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1、一、一、PCR引物设计原则引物设计原则 v原理原理1、引物是否必须是从基因片段起始端开始？、引物是否必须是从基因片段起始端开始？vPCR引物设计的目的是为了找到一对合适的引物设计的目的是为了找到一对合适的核酸片段，使其能有效地扩增目的核酸片段，使其能有效地扩增目的DNA序列序列十条PCR引物的设计原则总述v 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。v 产物不能形成二级结构。（产物不能形成二级结构。（如何避免）如何避免）v 引物长度一般在引物长度一般在1530碱基之间。（碱基之间。（太长和太短？）太长和太短？）v G+C含量在含量在40%60%之间。之
2、间。v 碱基要随机分布。碱基要随机分布。v 引物引物自身自身不能有连续不能有连续4个碱基的互补个碱基的互补。（引物二聚合体）。（引物二聚合体）v 引物引物之间之间不能有连续不能有连续4个碱基的互补。个碱基的互补。v 引物引物5端可以端可以修饰修饰。v 引物引物3端不可修饰。端不可修饰。v 引物引物3端要避开密码子的第端要避开密码子的第3位位。v1.引物的特异性引物的特异性v 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有或有连续连续8个互补碱基同源。个互补碱基同源。v有时由于模板的复杂性而无法判断，但尽量避免和有时由于模板的复杂性而无法判断，但尽量避免和基因
3、内部有过高的同源性基因内部有过高的同源性v哪些哪些DNA片段可作为模板？片段可作为模板？GFP在质粒上，和在质粒上，和GFP在基因组上？哪个作为模板，更容易得到专一的在基因组上？哪个作为模板，更容易得到专一的GFP片段？片段？v2.避开产物的二级结构区避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开避开二级结构区域二级结构区域。用有关计算机软件可以。用有关计算机软件可以预测估计预测估计mRNA的稳定二级结构的稳定二级结构，有助于选，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能择模
4、板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能时，扩增往往不能成功成功。v3.长度长度v 寡核苷酸引物长度为寡核苷酸引物长度为1530bp，一般为，一般为2027mer。引物的有效长度：。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），），Ln值不能大于值不能大于38，因为，因为38时，最适延伸温度会超过时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（聚合酶的最适温度（74),不能保证产物不能保证产物的特异性。的特异性。v4.G+C含量含量v G+C含量一般为含量一般为40%60%。v其其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条值是寡核苷酸的解链温度
5、，即在一定盐浓度条件下，件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，寡核苷酸双链解链的温度，v有效启动温度，一般高于有效启动温度，一般高于Tm值值510。若按公式。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的）估计引物的Tm值，则有效值，则有效引物的引物的Tm为为5580，其，其Tm值最好接近值最好接近72以使复以使复性条件最佳性条件最佳。v vTm温度过高过低会出现问题温度过高过低会出现问题v5.碱基础随机分布碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其尤其3端不应超端不应超过过3个连续的个连续
6、的G或或C，因这样会使引物在，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。富集序列区错误引发。v6.引物自身引物自身v 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引复性结合。若用人工判断，引物自身连续互物自身连续互补碱基不能大于补碱基不能大于3bp。v7.引物之间引物之间 两引物之间不应不互补性，尤应避免两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物互补重
7、叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于间不应多于4个连续碱基的同源性个连续碱基的同源性或互补性。或互补性。v8.引物的引物的3端端 引物的延伸是从引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何端开始的，不能进行任何修饰。修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能，端也不能有形成任何二级结构可能，引物引物3端不能发生错配。端不能发生错配。v9.引物的引物的5端端 引物的引物的5端限定着端限定着PCR产物的长度产物的长度，它对扩，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。影响扩增的特异性。v引物引物5端修饰包括：端修饰包括：加酶切位点加酶切位点；标
