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1、第二章第二章 PCR技术的原理及应用技术的原理及应用故事发生在1983年的春夏之交Kary B.Mullis(1944-)，在在Cetus公司工作期间，公司工作期间，发明了发明了PCR。他原本是他原本是要合成要合成DNA引物来进行引物来进行测序工作，测序工作，却常为没有却常为没有足够多的模板足够多的模板DNA而烦而烦恼。恼。1983年春夏之交的年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用别墅的路上萌发了用两个两个两个两个引物引物（而不是一个引物）（而不是一个引物）去扩增模板去扩增模板DNA 的想法的想法.很少有在公司工作的科研人员得很少有在公司工作的科研人员得诺贝
2、尔奖，诺贝尔奖，Mullis是其中之一是其中之一Mullis开车的时候开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面的两条链，自己的车和对面开来的车象是开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着聚合酶，面对面地合成着DNA，Mullis的第一个的第一个PCR实验实验 1983年年9月中旬。月中旬。Mullis在反应体系中加在反应体系中加 入入DNA聚合酶后在聚合酶后在37 一直保温。结果第二一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后认识到有必要用加热来解链，每次解链
3、后再加入再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。聚合酶进行反应，依次循环。1983年年12月，他终于看到了被同位素标记月，他终于看到了被同位素标记的的PCR条带。条带。第一种高温菌第一种高温菌DNA聚合酶的分离聚合酶的分离美国黄石国家公园 Thermus aquaticusThe Thermusaquaticus DNApolymeraseTaqNot permanentlydestroyed at 94COptimaltemperature is 72C耐高温耐高温DNA聚合酶的种类聚合酶的种类Taq DNA聚合酶聚合酶 (Thermus aquaticus，Cetus/Roche)Tth D
4、NA聚合酶聚合酶 (Thermus thermophilus，Toyobo)Pfu DNA聚合酶聚合酶 （Pyrococcus furiosus，Stratagene）Deep Vent DNA聚合酶聚合酶(Bio-labs）Tfl DNA聚合酶聚合酶 （Thermus flavus，Promega)Tli DNA聚合酶聚合酶 (Thermococcus litoralis，Promega)Vent DNA聚合酶聚合酶(Bio-labs）Pwo DNA聚合酶聚合酶 (Pyrococcus woesei，Roche)Pfx DNA聚合酶聚合酶 (Thermococcus kodakaraensi
5、s,Invitrogen)Dynazyme DNA聚合酶聚合酶（Thermus brockianus，Finnazyme）FD DNA聚合酶聚合酶 (Thermus sterophilus？，复旦大学？，复旦大学)Tma,Tne,KOD,PCR仪器的变迁仪器的变迁三个水浴锅，三个水浴锅，用手移动用手移动 （Mullis等人当时用的）等人当时用的）电加热块电加热块 自来水冷却自来水冷却 （PE，1988）电加热块电加热块 内置循环液冷却内置循环液冷却 （PE，1989）三个加热块三个加热块 机械手机械手 （Stratagene，1994）半导体制冷和加热半导体制冷和加热 （MJ,PE,BioMe
6、tra,Eppendrof）温度梯度温度梯度,荧光检测荧光检测(如如 Roche的的Lightcycler)风加热风加热Lab-on-chip式的式的PCR仪仪(所谓的芯片所谓的芯片PCR)中国的状况中国的状况中国的状况中国的状况1991年出现三个水浴锅年出现三个水浴锅+机械手的原始机械手的原始PCR仪（华美，复日等）仪（华美，复日等）现在以半导体（现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈上海天呈,厦门厦门安普利等）安普利等）PCR的发展史的发展史1983年春，年春，Mullis发展出发展出PCR的概念；的概念；1983年年9月，月，Mullis用
7、大肠杆菌用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个聚合酶做了第一个PCR实实验，只用一个循环；验，只用一个循环；1983年年12月，用同位素标记法看到了月，用同位素标记法看到了10个循环后的个循环后的49 bp长度长度的的第一个第一个PCR片断；片断；1985年年12月月20日，日，Mullis的同事的同事Saiki在在Science上发了一篇论上发了一篇论文，方法中用了文，方法中用了PCR技术，导致技术，导致Mullis的文章到处被拒；的文章到处被拒；1985年年10月月25日申请了日申请了PCR的专利，的专利，1987年年7月月28日批准日批准（专利号（专利号4,683,202），这回），这回Mul
8、lis是第一发明人。是第一发明人。1986年年5月，月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习始学习PCR的方法；的方法；1986年年6月，月，Cetus公司纯化了第一种高温菌公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，聚合酶，Taq DNA polymerase，这是，这是85年春天年春天Mullis建议做的；建议做的；1988年，第一台年，第一台PCR仪问世；仪问世；1991年，年，Hoffman LaRoche以以3亿美元的代价从亿美元的代价从Cetus公司获公司获得全权开发权。得全权开发权。PCR不只是一个方法改进不只是一个方法改进Mul
