。（2）引物浓度）引物浓度0.1-0.5 mol/L浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应非特异性扩增，且可增加引物反应非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。之间形成二聚体的机会。（3）Taq DNA聚合酶（聚合酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 l酶量过高可引起反应非特异性扩增酶量过高可引起反应非特异性
8、扩增;酶量过少则合成产物量减少。酶量过少则合成产物量减少。（4）dNTP浓度浓度取决于扩增片段的长度取决于扩增片段的长度 四种四种dNTP浓度应相等，如果有一种浓度不同于其他几种，就会引起浓度应相等，如果有一种浓度不同于其他几种，就会引起错配。错配。浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与可与Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响浓度下降，影响DNA聚合酶的聚合酶的活性。活性。（5）Mg2+浓度浓度Mg2+是是DNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。反应
9、体系。Mg2+浓度过低会使浓度过低会使Taq酶活性丧失、酶活性丧失、PCR产量下降；产量下降；Mg2+过高反应过高反应特异性降低，出现非特异扩增。特异性降低，出现非特异扩增。Mg2+可与负离子结合，所以反应体可与负离子结合，所以反应体系中系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。浓度。lthree steps:Denaturation (变性变性):将反应体系加热至将反应体系加热至90-9790-97，使模板，使模板DNADNA完全变性成为单链，同时引物自完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除。身以及引物之间存在的局部双链也
10、得以消除。Annealing (退火退火):当温度突然降低至当温度突然降低至45-65,45-65,引物与其互补的单链引物与其互补的单链DNADNA模板在局部形成杂交模板在局部形成杂交链。链。Extension(延伸延伸):将温度升高至将温度升高至70-7470-74下，在下，在TaqTaq DNA DNA 聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及底物及MgMg2+2+存在的条件下引物沿着模板存在的条件下引物沿着模板DNADNA延伸。延伸。利用利用PCR仪来控制温度仪来控制温度3.How PCR works聚合酶链式反应聚合酶链式反应1.Denaturation2.A
11、nnealing3.Extension 以上三个步骤构成一个循环，新合成的以上三个步骤构成一个循环，新合成的以上三个步骤构成一个循环，新合成的以上三个步骤构成一个循环，新合成的DNADNADNADNA分子继续作为下一轮合分子继续作为下一轮合分子继续作为下一轮合分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（成的模板，经多次循环（成的模板，经多次循环（成的模板，经多次循环（2525252530303030）次即可达到扩增）次即可达到扩增）次即可达到扩增）次即可达到扩增DNADNADNADNA片段的目的。片段的目的。片段的目的。片段的目的。5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle
12、 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 5 Essential Components of PCR Reaction salts(ions)dNTPsdNTPsPrimersDNA DNA PolymerasePolymeraseTemplate DNATemplate DNAPCR动画动画4.引物设计原则引物设计是PCR技术中至关重要的一环，其优劣直接关系到PCR的特异性和实验能否成功。引物要与模板链的序列紧密互补。合成的一对引物分别与待测DNA的5端和3端互补。引物内和引物之间不能形成稳定的二聚体或发夹结构。这会破坏引物退火稳定性。引物内部和引物
13、之间不应有互补序列，一般来说，引物内部以及引物之间连续互补的碱基不应多于4个。引物与非特异性扩增区无同源性。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应，即错配。长度：1530个核苷酸。常用18-27bp。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机
14、率增加。引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。末位碱基为A 的错配率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。选择 GC 含量为40到60或GC 含量与模板GC 含量接近的引物。引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability,)。设计 5端和中间区为G 或C 的引物，这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。过高或过低都不利于引发反应。两引物的Tm 值相差不应大于5。DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G
15、C含量越高，Tm值越高，成正比关系。复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。5.Premier 5.0 使用l“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA 基元(motif)查找。“Premier”还具有同源性分析功能，但并非其特长。此外，该软件还有设计简并引物、DNA与蛋白质序列的互换等功能。
16、简并引物：有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。猪的猪的UCP3UCP3基因（脂调节基因）的第五外显子基因（脂调节基因）的第五外显子（exonexon）序列）序列1.1.输入目的基因序列输入目的基因序列2.2.选中选中primerprimer图标，点图标，点S S图标。开始设计正义链。图标。开始设计正义链。3.edit primer,3.edit primer,在引物的在引物的5 5端加入选好的酶切位点并在端加入选好的酶切位点并在其左侧加其左侧加3 3个保护碱基个保护碱基TTATTA ，完成后点，完成后点analyzeanalyze，认，认为可以后点为可以后点OKOK。4.4.设计反义链引物。设计反义链引物。5.5.显示满足设计参数的候选结果。显示满足设计参数的候选结果。6.Rating6.Rating表示引物评分，优选评分高的。表示引物评分，优选评分高的。无连续无连续 U串串G/C含含量量较较少少