8、记生物；标记生物素、荧光、地高辛、素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结等；引入蛋白质结合合DNA序列；序列；引入突变位点、插入与缺失突引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。变序列和引入一启动子序列等。v一般引物要引入酶切位点一般引物要引入酶切位点v一般还需要引入保护碱基一般还需要引入保护碱基 v10.密码子的简并密码子的简并v 如扩增编码区域，引物如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的端不要终止于密码子的第第3位，因密码子的第位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。特异性与效率。v引物设计还要结合克隆载体的酶切位点引物设计还要结
9、合克隆载体的酶切位点v阅读框架阅读框架(尤其是要表达时，参考表达载体尤其是要表达时，参考表达载体)v引物上是不是一定要设计加上酶切位点，如果没有引物上是不是一定要设计加上酶切位点，如果没有酶切位点，如何连接到载体上去？酶切位点，如何连接到载体上去？二、引物设计实例vPREMIER5设计引物v题目：设计PCR引物将Tspo基因扩增后，能用双酶切连接到pET28a（+）载体上，并要求Tspo基因能完整的表达Tspo基因序列atgac tcaatcaaat aataccggaa tactggaaaa gtttgtcaat acagtaatgg gggtaaaaac agaaaatcaa caacag
10、cctt caaatacatt aatcgctactacgcaagcac tggatatcag agcagtttta gtttacaaac tagggactat cttacaaatagcagctatga tgctggcttt actgggaatg gaaaaattag taatgctgat tgataaaaattctcacctgc ccagttggtt tagcacttta ttagctgtat tatttttcgc tttattaagtattcgttcgc gaattttttc actcttagat aacacccgtt ctcgtaagac ctatgaccaggtaatcagac caa
11、gatgggc acctccacct ttagtatttc ctatagtttg gatgattattgcagttttgc gggtaatttc ttccgtatta atttggcagc aaatgcatca ccaatttttagcactgcctt taattttatt tgtggtgcat ttggctttag gagatacttg gaatacgatttttactgtag aacggagatt aggtgcggct gttcctgtgg ttattttagg cccttggttatctgctctag tagtgacggc aatttattgg caaactaatc ctgtagcggg
12、 aatgattttttcgttttctt gtatctggct aactgtggct gctgtattag tatttagaat ttggcaattaaatggttcag agccattgta tcctttaaaa ctcacaccag tggaaaaata a 确定：上游引物BamHI，GGATCC下游引物 Hind I，AAGCTT v1、先查找序列有哪些酶切位点，确定使用哪、先查找序列有哪些酶切位点，确定使用哪几个酶切位点，几个酶切位点，酶切位点和阅读框架方向？酶切位点和阅读框架方向？v2、注意克隆的基因阅读框架和载体的阅读框、注意克隆的基因阅读框架和载体的阅读框架保持一致，架保持一致
13、，如果是用如果是用pET28b（+），），该怎该怎样调整引物。样调整引物。v3、确定引物碱基的个数，、确定引物碱基的个数，3-4个保护碱基，个保护碱基，6个碱基的酶切位点，个碱基的酶切位点，15个碱基序列配对，个碱基序列配对，一共一共25个左右。个左右。v先调整先调整 premer5 的的flie 的的 preferences 的的默认碱基长度默认碱基长度 v4、要设计两条链的引物，、要设计两条链的引物，Sense链和链和Anti-Sense链，注意上下游引物：链，注意上下游引物：Sense链是上游链是上游引物，引物，Anti-Sense链是下游引物（链是下游引物（如何判断如何判断）v5、序列
14、前后可以加一下、序列前后可以加一下NNNNNN来满足引物来满足引物长度的需要，特别是酶切位点和保护碱基长度的需要，特别是酶切位点和保护碱基v Why？v6.选择选择S链来编辑引物，将酶切位点碱基设计链来编辑引物，将酶切位点碱基设计上去，同时根据需要设置保护碱基，同时注意上去，同时根据需要设置保护碱基，同时注意平衡平衡GC含量含量v7.查看查看Hairpin、Dimer、FalsePriming、CrossDimer、GC含量等处，调整和编辑引物含量等处，调整和编辑引物v8.选择选择A链来编辑引物，则先将浮框拉至最右链来编辑引物，则先将浮框拉至最右边，再进行编辑引物边，再进行编辑引物v9.查看查看Hairpin、Dimer、FalsePriming、CrossDimer、GC含量等处，反复调整和编含量等处，反复调整和编辑引物，直至获得满意的结果辑引物，直至获得满意的结果v以上是模板较单一的基因引物设计方法以上是模板较单一的基因引物设计方法v如果是从基因组上克隆单个基因，则最好能知道基因上下游序列，如克隆Fremyella diplosiphon CpeB 上的基因，可以使用引物搜索功能，提高引物设计的准确性