9、lis的上司有句的上司有句“名言名言”，“我们我们要扩增这么多要扩增这么多DNA样品有什么用样品有什么用”；到了到了1991，Cetus公司以公司以3亿美元的亿美元的转让费将转让费将PCR相关专利转让给瑞士相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；的经营中又获得了数亿美元的分红；Mullis于于1993年获得诺贝尔化学奖，年获得诺贝尔化学奖，PCR和和DNA重组技术一样意义深远。重组技术一样意义深远。PCR相关的术语和产品层出不穷相关的术语和产品层出不穷T-vectorHotStart TaqRT-PCRRAPD-PCRDDRT
10、-PCRLM-PCRInverse PCRNested PCRReal-time PCRRACEFlow chip PCRTASMultiplex PCRImmuno PCRAsymmetric PCRLP-PCRNASBA Recombinant PCR AFLPSSCPIn situ PCRTaqMan/SYBR green 1 1stst cycle cycle2 2ndnd cycle cycle3 3rdrd cycle cycle过过 程程变变变变 性性性性引引引引 物物物物 退退退退 火火火火DNA DNA 复制复制复制复制（一）（一）PCR的基本原理的基本原理（二）（二）PCR
11、的种类的种类1.普通普通PCRPCRPCR琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳最终产物最终产物最终产物最终产物紫外光观察紫外光观察紫外光观察紫外光观察3-4 3-4 3-4 3-4 小时小时小时小时PCR具有极高的灵敏度具有极高的灵敏度样品样品正对照正对照 负对照负对照标准分子量标准分子量 污染是污染是污染是污染是PCRPCRPCRPCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。某个片段
12、，就有可能以后的实验中发生污染。某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。因此，做实因此，做实因此，做实因此，做实验的时候绝验的时候绝验的时候绝验的时候绝对不要忘了对不要忘了对不要忘了对不要忘了负对照。负对照。负对照。负对照。用紫外灯破用紫外灯破用紫外灯破用紫外灯破坏污染物也坏污染物也坏污染物也坏污染物也是一个办法是一个办法是一个办法是一个办法（二）（二）PCR的种类的种类2.RT-PCR：反转录反转录PCR(reverse transcriptase-PCR)原理：原理：RNARNA的反转录（的反转录（RTRT）和）和cDNAcDNA的聚合酶链式扩增（的聚合酶链式扩增（PCRPCR）相结）相结
13、合的技术。首先经反转录酶的作用从合的技术。首先经反转录酶的作用从RNARNA合成合成 cDNAcDNA，再以，再以cDNAcDNA为模为模板，扩增合成目的片段。板，扩增合成目的片段。特点：特点：作为模板的作为模板的RNARNA可以是总可以是总RNARNA、mRNAmRNA或体外转录的或体外转录的RNARNA产物。产物。无论使用何种无论使用何种RNARNA，关键是确保，关键是确保RNARNA中无中无RNARNA酶和基因组酶和基因组DNADNA的污染。的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、OligoOligo dTdT 及基因特异性
14、引物及基因特异性引物(GSP)(GSP)中的一种。对于短的不具有发卡结构的真中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞核细胞mRNAmRNA，三种都可。，三种都可。应用：应用：RT-PCRRT-PCR技术灵敏而且用途广泛，分析基因的转录水平，细技术灵敏而且用途广泛，分析基因的转录水平，细胞中胞中RNARNA病毒的含量，直接克隆特定基因的病毒的含量，直接克隆特定基因的cDNAcDNA序列。序列。两步法两步法RT-PCR示意图示意图一步法一步法RT-PCR示意图示意图两步法两步法RT-PCR一步法一步法RT-PCR起始第一链起始第一链cDNA合成使用：合成使用：起始第一链合成使用起始第一链合成使用
15、Oligo(dT)，随机六聚体，随机六聚体，GSP引物引物GSP引物引物优点优点优点优点灵活灵活方便方便引物选择引物选择扩增酶同逆转录酶预先混合扩增酶同逆转录酶预先混合扩增酶的选择扩增酶的选择转管步骤少，减少污染可能性转管步骤少，减少污染可能性困难困难RT-PCR的优化能力的优化能力高灵敏度高灵敏度适用于在单个样品中检测几个适用于在单个样品中检测几个mRNA适用于大量样品分析适用于大量样品分析一步法和两步法一步法和两步法RT-PCR的比较的比较 EcoRI寡聚寡聚(dT)12-18随机随机6碱基引物碱基引物R6寡聚寡聚(dT)12-18随机随机6碱基引物碱基引物R6mRNA(A)n(T)12-
16、18(A)n(A)n(T)12-18R6R6R6R6R6R6第二链合成第二链合成(A)n(T)12-18(A)nR6R6R6R6R6R6(A)n(T)12-18EcoRI加上加上EcoRI接头，磷酸化，接头，磷酸化，cDNA分级分级cDNA合成完毕，准备连接合成完毕，准备连接第一链合成第一链合成cDNA合成过程示意图合成过程示意图cDNA序列的克隆（二）（二）PCR的种类的种类2.Nested PCR：巢式巢式PCR原理：原理：利用两套利用两套PCRPCR引物（巢式引物）对进行两轮引物（巢式引物）对进行两轮PCRPCR扩增反应。扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的
17、存在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。在下进行第二轮扩增。优点：优点：由于巢式由于巢式PCRPCR反应有两次反应有两次PCRPCR扩增，从而降低了扩增多个靶扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对敏感性；两对PCRPCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有增加有限量靶序列（如稀有mRNAmRNA）的灵敏度，并且提高了困难）的灵敏度，并且提高了困难PCRPCR（如（如5R
18、ACE5RACE）的特异性。）的特异性。应用：应用：一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIVHIV，肿瘤，肿瘤基因等。基因等。Nested PCR原理示意图原理示意图First PCRSecond PCR（二）（二）PCR的种类的种类3.Inverse PCR：反向反向PCR原理：原理：用适当的限制性内切裂解含核心区的用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合，以产生适合于于PCR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延
19、的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向PCR方方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。优点：优点：可使已知序列的核心区边侧的未知可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。成几何级数扩增。应用：应用：一般应用于未知序列的扩增，有时也用于定点突变。一般应用于未知序列的扩增，有时也用于定点突变。Inverse PCR原理示
20、意图原理示意图（二）（二）PCR的种类的种类4.PCR-RFLP:多聚酶链反应多聚酶链反应(PCR)-(PCR)-限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 (restriction fragment length Polymorphism，RFLP)原理：原理：PCRPCR产物限制性内切酶切多态性分析，产物限制性内切酶切多态性分析，DNADNA发生重排后，发生重排后，酶切位点发生改变。酶切位点发生改变。优点优点：具有分辩率高，无需标记：具有分辩率高，无需标记,重复性好，简便快速直观等。重复性好，简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析与比较主要用于核酸变异性分析与比较,微生物的分群分型分亚型，癌
21、基微生物的分群分型分亚型，癌基因分析，遗传病的诊断等。因分析，遗传病的诊断等。局限：局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变的情况下，一次只只能应用突变引起限制性酶切位点改变的情况下，一次只能完成一个特定位点突变筛选，检测效率低。能完成一个特定位点突变筛选，检测效率低。PCR-RFLP原理示意图原理示意图5.PCR-SSCP：聚合酶链反应一单链构象多态性聚合酶链反应一单链构象多态性(single strand conformation polymorphism)原理：原理：是将经扩增的是将经扩增的DNADNA片段经过变性处理，形成单链，由于序列片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象
22、就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。特点：特点：刚建立时是将刚建立时是将同位素同位素掺入掺入PCRPCR扩增的产物中，通过放射自显扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。后用影显示结果。后用银染银染取代同位素显示取代同位素显示DNADNA带型，大大降低了成本，带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特点。具有经济、快速、灵敏等特点。19931993年起用年起用EBEB染色法显示染色法显示DNADNA带型。带型。优点：优点：检测基因变异，
23、具有操作简便、快速、不需特殊设备，适用检测基因变异，具有操作简便、快速、不需特殊设备，适用于大样本筛选。己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失于大样本筛选。己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。突变，基因的多态性分析等。（一）（一）PCR的种类的种类PCR-SSCP示意图示意图从定性到定量的革命 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过产物进行
24、定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR PCR 终产物。终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR PCR 信信号放大之前的起始模板量。号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量需求下荧光定量PCRPCR技术应运而生。
25、技术应运而生。普通普通PCR定量分析的困惑定量分析的困惑PCR产物生成曲线产物生成曲线logDNACycleslogDNACycles不同样品有不同的生成曲线不同样品有不同的生成曲线实时定量实时定量PCRPCR技术，是指在技术，是指在PCRPCR反反应体系中加入应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧，利用荧光信号积累实时监测整个光信号积累实时监测整个PCRPCR进进程，使每一个循环变得程，使每一个循环变得“可见可见”，最后通过，最后通过CtCt值和标准曲线值和标准曲线对样对样品中的品中的DNA(or DNA(or cDNAcDNA)的起始浓的起始浓度进行定量的方法。度进行定量的方法。实时荧光定量
26、实时荧光定量PCRPCR是目前确定样是目前确定样品中品中DNA(DNA(或或cDNAcDNA)拷贝数最敏感、拷贝数最敏感、最准确的方法。最准确的方法。Real Time PCR and Conventional PCRVS53535353535355TaqTaq53RepeatDenaturationPrimer AnnealingElongation常规常规 PCR ProcessIn theory,product accumulation is proportional to 2n,where n is the number of amplification cycle repeatsRe
27、ality vs.TheoryAmplification is exponential,but the exponential increase is limited:nA linear increase follows exponentialnEventually plateausTheoreticalReal LifeLog Target DNA定量的最佳时期定量的最佳时期Quantitative information comes from monitoring the early stages of amplification.Real LifeReal LifeDetectorDet
28、ectorDetectorTheoreticalTheoreticalLog Target DNALog Target DNACycle#Cycle#普通普通PCR和和荧光定量荧光定量PCR的区别的区别常规常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析（分析（定量不准确定量不准确），无法进行实时检测；），无法进行实时检测；荧光定量荧光定量PCR是在是在PCR反应体系中加入荧光基团，利反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循进程，使每一个循环变得环变得“可见可见”，通过，通过Ct值和标准曲线对
29、样品中的值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法（的起始浓度进行定量的方法（准确定准确定量量）。普通PCR和定量PCR的区别适用定性分析，适用定性分析，不适合定量分不适合定量分析；析；PCR 产物的长产物的长度从度从100bp 数数kb实时检测实时检测:每个循每个循环都产出荧光信号环都产出荧光信号绝对定量，灵敏度绝对定量，灵敏度更高更高 PCR产物的长度一产物的长度一般在般在 60-150 bps荧光定量荧光定量PCR的原理的原理基本原理：基本原理：扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本下，样本DNA含
30、量与扩增产物的对数成正比。由于反应体系中的荧含量与扩增产物的对数成正比。由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物光染料或荧光标记物(荧光探针荧光探针)与扩增产物结合发光，其荧光量与与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比。因此，通过荧光量的检测就可以测定样本核酸扩增产物量成正比。因此，通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。量。荧光化合物分为两类荧光化合物分为两类（1）非特异性的嵌入荧光染料）非特异性的嵌入荧光染料：利用嵌入荧光染料检测，只是简单：利用嵌入荧光染料检测，只是简单地反映地反映PCR反应体系中总的核酸量，是一种非特异性的检测方法。反应体系中总的核酸量，是一种非特异性的检测方法。（2
31、）特异性荧光）特异性荧光(引物引物)探针：探针：增加了探针的识别步骤增加了探针的识别步骤,特异性、专特异性、专一性更高。一性更高。非特异性的嵌入荧光染料非特异性的嵌入荧光染料（Non-specific DNA binding dyes）SYBR Green ISYBR GoldEthidium BromideReal-Time PCR，SYBR greenCycle 1Cycle 3Cycle 2Molecular Probe公司公司的一个专利的一个专利产品，产品，US Patent5,436,134 1993年年7月月12日申请日申请SYBR green 的优缺点的优缺点简便简便可以使用已有
32、的引物可以使用已有的引物普遍通用普遍通用可以检测所有的双链可以检测所有的双链DNA，包括引物二聚体；，包括引物二聚体；需要化大力气优化反应条件，以消除非特异性需要化大力气优化反应条件，以消除非特异性扩增；扩增；价格价格$1/PCR 反应反应定量的灵敏度有所欠缺定量的灵敏度有所欠缺Extension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatDNA binding dyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll特异性的荧光探针特异性的荧光探针特异性的荧光探针是把荧光
33、化合物标记到特异性的寡特异性的荧光探针是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的核苷酸上形成荧光标记的DNADNA探针。通过探针与探针。通过探针与PCRPCR产产物特异性的结合物特异性的结合,在在PCRPCR过程中可对产物实现均相、实过程中可对产物实现均相、实时、定量检测时、定量检测,也适用于多通道检测。也适用于多通道检测。TaqMan探针定量定量 PCR，TaqMan体系体系ABI 公司首先推出公司首先推出(PRISM 7000系列系列)US Patent 5,723,591,19951995年年1111月申请。月申请。实时检测实时检测:每个循环都会产生与每个循环都会产生与PCR产
34、产物成正比的荧光物质物成正比的荧光物质TaqMan探针是一段探针是一段5端标记报告荧光基团端标记报告荧光基团(R),3端标记淬灭荧光基端标记淬灭荧光基团团(Q)的寡核苷酸的寡核苷酸,其序列与模板其序列与模板DNA中的一段完全互补。中的一段完全互补。当探针单独存在时当探针单独存在时,由于荧光共振能量转移的发生由于荧光共振能量转移的发生,R的荧光受到的荧光受到Q的猝的猝灭。在灭。在PCR过程中过程中,由于由于TaqDNA酶的酶的5-3外切酶活性的作用外切酶活性的作用,使探针使探针的的5端的端的R被切断被切断,加大了与加大了与Q的距离而使荧光恢复。的距离而使荧光恢复。一分子的产物生成就伴随着一分子的
35、荧光信号的产生。随着扩增循环一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。因此释放出来的荧光基团不断积累。因此,Taqman探针检测的是探针检测的是积累荧光。积累荧光。Cleavage-based assay:TaqManTM5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQ535353R
36、QExtension Step531.Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52.Cleavage3.PolymerizationComplete53QTaqR354.Detection533QTaqR5lRCleavage-based assay:TaqManTMCycle 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段荧光背景信号阶段,荧光信号荧光信号指数扩增阶段和平台期指数扩增阶段和平台期。在。在荧光背景信号阶段荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，扩增的荧光信号被荧光背景信号
37、所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在我们无法判断产物量的变化。而在平台期平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR 的终的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量为了定
38、量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和荧光阈值和 CT 值。值。荧光阈值荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信个循环的荧光信号的标准偏差的号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为为 CT 值值。Ct
39、value and Real-Time Quantitative PCR TheoryCtCt值值值值(Threshold Cycle)(Threshold Cycle)PCR扩增过程中，扩增过程中，扩增产物荧光信号超扩增产物荧光信号超过基线值（进入指数过基线值（进入指数增长期）时的循环数。增长期）时的循环数。principle of quantitative real-time PCR use when rather than how muchfluorescent signalPCR cyclesLow (high copy no.)High CT(low copy no.)real-ti
40、me PCR amplification plots(7 x 10-fold dilns.+NTC)End point(not quantitative)threshold ofdetectionCTThreshold Cycle,CT Correlates strongly with the starting copy number Is linear with the log of starting copy numberThe least?The least?Which one Which one has the has the most?most?TaqMan系统的一个例子系统的一个例
41、子10ng0.001ngTitrate a template;10,1,0.1,0.01,0.001 ng 模板起始浓度越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系Ct值与模板起始浓度的关系值与模板起始浓度的关系 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达利用定量利用定量PCR进行进行SNP定型定型杂合子杂合子野生性纯合子野生性纯合子突变纯合子突变纯合子Taqman的优缺点的优缺点 单一荧光系统中单一荧光系统中不能在同一管中进行多片断扩增不能在同一管中进行多片断扩增 不同的基因必须在不同的试管中不同的基因必须在不同的试管中管之间
42、的精确度跟多荧光系统同等的精确和管之间的精确度跟多荧光系统同等的精确和 可靠可靠灵敏度高，定量方便灵敏度高，定量方便费用高费用高多种荧光提供仪器价格比较贵多种荧光提供仪器价格比较贵定量定量PCR相关的近年来相关的近年来国际学术刊物上发表的论文数国际学术刊物上发表的论文数1996199719981999200020032003年已年已年已年已经达到经达到经达到经达到30003000篇篇篇篇PCR的应用领域生物学领域几乎无处不用生物学领域几乎无处不用基因、基因、DNA片段的克隆片段的克隆人工基因构建人工基因构建DNA序列测定序列测定基因定点突变基因定点突变基因型（突变）检测，基因型（突变）检测，S
43、NP分析，遗传背景分析分析，遗传背景分析生物物种鉴定，系统进化研究生物物种鉴定，系统进化研究基因表达量研究基因表达量研究（real-time PCR）/基因表达谱研究基因表达谱研究（DNA chip,SAGE）医学领域医学领域疾病基因检测疾病基因检测/遗传病的产前诊断遗传病的产前诊断致病病原体的检测致病病原体的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测肿瘤治疗中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测会推广到大部分疾病治疗前的检测 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证法医物证 其他其他:动、植物检疫动、植物检疫（转基因动植物检测）（转基因动植物检测）（转基因动植物检测）（转基因动植物检测）